熒光光譜法研究咖啡酸與胰脂肪酶相互作用

范金波,王曉露,姜海靜,周素珍

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.唐山市豐潤區綜合職業技術教育中心,河北唐山 064000)

熒光光譜法研究咖啡酸與胰脂肪酶相互作用

范金波1,王曉露1,姜海靜2,周素珍1

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.唐山市豐潤區綜合職業技術教育中心,河北唐山 064000)

采用熒光光譜法研究了咖啡酸與胰脂肪酶的相互作用,主要包括熒光猝滅特性及結合常數、結合位點數的計算,抑制酶類型及抑制活性,金屬離子對相互作用的影響。結果表明:咖啡酸加入后胰脂肪酶產生了規律性的熒光猝滅,最大吸收波長出現紅移現象,主要屬于靜態猝滅。25 ℃和37 ℃下結合常數分別為6.48×104L/mol和1.38×105L/mol,熱力學參數ΔH>0且ΔS>0,表明結合反應是自發進行的吸熱反應,相互作用主要表現為疏水作用力。咖啡酸對胰脂肪酶的抑制類型為非競爭性抑制,抑制活性IC50為(0.88±0.07)mg/mL。四種金屬離子(Cu2+、Ca2+、Fe3+、Fe2+)一定程度上增加結合常數和結合位點數,說明四種金屬離子促進了咖啡酸與胰脂肪酶的結合。

胰脂肪酶,咖啡酸,熒光猝滅,金屬離子,抑制活性

肥胖被認為主要是一種脂肪代謝紊亂疾病,肥胖的盛行已經危害到人們的健康,研究表明肥胖是導致心血管疾病、癌癥和糖尿病的關鍵因素[1-4]。抗肥胖藥物的研發主要集中于對脂肪代謝過程酶選擇性控制,有效抑制胰脂肪酶活性可以起到減肥作用。研究報道茶多酚、蘋果多酚、漿果來源多酚都具有較強的抑制胰脂肪酶活性,通過控制脂肪代謝起到減肥作用[5-7]。咖啡酸是常見的酚酸類物質,在植物中廣泛存在,通過動物實驗研究其調節脂肪代謝抗肥胖作用已有報道[8-9],探討植物來源的多酚成分與胰脂肪酶的相互作用機理,對于了解減肥機制和多酚成分的應用具有重要意義。

熒光光譜法已經廣泛用于小分子與蛋白質相互作用的研究,其中關于咖啡酸與蛋白質相互作用的報道較少。龍梅等[10]研究了咖啡酸及其衍生物與溶菌酶的相互作用,結果表明咖啡酸與溶菌酶的結合對其內源熒光產生靜態猝滅,咖啡酸中的羧基對結合位點數起主要作用。余丹丹等[11]研究表明咖啡酸使乳蛋白發生內源性熒光猝滅,與蛋白結合導致咖啡酸抗氧化活性顯著降低。柳全文等[12]研究報道咖啡酸與牛血清白蛋白有強的結合,結合通過影響色氨酸的微環境影響了牛血清白蛋白的構象。通過熒光光譜法研究咖啡酸與胰脂肪酶相互作用鮮見報道,本文主要以具有良好抗氧化活性的酚酸化合物咖啡酸為研究對象,通過熒光光譜法探索其與胰脂肪酶相互作用及作用機理,為小分子植物性胰脂肪酶抑制劑的開發利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

F-7000熒光分光光度計 日本日立高新技術公司;KQ-500DE數控超聲清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;KJ-5A多頭磁力攪拌器 金壇市科析儀器有限公司;HH-6數顯電子恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;ML104/02電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;FE20實驗室PH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;TDL-5-A低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠;UV-2700紫外-可見光分光光度計 日本SHIMADZU公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 咖啡酸與胰脂肪酶相互作用的熒光分析

1.2.1.1 熒光光譜的測定 準確移取0.30 mL咖啡酸溶液(0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液調pH7.7)與3 mL質量濃度為0.5 mg/mL的胰脂肪酶(0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液調pH7.7)溶液于1 cm的熒光比色皿中并將其混勻,使咖啡酸最終濃度達到0、9.09×10-6、1.8182×10-5、2.7273×10-5、3.6364×10-5、4.5455×10-5、5.4545×10-5、6.3636×10-5、7.2727×10-5、8.1818×10-5、9.0909×10-5mol/L,在25 ℃和37 ℃的條件下靜置5 min后,放入熒光分光光度計于激發波長為290 nm,狹縫均為5 nm,發射波長為290～450 nm條件下測定熒光光譜。

1.2.1.2 咖啡酸對胰脂肪酶的熒光猝滅特性 熒光分子與猝滅劑之間的猝滅效率服從Stern-Volmer方程:

式中:F0是不存在猝滅劑時熒光分子的熒光強度;F是加入猝滅劑后熒光分子的熒光強度;Kq是猝滅常數(該數值越大猝滅效果越明顯);τ0是熒光分子的初始平均壽命(生物大分子約為10～8 s);c為咖啡酸濃度(mol/L)。用F0/F對c作圖,可以求得Kq值,從而得到不同溫度條件下的Stern-Volmer方程。

1.2.1.3 咖啡酸與胰脂肪酶的結合常數(Ka)與結合位點(n)的計算 猝滅劑與熒光物質的結合常數(Ka)與結合位點數(n)符合的方程:

臨床資料 兩組人群年齡、性別、BMI、吸煙率、收縮壓、舒張壓、血糖、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、三酰甘油、同型半胱氨酸、C反應蛋白等差異均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

式中,F0和F分別為加入咖啡酸前后熒光強度,c為咖啡酸濃度(mol/L)。

根據方程可以作出lg[(F0-F)/F]與lgc之間的直線圖,由擬合出的直線斜率和截距便可以求出結合常數以及結合位點數。

1.2.1.4 咖啡酸與胰脂肪酶作用力類型的計算 不同種類的小分子與蛋白質等生物大分子結合力的類型是不一樣的,熵變(ΔS)和焓變(ΔH)是判斷二者作用類型的主要依據。根據如下熱力學參數方程可以計算出咖啡酸和胰脂肪酶之間相互作用的熱力學參數。

ΔG=-RTlnKa

式中:ΔG、ΔH和ΔS分別是吉布斯自由能、焓變和熵變;R為氣體常數(R=8.314);(Ka)1和(Ka)2分別是溫度T1和T2條件下的結合常數。

1.2.2 咖啡酸對胰脂肪酶抑制活性 胰脂肪酶活性測定具體方法參照文獻方法[13]。

酶活力(μmol/min·L·g)

式中:V樣為消耗NaOH的體積(mL);V空為空白管消耗NaOH的體積(mL);c為NaOH濃度(mol/L);t為反應時間(min);N為酶液稀釋倍數。

1.2.3 咖啡酸對胰脂肪酶抑制類型 測定咖啡酸抑制酶的作用類型,可以通過改變底物濃度而保持其他抑制劑和其他組分不變的方法。加入橄欖油的體積分別為1、2、3、4 mL測定酶促反應的初速率。在保持實驗溶液總體積不變的條件下,加入橄欖油的體積差用Tris-HCl緩沖溶液補充。然后采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法,將反應初速率的倒數1/V作為縱坐標,底物濃度的倒數1/[S]作為橫坐標作圖,判斷咖啡酸對胰脂肪酶的抑制作用類型。

1.2.4 金屬離子對于咖啡酸與胰脂肪酶相互作用的影響 在探究金屬離子對咖啡酸脂肪酶相互作用影響時,實驗條件同1.2.1.1,用移液槍在咖啡酸-胰脂肪酶混合溶液中分別加入0.3 mL濃度為4×10-4mol/L的CaCl2、FeCl3、CuSO4、FeCl2溶液,混勻,在37 ℃溫度條件下靜置5 min后進行分析。

表1 咖啡酸對胰脂肪酶熒光猝滅Stern-Volmer方程和猝滅常數Table 1 Stern-Volmer equation and constant of fluorescence disappearance of caffeic acid on PPL

2 結果與討論

2.1 咖啡酸與胰脂肪酶相互作用的熒光分析

2.1.1 熒光光譜分析 圖1表示25 ℃和37 ℃條件下,咖啡酸濃度微量變化對于胰脂肪酶熒光強度的影響,可以看出,隨著咖啡酸濃度的增大熒光強度有規律的降低,發生了熒光猝滅,兩種溫度下表現出相同的趨勢,最大發射波長均紅移7 nm。結果表明微量咖啡酸的加入迅速與胰脂肪酶結合導致胰脂肪酶構象的改變。胰脂肪酶在340 nm處呈現最大熒光發射峰,說明熒光主要來源于色氨酸殘基,Burstein[14]認為色氨酸殘基部分暴露于水相中最大峰位為340～342 nm,而完全暴露于水中最大峰位為350～352 nm,咖啡酸的加入使胰脂肪酶最大峰位發生紅移說明咖啡酸的加入改變了色氨酸的微環境,使色氨酸從部分暴露向完全暴露轉變。實驗室研究表明蘆丁和綠原酸同樣具有熒光猝滅作用,文獻報道茶葉兒茶素、表沒食子兒茶素對胰脂肪酶具有熒光猝滅作用[15-16]。

圖1 咖啡酸對胰脂肪酶熒光作用的影響Fig.1 Effect of caffeic acid concentration on fluorescence spectrum of PPL注:圖中曲線由上到下的咖啡酸濃度依次為0、0.909×10-5、1.818×10-5、2.727×10-5、3.636×10-5、4.545×10-5、5.455×10-5、7.273×10-5、8.182×10-5、9.091×10-5 mol/L。

2.1.2 咖啡酸對胰脂肪酶的熒光猝滅特性 熒光猝滅主要有動態猝滅、靜態猝滅和非輻射能量轉移3種,熒光分子與猝滅劑之間的猝滅效率服從Stern-Volmer方程,不同溫度下Stern-Volmer方程和猝滅常數見表1。由表1可知,25 ℃時,Kq值為(1.24±0.10)×1012L/(mol·s),37 ℃時Kq值為(1.88±0.12)×1012L/(mol·s),所得Kq遠高于由碰撞引起的最大猝滅效應常數(2×1010L/(mol·s)),這表明在低濃度時,咖啡酸對胰脂肪酶的熒光猝滅不是由碰撞造成的,而是由于靜態猝滅造成的[17]。

2.1.3 咖啡酸與胰脂肪酶的結合常數(Ka)與結合位點(n) 靜態猝滅中,結合常數(Ka)與結合位點(n)計算結果見表2。由表2可知,兩種溫度下咖啡酸與胰脂肪酶的相互作用均表現出較強的結合力,而且隨著溫度的升高,結合力增強,結合位點數也增大,說明結合反應是吸熱反應。

表2 咖啡酸與胰脂肪酶的結合常數和結合位點數Table 2 Binding constant and site of caffeic acid with PPL

2.1.4 咖啡酸與胰脂肪酶作用力類型 根據熱力學方程分別計算不同溫度下熱力學參數,具體結果見表3。

表3 咖啡酸與胰脂肪酶結合的熱力學參數Table 3 Thermodynamic parameters of interaction between PPL and caffeic acid

由表3可知,兩種溫度下ΔG<0,表明咖啡酸與胰脂肪酶的結合是自發進行的;ΔH>0,說明咖啡酸與胰脂肪酶的結合反應是吸熱過程,升溫將有利于反應進行,結合常數Ka將變大,這與表2結果一致;當ΔH>0且ΔS>0時,作用力主要表現為疏水作用力[18],表明咖啡酸與胰脂肪酶結合主要靠疏水作用力。Haslam等研究多酚與蛋白質作用機理,認為多酚先通過疏水作用向蛋白質分子表面聚集,進行疏水區然后再發生多點氫鍵結合[19]。

2.2 咖啡酸對胰脂肪酶抑制類型及抑制活性

由圖2可知,咖啡酸加入后使得胰脂肪酶的Km值無變化,Vmax值下降,所以其抑制類型表現為非競爭性抑制。咖啡酸不僅能與游離胰脂肪酶(E)結合,而且與酶-底物絡合物(ES)結合,但結合常數不同。因此可以得出結論:咖啡酸對胰脂肪酶的抑制類型為非競爭性抑制作用,但抑制作用容易受到外界條件、微環境的影響,較不穩定。相同條件下,隨著咖啡酸濃度的增加抑制活性逐漸增強,其IC50為(0.88±0.07) mg/mL,其活性顯著的強于綠原酸,與文獻報道一致[20]。研究報道了燕麥的乙醇提取物具有較強的胰脂肪酶抑制活性,與酚酸存在著協同效應[21]。

圖2 咖啡酸對胰脂肪酶抑制作用的Lineweaver-Burk圖Fig. 2 Lineweaver-Burk curvefor the inhibition of caffeic acid on pancreatic lipase

2.3 金屬離子對于咖啡酸與胰脂肪酶相互作用的影響

金屬離子往往會參加機體的生化反應,進一步研究金屬離子存在條件下咖啡酸與胰脂肪酶的結合特性更有實際意義。由表4可知,金屬離子存在條件下咖啡酸與胰脂肪酶的結合特性受到影響。結果表明:四種金屬離子的存在結合常數和結合位點數均增加,說明四種金屬離子都一定程度上促進了咖啡酸與胰脂肪酶的結合,其中Fe3+的作用最顯著,強度大小為Fe3+>Fe2+>Cu2+>Ca2+。然而,這種作用源于多方面影響的綜合作用,它們可以通過改變酶的微環境及改變抑制劑與酶的結合等多種方式來影響酶的催化特性。

表4 金屬離子對于咖啡酸與胰脂肪酶相互作用的影響Table 4 Effect of the interaction betweencaffeic acid and PPL by metal ion

3 結論

熒光光譜法研究表明咖啡酸與胰脂肪酶存在相互作用,熒光光譜分析可知,咖啡酸的加入產生了熒光猝滅現象,最大發射波長略微紅移,而且猝滅呈現規律性的變化,說明咖啡酸與胰脂肪酶的結合改變了酶的結構,從而抑制了胰脂肪酶活性,金屬離子在一定程度上增強了咖啡酸與胰脂肪酶的結合。通過計算分析得知猝滅主要為靜態猝滅,熱力學常數計算表明咖啡酸與胰脂肪酶相互作用是自發進行的吸熱過程,主要作用力為疏水作用力。

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Study on the interaction between caffeic acid and pancreatic lipase by fluorescence spectroscopy

FAN Jin-bo1,WANG Xiao-lu1,JIANG Hai-jing2,ZHOU Su-zhen1

(1.College of Food Science and Technology,Bohai University,Food Safety Key Lab of Liaoning Province,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China;2.The Center of Comprehensive Occupation Technology Education in Fengrun District of Tangshan City,Tangshan 064000,China)

The interaction between chlorgenic acid and porcine pancreas lipase(PPL)was researched by fluorescence spectrophotometer,including the fluorescence quenching properties,calculating the binding constants and binding sites,inhibitory activity and inhibitory type of caffeic acid on porcine pancreatic lipase,effect of metal ions on the interaction. Experimental results showed that caffeic acid of had strong fluorescence quenching effect on porcine pancreas lipase,maximum absorption wavelength redshift,mainly belongs to static quenching. Binding constant under 25 ℃ and 37 ℃ 6.48×104L/mol and 1.38×105L/mol respectively,and the thermodynamic parameters Δ H>0 and Δ S>0,showed that combination was a spontaneous endothermic reaction,the main force of hydrophobic forces. Inhibitory type of caffeic acid on pancreatic pancreatic lipase was noncompetitive inhibition,inhibitory activity was IC50(0.88± 0.07)mg/mL. When there were four kinds of metal ion(Cu2+,Ca2+,Fe3+,Fe2+)binding constant and binding points were increased,that metal ions,to a certain extent,promoted the combination of caffeic acid and pancreatic lipase.

pancreas lipase;caffeic acid;fluorescence quenching;metal ion;inhibitory activity

2016-06-30

范金波(1977-)，男，博士，副教授，主要從事食品生物化學方面的研究，E-mail：jinbo_fan@hotmail.com。

TS255.1

A

1002-0306(2017)02-0152-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.020