海州香薷不同種群細胞壁轉化酶蛋白結構與分子模擬對接

蔡深文++徐仲瑞++熊治廷

摘要：為研究銅脅迫下海州香薷（Elsholtzia haichowensis Sun）非礦區種群細胞壁轉化酶（EhNcwINV）和礦區種群細胞壁轉化酶（EhCcwINV）活性差異的機理，運用在線分析工具對細胞壁轉化酶基因推導的氨基酸序列進行分析，利用SWISS-MODEL進行同源建模，并將細胞壁轉化酶與蔗糖分子進行模擬對接。結果表明，海州香薷兩個種群細胞壁轉化酶蛋白質在443位點和538位點處存在氨基酸趨異位點，模擬的3D結構非常相似，僅在趨異位點Leu433/Pro433和Tyr538/His538處有差別。EhNcwINV、EhCcwINV和模擬突變體（EhNcwINV-L433P和EhNcwINV-Y538H）與蔗糖分子對接形成的催化活性中心構象基本一致，但在空間位置上存在細微差異，氨基酸趨異可能是造成兩個種群細胞壁轉化酶活性差異的原因之一。

關鍵詞：海州香薷（Elsholtzia haichowensis Sun）；細胞壁轉化酶；同源建模；分子對接

中圖分類號：Q51；Q942.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）01-0166-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.042

Protein Structure and Molecular Modeling Docking of Cell Wall Invertase from

Different Populations in Elsholtzia haichowensis Sun

CAI Shen-wen1，XU Zhong-rui2，XIONG Zhi-ting2

（1.School of Resource and Environment，Zunyi Normal College，Zunyi 563002，Guizhou，China；

2.School of Resource and Environmental Sciences，Wuhan University，Wuhan 430079，China）

Abstract： It was to study the mechanism of enzyme activity difference of cell wall invertase from different populations，one from non-mine population（EhNcwINV），the other from mine population（EhCcwINV） in Elsholtzia haichowensis Sun under copper stress. The amino acid sequences of cell wall invertase were analyzed by ExPASy（http：//au.expasy.org/tools/）. The three-dimensional structure was constructed by homologous modeling. The structures of cell wall invertase from two populations of E. haichowensis Sun and non-mine population with each single point mutation in complex with sucrose were simulated. The results showed that there were two divergent amino acids at position 443 and 538 between EhNcwINV and EhCcwINV. The three-dimensional structures were exactly similar between EhNcwINV and EhCcwINV. It showed difference at Leu433/Pro433 and Tyr538/His538，which were divergent sites. The structures of catalytic active center of EhNcwINV，EhCcwINV，and simulated mutants（EhNcwINV-L433P，EhNcwINV-Y538H） binding with sucrose showed no significant differences. However，there were differences on spatial position. It might be one of the reasons for the difference of cell wall invertase activity between two populations.

Key words： Elsholtzia haichowensis Sun；cell wall invertase；homologous modeling；molecular docking

在重金屬污染的土壤中，植物生長受重金屬的脅迫，為了維持重金屬抗性機制，植物必須獲得足夠的由糖提供的碳源和能量。對于大多數高等植物，糖在源器官葉中合成，以蔗糖的形式轉運至庫器官根中，用于維持異養代謝和生長[1]。然而，蔗糖不能夠被植物直接用于新陳代謝，必須通過蔗糖合酶或轉化酶水解為己糖才能被利用。細胞壁轉化酶（Cell wall invertase，cwINV）在水解蔗糖的過程中起著至關重要的作用，且在調節韌皮部糖代謝、控制儲藏器官內糖的組成、參與植物應對逆境脅迫以及植物早期生長發育調控等方面均具有重要的作用[2]。細胞壁轉化酶為酸性轉化酶，其最適pH為4.5～5.5，也叫β-呋喃果糖苷酶[3]，為不溶性轉化酶，通過離子作用結合在細胞壁上，等電點為堿性。在靠近成熟蛋白質的N-末端含有一個β-呋喃果糖苷酶的特征序列（NDPNG/A），在其半胱氨酸催化域具有特征序列WECPD，這兩個特征序列高度保守[3，4]。

海州香薷（Elsholtzia haichowensis Sun）是一年生草本植物，屬唇形科，廣泛分布于長江中下游銅礦區和銅污染的土壤中，是一種銅礦指示植物，俗稱“銅草”[5，6]。海州香薷在非銅礦區也有發現[7]。銅礦區的海州香薷由于長期生活在高濃度銅污染的環境脅迫條件下可能已經發生了與Cu污染相適應的抗性進化，形成了與非礦區種群不同的抗性生態型[8]。通常來自礦區種群的海州香薷對Cu具有很高的吸收富積能力和耐受能力[9]。海州香薷作為一種研究銅抗性的模式植物，其基因信息公布的還較少，前期研究表明海州香薷兩個種群的細胞壁轉化酶活性在銅脅迫下存在差異[10]，而酶活性通常與基因及其表達調控過程相關，因此獲得海州香薷細胞壁轉化酶基因編碼的蛋白質信息，對于進一步深入研究銅脅迫下兩個種群酶活性差異的分子機理具有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料

海州香薷非礦區種群細胞壁轉化酶基因（EhNcwINV）和礦區種群細胞壁轉化酶基因（EhCcwINV）序列為本實驗室前期克隆所得，GenBank登錄號分別為JX500753和JX500754。

1.2 蛋白結構分析

使用在線ExPASy序列分析工具（http：//au.expasy.org/tools/）對推導的氨基酸序列進行分析，采用ProtParam分析蛋白的氨基酸序列組成、相對分子質量、等電點等理化性質，采用ProtScale分析蛋白質的疏水性。將海州香薷兩個種群細胞壁轉化酶和液泡轉化酶的氨基酸序列提交至在線分析工具SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）進行同源建模，選擇擬南芥（Arabidopsis thaliana）細胞壁轉化酶基因AtcwINV1的3D蛋白質結構（PDB：2AC1，www.pdb.org）為模板，預測海州香薷細胞壁轉化酶蛋白質的三級結構。

1.3 分子對接

海州香薷細胞壁轉化酶蛋白質與蔗糖分子的對接采用自動對接軟件AutoDock4.0完成。蔗糖分子結構來自于MMsINC數據庫（http：//mms.dsfarm.unipd.it/MMsINC/）。選擇細胞壁轉化酶活性中心的GLU227設置為柔性殘基。蛋白質分子和蔗糖分子在對接過程中同時被賦予Geister Huckel電荷，Grid大小設置為26×28×28（x，y，z），格點間隔為默認值0.375 ？魡，Grid中心坐標設置為74.158、112.502、-4.938（x，y，z）。Number of GA Runs設置為30，其他參數均使用系統默認參數。對接過程使用拉馬克遺傳算法（Lamarckian Genetic Algorithm，LGA）對結合位點進行搜索和能量評價，選擇結合自由能最低的構象為最終的結合模式。同源模擬生成的PDB文件以及分子對接結果均使用PyMOL軟件顯示和分析。

2 結果與分析

2.1 海州香薷兩個種群細胞壁轉化酶蛋白質的基本特征

海州香薷細胞壁轉化酶基因編碼蛋白質的氨基酸序列為完整的開放閱讀框，由556個氨基酸殘基組成，兩個種群海州香薷細胞壁轉化酶蛋白質的氨基酸組成基本一致，丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）和絲氨酸（Ser）含量較高，均高于6%，無吡咯賴氨酸（Pyl）和含硒半胱氨酸（Sec）（圖1）。兩個種群間共有2個氨基酸趨異位點，其中非礦區細胞壁轉化酶在443位和538位分別為亮氨酸和酪氨酸，而礦區細胞壁轉化酶在這兩個位點分別為脯氨酸和組氨酸。非礦區細胞壁轉化酶蛋白質原子總數為8 781個，分子式為C2 823H4 365N765O813S15，分子質量為62 510.2 D，理論等電點為9.29。礦區細胞壁轉化酶蛋白質原子總數為8 775個，分子式C2 819H4 359N767O812S15，分子質量為62 468.1 D，理論等電點為9.30。親水/疏水性分析結果表明，兩個種群細胞壁轉化酶蛋白質的疏水性在趨異位點443和538處存在差異，非礦區種群的細胞壁轉化酶蛋白質在該區域具有較強的疏水性（圖2）。

2.2 海州香薷不同種群細胞壁轉化酶蛋白質的3D結構

非礦區和礦區種群海州香薷細胞壁轉化酶蛋白質的3D結構非常相似，僅在趨異位點Leu433/Pro433和Tyr538/His538處有細微的差別，如圖3所示。二者均由N-末端類似螺旋槳形狀的β-轉角結構域和C-末端的β-折疊區組成，這兩個結構域由兩個較短的α螺旋連接。其中N-末端的結構域由5個β轉角組成，主要負責與底物蔗糖結合，是酶的催化中心，C-末端的結構域由2組反向平行的β折疊組成。

2.3 海州香薷細胞壁轉化酶蛋白模擬突變與分子對接

為了研究海州香薷不同種群細胞壁轉化酶活性的差異，從細胞壁轉化酶蛋白質與底物結合的角度進行計算機模擬分析，以非礦區種群的細胞壁轉化酶為基礎，在兩個種群間的趨異位點處進行模擬定點突變，獲得突變體酶蛋白質分子EhNcwINV-L433P和EhNcwINV-Y538H，并與蔗糖分子進行對接。首先使用擬南芥細胞壁轉化酶蛋白質AtcwINV1（PDB ID：2AC1）[11]、突變體AtcwINV1-E203Q（PDB ID：2OXB）、AtcwINV1-E203A（PDB ID：2QQV）和AtcwINV1-D239A（PDB ID：2QQU）[12]的晶體結構模型檢測海州香薷細胞壁轉化酶蛋白質與蔗糖的對接程序，確保對接結果的可靠性。

海州香薷細胞壁轉化酶與蔗糖分子的對接模擬結果顯示，蔗糖分子在EhNcwINV、EhCcwINV、EhNcwINV-L433P和EhNcwINV-Y538H催化活性中心的構象基本一致（圖4），呋喃果糖環上的氧原子O6分別與N46上的氮原子ND2、Q63上的氧原子OE1和W71上的氮原子NE1，O4分別與S107上的N和D173上的OD1，O3分別與D173上的OD2、R172上的NE和E227上的OE2，O2與N46上的ND2，O1與D47上的OD1之間形成氫鍵相互作用。吡喃葡萄糖環上的O2與E227上的OE2，O3與N260上ND2之間也形成了氫鍵相互作用，使蔗糖分子穩定地結合在細胞壁轉化酶的催化活性中心。盡管蔗糖分子與EhNcwINV、EhCcwINV、EhNcwINV-L433P和EhNcwINV-Y538H之間對接的構象基本一致，但在空間位置上存在細微差異，計算機模擬對接的結合能分別為-35.42、-35.34、 -35.17和-35.42 kJ/mol（表1）。

3 討論

本研究在前期擴增獲得的海州香薷兩個種群細胞壁轉化酶基因全長cDNA序列（EhNcwINV和EhCcwINV）的基礎上，推測得到的氨基酸序列屬于GH32糖苷水解酶家族，該家族成員的成熟蛋白質有40%～60%的同源性[13]，具有多個植物細胞壁轉化酶基因的保守序列，包括兩個最為保守的特征基序β-呋喃果糖苷酶（NDPN）和催化區域的重要組成部分（WECP/VD）。推測的蛋白分子質量及等電點與其他物種已報道的細胞壁轉化酶蛋白質都相似[3，14，15]，且與其他物種的細胞壁轉化酶氨基酸序列具有較高的同源相似性。幾乎所有高等植物的細胞壁轉化酶在催化區域的保守位點上都有一個脯氨酸（P）[16]，海州香薷細胞壁轉化酶也相同。植物細胞壁轉化酶和果糖基轉移酶的同源性較高，具有相同的保守區域，如蔗糖結合基序、RDP基序和EC基序[17]，海州香薷細胞壁轉化酶也具有這些特征序列。

海州香薷非礦區細胞壁轉化酶（EhNcwINV）與礦區細胞壁轉化酶（EhCcwINV）的氨基酸序列存在兩個趨異位點，這可能是由于兩個種群長期生活在不同的環境中，礦區種群在銅脅迫下發生適應性進化的結果，從而使礦區種群具有較高的轉化酶活性，獲得更多的能量來源，用以維持銅抗性機制。氨基酸序列的改變可能會導致蛋白質活性的改變，Fridman等[18]研究證實番茄細胞壁轉化酶催化活性中心附近的一個氨基酸Glu突變為Asp后，其酶活性升高了3倍。NDPN基序和EC基序在轉化酶中高度保守，如果將Asp23替換為Asn23，或者將Glu203替換為Ala203，轉化酶將失去活性[19]，擬南芥細胞壁轉化酶晶體結構X射線衍射分析顯示這兩個氨基酸殘基與RDP基序中的Asp149都位于轉化酶的活性位點[11]。海州香薷細胞壁轉化酶EhNcwINV和EhCcwINV對應的NDPN、RDP和EC基序中3個保守的同源氨基酸分別為Asp47、Asp173和Glu227。最近，通過對擬南芥突變體的研究表明，除高度保守的NDPN、RDP和EC基序外，其附近的氨基酸殘基Trp82、Asp239和Lys242對于底物分子結合的穩定性也具有重要意義，這些位點的突變將改變轉化酶水解蔗糖的活性參數，如Km和Kcat值[12，20，21]。Asp239突變為Asn239后與野生型AtcwINV1的活性無差別，但突變為Ala239后將使AtcwINV1失去轉化酶活性，表現出果聚糖水解酶（1-FEH）活性[20]。AtcwINV1的Trp82、Asp239和Lys242同源氨基酸在海州香薷EhNcwINV和EhCcwINV中分別為Trp106、Asn260和Phe263。顯然，海州香薷兩個種群細胞壁轉化酶的趨異氨基酸位點都不在上述活性位點及其附近。

EhNcwINV和EhCcwINV的2個趨異位點都位于C末端，盡管不在活性中心及其附近，但Leu433/Pro433緊鄰酸性轉化酶保守區域FGL（430～432），Tyr538/His538靠近保守區域FNNG（533～536）。這些氨基酸殘基結構的差異可能會導致其臨近區域的蛋白質構象發生細微改變，而這種細微改變可能會影響整個蛋白質的穩定性或活性。在玉米細胞壁轉化酶INCW2中，C末端的一個胞嘧啶突變為胸腺嘧啶導致Pro變為Leu，盡管這個突變位點不在催化活性中心（WECPD），不在糖基化位點，也不在β-呋喃果糖基序（NDPNG）中，但突變使INCW2的蛋白質活性在Incw2轉錄正常的情況下僅為正常值的6%，這可能是由于該位點的Pro被替換后降低了整個蛋白質的穩定性[22]。雖然計算機模擬結果表明海州香薷不同種群細胞壁轉化酶趨異位點處的疏水性存在差異，但3D結構模擬表明并未造成蛋白質構象的顯著差異。分子對接結果表明EhNcwINV和EhCcwINV與蔗糖分子的結合構象基本一致，且EhNcwINV和EhCcwINV與蔗糖分子對接的結合能差異較小，可能是由于趨異的氨基酸位點在C末端，遠離活性中心，對活性中心的構象沒有產生影響。雖然海州香薷不同種群間的細胞壁轉化酶與蔗糖分子結合的構象差異不顯著，但蔗糖分子與細胞壁轉化酶蛋白質催化活性中心氨基酸之間的空間距離具有細微差異。雖然模擬定點突變結果也顯示突變位點差異對結合的整體構象不產生顯著影響，但蔗糖分子與酶催化中心之間的空間距離發生細微變化，這種細微差別可能是由于趨異氨基酸的結構差異導致其附近的氨基酸殘基的構象發生改變，盡管這種改變很小，但也可能會傳遞至活性中心的氨基酸，從而使活性中心底物結合的口袋構象產生差異。但是這種構象上的細微差異是否會導致不同種群間細胞壁轉化酶的活性或蛋白質穩定性表現出顯著差異還需進一步進行驗證。

參考文獻：

[1] ROLLAND F，BAENA-GONZALEZ E，SHEEN J.Sugar sensing and signaling in plants： Conserved and novel mechanisms[J].Annual Review of Plant Biology，2006，58：675-709.

[2] LI Z，PALMER W M，MARTIN A P，et al. High invertase activity in tomato reproductive organs correlates with enhanced sucrose import into， and heat tolerance of young fruit[J].Journal of Experimental Botany，2011，63（3）：1155-1166.

[3] STURM A. Invertases： Primary structures，functions， and roles in plant development and sucrose partitioning[J].Plant Physiology，1999，121（1）：1-8.

[4] RUAN Y L，JIN Y，YANG Y J，et al. Sugar input，metabolism，and signaling mediated by invertase： Roles in development，yield potential，and response to drought and heat[J].Molecular Plant，2010，3（6）：942-955.

[5] 柯文山，席紅安， 楊 毅，等.大冶銅綠山礦區海州香薷（Elsholtzia haichowensis）植物地球化學特征分析[J].生態學報，2001，21（6）：907-912.

[6] 謝學錦，徐邦梁.銅礦指示植物——海州香薷[J].地質學報，1952，32（4）：360-368.

[7] LIU J，XIONG Z T.Differences in accumulation and physiological response to copper stress in three populations of Elsholtzia haichowensis S.[J].Water Air and Soil Pollution，2005，168（1）：5-16.

[8] 熊治廷.植物抗污染進化及其遺傳生態學代價[J].生態學雜志， 1997，16（1）：53-57.

[9] YANG M J，YANG X E，R？魻MHELD V.Growth and nutrient composition of Elsholtzia splendens Nakai under copper toxicity [J].Journal of Plant Nutrition，2002，25（7）：1359-1375.

[10] CAI S W，XIONG Z T，LI L，et al. Differential responses of root growth，acid invertase activity and transcript level to copper stress in two contrasting populations of Elsholtzia haichowensis[J].Ecotoxicology，2014，23（1）：76-91.

[11] VERHAEST M，LAMMENS W，LE ROY K，et al.X-ray diffraction structure of a cell-wall invertase from Arabidopsis thaliana[J].Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography，2006，62（12）：1555-1563.

[12] LAMMENS W，LE ROY K，VAN LAERE A，et al. Crystal structures of Arabidopsis thaliana cell-wall invertase mutants in complex with sucrose[J].Journal of Molecular Biology，2008， 377（2）：378-385.

[13] DAVIES G，HENRISSAT B.Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases[J].Structure，1995，3（9）：853-859.

[14] HUANG W X，CAO Y，HUANG L J，et al. Differential expression of acid invertase genes in roots of metallicolous and non-metallicolous populations of Rumex japonicus under copper stress[J].Chemosphere，2011，84（10）：1432-1439.

[15] DRAIE R，P？魪RON T，POUVREAU J，et al. Invertases involved in the development of the parasitic plant Phelipanche ramosa：Characterization of the dominant soluble acid isoform，PrSAI1 [J].Molecular Plant Pathology，2011，12（7）：638-652.

[16] TYMOWSKA-LALANNE Z， KREIS M. The plant invertases： Physiology， biochemistry and molecular biology[J]. Advances in Botanical Research，1998，28：71-117.

[17] RITSEMA T，SMEEKENS S C M.Engineering fructan metabolism in plants[J].Journal of Plant Physiology，2003，160（7）：811-820.

[18] FRIDMAN E，CARRARI F，LIU Y，et al. Zooming in on a quantitative trait for tomato yield using interspecific introgressions[J].Science，2004，305（5691）：1786-1789.

[19] GOETZ M，ROITSCH T. Identification of amino acids essential for enzymatic activity of plant invertases[J].Journal of Plant Physiology，2000，157（5）：581-585.

[20] LE ROY K，LAMMENS W，VERHAEST M，et al.Unraveling the difference between invertases and fructan exohydrolases： A single mmino acid（Asp-239） substitution transforms Arabidopsis cell wall invertase1 into a fructan 1-exohydrolase[J].Plant Physiology，2007，145（3）：616-625.

[21] M？魣TRAI J，LAMMENS W，JONCKHEER A，et al. An alternate sucrose binding mode in the E203Q Arabidopsis invertase mutant：An X-ray crystallography and docking study[J].Proteins：Structure，Function，and Bioinformatics，2008，71（2）：552-564.

[22] CARLSON S J，SHANKER S，CHOUREY P S.A point mutation at the Miniature 1 seed locus reduces levels of the encoded protein，but not its mRNA，in maize[J].Molecular and General Genetics，2000，263（2）：367-373.