酶解鳙魚蛋白制備活性肽的研究

周燕芳++鄭榮彬

摘要：以鳙魚（Aristichthysnobilis）魚肉蛋白為原料，采用木瓜蛋白酶對鳙魚蛋白進行酶解，制備具有抗氧化活性的可溶性肽。研究酶濃度、底物濃度、溫度、時間、pH對水解度和DPPH·自由基清除率的影響。通過正交試驗設計對酶解工藝進行優化。結果表明，酶解的最佳條件是酶濃度1 400 U/g，底物濃度3.0%，溫度60 ℃，酶解2 h，pH 7.0，在此條件下，所得可溶性肽的活性最高，對DPPH·自由基的清除率為69.09%，對羥自由基的清除率為75.22%，對O2-·自由基的清除率為61.92%。

關鍵詞：鳙魚（Aristichthysnobilis）蛋白；木瓜蛋白酶；控制酶解；自由基；清除率

中圖分類號：TS254.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）01-0115-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.029

Study on Preparation of Active Peptide with Bighead Carp Protein by Enzymolysis

ZHOU Yan-fang，ZHEN Rong-bin

（School of Chemical and Environmental Engineering，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，Guangdong，China）

Abstract：Using bighead carp（Aristichthysnobilis） protein as materials，the preparation of active peptide from bighead carp protein by enzymatic hydrolysis with papain was studied. The effects of enzyme concentration， substrate concentration，temperature，time and pH value on the degree of hydrolysis and removal of DPPH-free radical were studied. By orthogonal design， the results showed that when the enzyme concentration was 1 400 U/g， and the substrate concentration was 3.0%， temperature was 60 ℃， enzymatic hydrolysis time was 2 h， pH was 7. The scavenging rate of DPPH· free radical reached 69.09%，the removal rate of ·OH and O2-· reached 75.22% and 61.92%.

Key words：bighead carp（Aristichthysnobilis） protein；papaya；controlled-enzymatic hydrolysis；free radicals；antioxidant ability

鳙魚（Aristichthysnobilis）又叫花鰱、胖頭魚、包頭魚等。鳙魚的生長速度比鰱魚快，是較宜養殖的優良魚種之一，為中國主要的淡水養殖魚之一。由于傳統消費習慣的原因，人們對鳙魚頭有特別的嗜好，造成魚身和魚尾部分價格大跌，再加上鳙魚具有土腥味，造成大量魚肉低價售賣，甚至作為飼料，造成極大的浪費。

關于鳙魚研究，國內目前主要集中在鳙魚的養殖、魚病防治等方面，對其深加工研究較少，且涉及加工的主要集中在傳統加工產品如冷凍魚、煙熏魚、魚干等，如熊光權等[1]進行了以鳙鰱魚為原料制備魚肉香腸的研究，青島海洋大學通過研究發現鳙魚屬于凝膠形成困難、凝膠劣化容易的魚種，不適宜加工為魚糜制品[2]，必須尋求新的途徑來提高其附加值。水產保健食品作為一種有較長生命力的產品，不僅產品附加值高，而且原料不受冰凍影響，生產不受季節限制。目前，市場上已出現一些利用牡蠣、螺旋藻、魚子、魚油等生產的保健食品，而水產活性肽制品則相對較少，且主要集中在海洋生物肽產品方面[3]，鮮見以鳙魚為原料開發保健食品的研究。通過控制酶解，魚肉中呈惰性的生物活性肽被釋放出來，表現出抗氧化、促進鈣質吸收、增強機體免疫力、促進肉芽增生從而加速傷口愈合等生理功效[4]。因此，結合中國的具體情況，選擇蛋白質含量高，但利用率不高或生物價不高的廉價魚作為原料，通過酶解等生物手段，制備活性肽，為鳙魚的深加工提供一條新途徑，增加經濟效益。本研究以鳙魚魚肉蛋白為原料，采用木瓜蛋白酶對鳙魚蛋白進行酶解，制備具有抗氧化活性的可溶性肽，以期為鳙魚的深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳙魚購買于廣東省潮州市南橋市場；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·自由基）購于Sigma公司；木瓜蛋白酶（BR，酶活力5萬U/g）購于江西銳陽生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

KW1000DC型電熱恒溫水浴鍋（上海恒平科學儀器有限公司）；AUY220型分析天平（日本島津公司）；KDN-103F型定氮儀（上海纖檢儀器有限公司）；101-2AB型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；PHS-3C型精密級數字式酸度計（上海手術器械廠）；TU-1901型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.3 方法

1.3.1 指標測定 蛋白質的測定采用微量凱氏定氮法[5]；游離氨基酸的測定采用雙指示劑甲醛滴定法[6]；總氮量的測定采用微量凱氏定氮法[5]；水解度的計算：水解度=（水解產生游離氨基酸態氮量/原料總氮含量）×100%[7]，其中水解產生游離氨基態氮量=水解后酶解液中的游離氨基氮-原料中的游離氨基氮。

多肽活性的測定：DPPH·自由基清除率的測定參考文獻[8]，·OH自由基清除效果的測定參考文獻[9]，O2-·自由基清除效果的測定參考文獻[10]。

1.3.2 鳙魚魚肉蛋白酶解工藝 將鳙魚去鱗、去魚皮，魚肉蒸熟，去魚骨，在電熱鼓風機干燥，粉碎，脫脂得到鳙魚蛋白粉，下稱“魚粉”。稱取適量鳙魚蛋白粉，加入一定比例的去離子水，勻漿后調整pH，加入一定量的木瓜蛋白酶于反應溶液中，攪拌均勻，置于恒溫水浴鍋中進行酶解。反應至預定時間后，將其迅速水浴加熱10 min使酶失活，進行抽濾，得到濾液，進行相關測定。

1.3.3 單因素試驗對鳙魚蛋白制備活性肽的影響 分別對酶濃度、底物濃度、溫度、時間、pH等因素進行研究，考察各因素對水解度及DPPH·自由基的清除率的影響。

1）酶濃度的影響。準確稱取一定量魚粉，加入一定量去離子水，配制成濃度為2.0%的魚糜液，在溫度為60 ℃，pH為7的條件下，酶解時間4 h，酶濃度是1 000、1 200、1 400、1 600、1 800、2 000 U/g。

2）底物濃度的影響。準確稱取一系列不同質量的魚粉，分別加入一定量去離子水，配制成底物濃度為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的魚糜液，在60 ℃下，溫度為60 ℃，pH為7的條件下，酶解時間4 h，酶濃度是1 800 U/g進行酶解。

3）時間的影響。分別準確稱取一定量魚粉，加入一定量的去離子水，配制成底物濃度為3.0%的魚糜液，在60 ℃下，酶濃度是1 800 U/g，溫度為60 ℃，pH為7的條件下，酶解時間分別為1、2、3、4、5、6 h進行酶解。

4）溫度的影響。分別準確稱取一定量魚粉，加入一定量的去離子水，配制成底物濃度為3.0%的魚糜液，在酶濃度是1 800 U/g，溫度為60 ℃，pH為7的條件下，酶解時間4 h，酶解溫度分為45、50、55、60、65、70 ℃進行酶解。

5）pH的影響。分別準確稱取一定量魚粉，加入一定量的去離子水，配制成底物濃度為3.0%的魚糜液，在60 ℃下，酶濃度是1 800 U/g，溫度為60 ℃，酶解時間為4 h，酶解的pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5進行酶解。

各單因素試驗酶解后抽濾，測定水解度和對DPPH·自由基的清除率。

1.3.4 正交試驗優化鳙魚肉蛋白活性肽制備條件 綜合各單因素試驗結果，以酶濃度、底物濃度、時間、溫度、pH 5個因素進行5因素4水平正交試驗設計，試驗因素和水平見表1。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同酶濃度對鳙魚肉蛋白活性肽DPPH·自由基清除率的影響 從圖1可知，隨著酶濃度的增大，水解度和DPPH·清除率均有所增加，當酶濃度從1 000 U/g增加到1 600 U/g時，隨著酶濃度的增高，鳙魚魚肉蛋白被木瓜蛋白酶逐步水解，多肽逐漸形成，水解度和DPPH·清除率均增加，但當酶濃度高于1 600 U/g時，隨著酶濃度的增高，多肽被木瓜酶進一步水解，水解度略有增加，而DPPH·清除率也有所下降；雖然酶濃度為1 800 U/g時，水解度達到最高點，但DPPH·清除率反而有所下降，這可能是由于多肽進一步水解為氨基酸。為了得到活性較高的多肽，選擇酶濃度為1 600 U/g。

2.1.2 不同底物濃度對鳙魚肉蛋白活性肽DPPH·自由基清除率的影響 從2圖可知，底物濃度對木瓜蛋白酶水解鳙魚具有一定影響。隨著底物濃度的增加，鳙魚魚肉蛋白酶解產物的水解度隨之下降，而DPPH·清除率呈上升的趨勢。這是因為在底物濃度小于2.5%時，隨底物濃度的增多，鳙魚魚肉蛋白被木瓜蛋白酶逐步水解，多肽逐漸形成，故DPPH·清除率呈上升趨勢，雖然蛋白質分解為多肽的量有所增加，但底物濃度的增加使總氮量大量增加，遠遠大于分解為多肽的增加量，故水解度下降；當底物濃度為3.0%時，其DPPH·清除率為最高值，而當底物濃度大于3.0%時，蛋白質的分解受到酶濃度的限制，其DPPH·清除率變化較小，故為獲得活性較大的多肽，在酶解過程中底物濃度控制在3.0%左右比較合適。

2.1.3 酶解時間對鳙魚肉蛋白活性肽DPPH·自由基清除率的影響 從圖3可知，隨著酶解時間的延長，鳙魚魚肉蛋白酶解產物的DPPH·清除率和水解度緩慢增大，在1～3 h增幅明顯，在3 h后其DPPH·清除率變化不大。這可能是由于酶解時間的延長，鳙魚蛋白被逐步酶解，多肽逐漸形成，水解度上升，1～3 h可能是具有DPPH·清除活性的多肽大量生成的時間，從而表現出DPPH·清除率的明顯升高，3 h之后DPPH·清除率變化趨于平穩，因此從經濟方面考慮，酶解時間控制在3 h左右比較合適。

2.1.4 酶解溫度對鳙魚肉蛋白活性肽DPPH·自由基清除率的影響 從圖4可知，酶解溫度對酶解過程有一定的影響。隨著溫度的升高，鳙魚魚肉蛋白酶解產物的水解度和DPPH·逐漸升高，在45～60 ℃增幅明顯，在該區間，隨著溫度的升高，酶的活性增加，鳙魚蛋白被酶解生成的肽增多，水解度和DPPH·清除率均增多；溫度為60 ℃時，酶解產物對DPPH·清除率達到最高值，水解度也達到最高；溫度大于60 ℃時，隨著溫度的增加，水解度和DPPH·清除率均有所下降，可能是溫度升高使得部分酶失活，故選擇溫度為60 ℃比較合適。

2.1.5 pH對鳙魚肉蛋白活性肽DPPH·自由基清除率的影響 pH對鳙魚肉蛋白水解度和DPPH·清除率的影響見圖5。從圖5可知，隨著pH的增大，水解度和DPPH·清除率均有所增加，從水解度的曲線來看，pH為7.0時酶的活性最高；pH為6.0～7.0時，隨pH的增加，酶的活性增大，故水解度呈上升趨勢；當pH大于7.0時，隨著pH的增加，酶的活性降低，故水解度呈下降趨勢。對于DPPH清除率，隨著pH增加，酶的活性先增大后減小，在pH為7.5時，對DPPH·的清除率達到峰值。為了得到活性較大的多肽，故選擇pH為7.0。

2.2 正交試驗法優化酶解條件

以溫度、時間、底物濃度、酶濃度、pH為自變量，以DPPH·清除率為指標，進行正交試驗分析。結果如表2所示。由表2可知，影響木瓜蛋白酶酶解鳙魚蛋白制備抗氧化肽工藝的主次順序為A>C>E>D>B，即溫度>底物濃度>pH>酶濃度>時間。各因素的最優組合為A3B1C3D1E3，即酶濃度為1 400 U/g，底物濃度為3.0%，酶解時間為2 h，溫度為60 ℃，pH為7.0，對該條件下進行驗證試驗，得到的結果是DPPH·自由基清除率為69.09%，均大于正交試驗結果。鳙魚酶解的最佳條件為酶濃度1 400 U/g，底物濃度3.0%，酶解時間2 h，溫度60 ℃，pH 7.0。

2.3 最佳條件下所得活性肽的活性測定

在最佳條件下即酶濃度1 400 U/g，底物濃度3.0%，酶解時間為2 h，pH 7.0，溫度60 ℃進行酶解，得到活性多肽，其DPPH·自由基清除率為69.09%，對·OH自由基清除率為75.22%，對O2-·自由基清除率為61.92%。

3 小結

本研究以鳙魚魚肉蛋白為原材料，以水解度和抗氧化活性為指標，研究了木瓜蛋白酶制備鳙魚蛋白活性肽的最佳工藝，選用木瓜蛋白酶對鳙魚魚肉進行酶解，制備抗氧化肽，通過對酶解產物進行水解度和DPPH·清除率的測定，并以DPPH·清除率為主要指標。在酶解的單因素試驗證實溫度、時間、底物濃度、酶濃度、pH對木瓜蛋白酶水解鳙魚蛋白有明顯影響。采用正交試驗法，對各因素進行最優組合，得到木瓜蛋白酶酶解鳙魚蛋白制備抗氧化肽的最佳工藝為酶濃度1 400 U/g，底物濃度3.0%，酶解時間2 h，pH 7.0，溫度60 ℃，測得DPPH·自由基清除率為69.09%，·OH自由基清除率為75.22%，O2-·自由基清除率為61.92%。

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