蘘荷水溶性多糖的理化性質及其體外抗氧化活性

朱培蕾,汪名春,趙士偉,趙貴云,劉才宇,*

(1.安徽省農業科學院園藝研究所,安徽合肥 230031; 2.安徽農業大學茶與食品科技學院食品科學與工程系,安徽合肥 230036)

蘘荷水溶性多糖的理化性質及其體外抗氧化活性

朱培蕾1,2,汪名春2,趙士偉2,趙貴云1,劉才宇1,*

(1.安徽省農業科學院園藝研究所,安徽合肥 230031; 2.安徽農業大學茶與食品科技學院食品科學與工程系,安徽合肥 230036)

以蘘荷花軸為原料,通過水提醇沉法提取制備蘘荷水溶性多糖(water-soluble polysaccharides fromZingibermiogaRosc.,ZMPs-W),采用化學和儀器分析方法研究了多糖的總糖含量、單糖組成、官能團特征、空間構像等理化性質,并通過體外抗氧化實驗探討了蘘荷水溶性多糖的抗氧化活性。研究結果表明:ZMPs-W是以半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、葡糖糖醛酸、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖(各組分之間的摩爾百分比為:33.12∶18.79∶15.93∶11.47∶9.81∶5.98∶5.90)為主要組成成分的,含有羧基、硫酸基和吡喃環的多糖類物質,且具有三螺旋結構。其總糖含量和蛋白質含量分別為73.76%和0.35%;體外抗氧化實驗表明:ZMPs-W具有一定的抗氧化活性,在本實驗條件下,其清除羥基自由基、DPPH自由基以及螯合金屬離子的能力隨著添加劑量的增加而增強,其中清除羥基自由基和DPPH自由基的能力表現突出。

蘘荷,多糖,理化性質,抗氧化活性

蘘荷,別稱陽荷、茗荷、野姜等,系多年生姜科草本植物,序狀花軸是蘘荷的主要食用部分,因具有色鮮、質脆、風味獨特等特點,深受廣大消費者喜愛。蘘荷營養豐富,每100 g嫩莖和花軸含蛋白質約12.4 g、脂肪2.2 g、纖維素28.1 g、維生素C和維生素A共約95.8 mg,并富含鈣、鐵、鋅等多種微量元素[1]。另外,據《唐本草》、《本草圖經》、《四川中藥志》等藥典記載,蘘荷花軸、根莖和種子皆可入藥,具有活血調經、鎮咳祛痰、消腫解毒等功效,是中成藥的寶貴原料[2]。自上世紀80年代起,國內外學者圍繞蘘荷資源的開發利用,開展了生物學特性[3-5]、栽培技術[6-7]、貯藏加工[8-9]、色素提取[10-11]、化學成分分析[12]等一系列研究工作。在蘘荷功能特性研究方面,日本學者Kim Ha Won[13]等考察了89種可食用植物的氯仿抽提物對超氧陰離子的抑制作用,研究結果表明蘘荷抑制活性最強;并發現蘘荷能夠抑制巨噬細胞中誘導型促炎基因的表達。這意味著蘘荷具有很強的抗氧化能力和抗炎潛力,在預防和治療慢性炎癥以及與之相關的癌癥方面將具有廣闊的應用前景。

本研究通過水提醇沉法,從蘘荷花軸中提取制備蘘荷水溶性多糖(water-soluble polysaccharides fromZingibermiogaRosc.,ZMPs-W),利用化學和儀器分析方法對ZMPs-W的總糖含量、蛋白質含量、單糖組成、官能團特征和空間構像等進行分析研究,并通過體外抗氧化實驗探討了ZMPs-W的抗氧化活性。研究結果將為進一步開發利用蘘荷這一寶貴資源提供理論基礎和科研依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘘荷 2014年8月購于安徽省岳西縣;牛血清白蛋白標準品、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等單糖標準品 美國Sigma-Aldrich公司產品;甲醇、1-苯基-3-甲基-5-吡唑(PMP)、乙腈、苯酚、硫酸、95%乙醇、氯仿、三氟乙酸、考馬斯亮藍G-250、磷酸、菲洛嗪、水楊酸、氯化亞鐵、雙氧水等 市售分析純;工業乙醇(95%) 市售。

V-1600型紫外可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司;HH數顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實驗儀器廠;GZX-9070MBE數顯鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;Waters 1525 Binary型液相色譜儀 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 蘘荷花軸預處理 新鮮蘘荷花軸清洗、切碎,于60 ℃條件下烘干后粉碎。按10∶1料液比,用體積分數75%酒精在70 ℃條件下回流提取2次,每次1.5 h。提取結束后,離心得到的料渣于60 ℃條件下烘干。最后,將得到的蘘荷粉末置于干燥器中備用[14-15]。

1.2.1.2 ZMPs-W的提取制備 稱取一定量的蘘荷粉末,在料液比1∶30,提取溫度100 ℃,提取時間4 h的條件下提取多糖。浸提液離心(4800 r/min,15 min)后留取上清液,沉淀物再用相同方法反復提取、離心3次。合并所有上清液,于50 ℃條件下旋轉蒸發,濃縮至原體積的1/8。濃縮液中加入3倍體積工業乙醇(乙醇終體積分數為75%)沉淀多糖,冰箱放置過夜,離心后取沉淀物,加水溶解,旋轉蒸發去除殘留酒精后冷凍干燥,即得到ZMPs-W[14-15]。

1.2.2 ZMPs-W理化性質分析

1.2.2.1 總糖含量測定 采用苯酚硫酸法[14]制作葡萄糖標準曲線,并測定樣品中的總糖含量。

1.2.2.2 蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍法[16]制作牛血清蛋白標準曲線,并測定樣品中的蛋白質含量。

1.2.2.3 單糖組成分析 液相色譜條件[14]:色譜柱,ZORBAX Eclipse XDB-C18(Analytical 4.6 mm×250 mm,5-Micron);流動相,0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)-乙腈(體積比為83∶17);柱溫,30 ℃;流速,1 mL/min;進樣量,25 μL。

單糖標準品衍生化和標準曲線制作[14]:精確稱取10 mg各單糖標準品,加入2 mL蒸餾水,配成5 mg/mL單糖標準溶液。取標準品溶液100 μL,加入100 μL 0.6 mol/L NaOH溶液,混合均勻。取100 μL混合液置于1.5 mL離心管中,向其中加入100 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液,漩渦混勻后在70 ℃下水浴100 min,待衍生化結束后,冷卻至室溫。向混合液中加入100 μL 0.3 mol/L的HCl以中和反應液。反應混合物在55 ℃旋轉蒸發至干,再向其中加入氯仿和蒸餾水各1 mL,搖勻靜置,棄氯仿層,重復進行3次萃取操作。萃取結束后,樣品用0.45 μm微孔濾膜過濾后做梯度稀釋,各濃度梯度樣品進HPLC分析,繪出單糖標準品峰面積對濃度的標準曲線。

ZMPs-W的酸水解和衍生化[14]:精確稱取10 mg蘘荷多糖,配制成5 mg/mL樣品溶液。取100 μL樣液于水解管中,加入100 μL 4 mol/L的三氟乙酸,放入干燥箱,在120 ℃下水解2 h。水解結束后,向其中加入甲醇200 μL,50 ℃下旋轉蒸發至干,重復3次。然后加入100 μL蒸餾水,按單糖標準品衍生化的方法進行樣品衍生化。

根據標準品在液相色譜圖上的出峰時間確定樣品的單糖組成,根據標準曲線計算樣品中各單糖組成的摩爾百分比。

1.2.2.4 紫外光譜掃描 稱取多糖樣品,用蒸餾水配成0.5 mg/mL的溶液,采用V-1600型紫外可見分光光度計進行掃描,掃描波長200～400 nm。

1.2.2.5 紅外光譜掃描 采用KBr壓片法[17],對多糖樣品進行紅外光譜測定,掃描范圍為4000～500 cm-1。

1.2.2.6 空間構象分析 采用剛果紅實驗[17]分析多糖樣品的空間構象。稱取多糖樣品5～10 mg,加蒸餾水2 mL、80 μmol/L的剛果紅試劑2 mL,混勻。逐漸加入1 mol/L 的NaOH溶液,使溶液的NaOH終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mol/L,于200～800 nm間進行紫外-可見光譜掃描,測量不同NaOH濃度下溶液的最大吸收波長。另一反應體系,不加多糖樣品,加同樣的蒸餾水、剛果紅試劑和NaOH溶液,以相同方法測量不同NaOH濃度下溶液的最大吸收波長。比較反應體系的最大吸收波長變化情況。

1.2.3 ZMPs-W抗氧化活性分析

1.2.3.1 羥基自由基(·OH)清除能力 ·OH清除能力的測定參照參考文獻[18]報道的方法稍作修改。取不同濃度(0～4 mg/mL)的多糖溶液1 mL于試管中,然后每個試管依次加入1 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、0.5 mL 9.0 mmol/L的水楊酸溶液(無水乙醇配制)和1 mL 0.3% H2O2溶液,混合均勻后于37 ℃水浴30 min,于分光光度計510 nm處測定吸光度值,并用乙醇調零。以VC作陽性對照,以相同方法測定其清除·OH能力。ZMPs-W清除·OH的能力依下面公式計算:

式中:A0,空白組吸光度值(乙醇代替樣品);A1,樣品吸光度值;A2,樣品干擾實驗吸光度值(水楊酸溶液代替FeSO4溶液和H2O2溶液)。

1.2.3.2 DPPH自由基(DPPH·)清除能力 DPPH·清除能力的測定參照參考文獻[19]報道的方法稍作修改。取不同濃度(0～4 mg/mL)的多糖溶液2 mL于試管中,加入2 mL的DPPH溶液(0.1 mmol/L,要求現配現用),混合均勻,并在避光條件下室溫放置30 min。于分光光度計517 nm處測定吸光度值,用蒸餾水調零。以VC作陽性對照,以相同方法測定其清除DPPH·能力。ZMPs-W清除DPPH·的能力依下面公式計算:

式中:A0,空白組吸光度值(蒸餾水代替樣品);A1,樣品吸光度值;A2,樣品干擾實驗的吸光度值(甲醇代替DPPH)。

1.2.3.3 金屬離子螯合能力 金屬離子螯合能力的測定參照參考文獻[20]報道的方法稍作修改。取不同濃度(0～4 mg/mL)的多糖溶液1.0 mL于試管中,加入0.05 mL的FeCl2溶液(2 mmol/L)、2.75 mL蒸餾水和0.2 mL菲洛嗪溶液(5 mmol/L),混勻后室溫放置10 min,于分光光度計562 nm處測定吸光度值,用蒸餾水調零。以EDTA-2Na作陽性對照,以相同方法測定其金屬離子螯合能力。ZMPs-W螯合金屬離子的能力依下面公式計算:

式中:A0,空白組吸光度值(蒸餾水代替樣品);A1,樣品吸光度值;A2,樣品干擾實驗吸光度值(蒸餾水代替FeCl2溶液)。

1.2.4 數據處理與分析 采用SPSS 17.0統計分析軟件對實驗數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 ZMPs-W理化性質

2.1.1 總糖含量 以葡萄糖為標準品,利用苯酚-硫酸法測定吸光度值,制作總糖含量標準曲線。得到葡萄糖微克數X與吸光值Y之間線性方程Y=0.0029X-0.0319,相關系數R2=0.9673,由此計算出制備的ZMPs-W總糖含量為73.76%。

2.1.2 蛋白質含量 以牛血清白蛋白為標準品,利用考馬斯亮藍法測定吸光度值,制作蛋白質含量標準曲線,得到蛋白質微克數X與吸光值Y之間的線性方程Y=0.0045X+0.2052,相關系數R2=0.9987,由此計算出ZMPs-W中的蛋白質含量為0.35%。

2.1.3 單糖組成 單糖標準品經過衍生化后通過HPLC檢測,得到液相色譜圖如圖1所示。圖1中1～10號色譜峰依次為甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖。

圖1 單糖標準品液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard monosaccharide注:1:甘露糖;2:核糖;3:鼠李糖;4:葡萄糖醛酸;5:半乳糖醛酸;6:葡萄糖;7:半乳糖;8:木糖;9:阿拉伯糖;10:巖藻糖。

ZMPs-W經過酸水解和衍生化后通過HPLC檢測,得到的液相色譜圖如圖2所示。對比單糖標準品色譜峰保留時間可以看出,ZMPs-W主要含有半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、葡糖糖醛酸、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖等單糖組分。各組分之間的摩爾百分比為:33.12∶18.79∶15.93∶11.47∶9.81∶5.98∶5.90。

圖2 ZMPs-W單糖組成液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of monosaccharidecomposition of ZMPs-W注:3：鼠李糖;4:葡萄糖醛酸;5:半乳糖醛酸;6:葡萄糖;7:半乳糖;8:木糖;9:阿拉伯糖。

2.1.4 紫外掃描 ZMPs-W紫外光譜圖如圖3所示。從圖3中可以看出:ZMPs-W在240～290 nm處存在較微弱吸收峰,說明蛋白質含量較低。該結果與2.1.2化學方法檢測結果一致。

圖3 ZMPs-W紫外光譜圖Fig.3 UV spectrum of ZMPs-W

2.1.5 紅外掃描 ZMPs-W的紅外光譜圖如圖4所示。圖4中3400 cm-1左右處出現的寬而強的吸收峰由羥基的O-H伸縮振動引起,3000～2800 cm-1左右出現的兩個吸收峰應該是由甲基或亞甲基的C-H伸縮振動引起,1330 cm-1處的吸收峰由C-H變角振動引起。O-H和C-H均為多糖類物質的特征基團,因此根據以上特征峰可以證明W-ZMPS為多糖類物質。1640 cm-1處和1410 cm-1處的吸收峰分別由羧基的C=O對稱和非對稱伸縮振動引起[21],由此可以說明ZMPs-W具有羧基基團。此外,在1240 cm-1處出現的吸收峰由硫酸基的S=O伸縮振動引起,據此可以判斷,ZMPs-W中含有硫酸基團。1200～1000 cm-1左右的一組吸收峰由吡喃糖環的醚鍵C-O-C以及羥基的-OH變角振動引起[22-23]。上述分析表明ZMPs-W是一種酸性雜多糖,并含有吡喃環。

圖4 ZMPs-W紅外掃描圖譜Fig.4 Infrared spectra of ZMPs-W

2.1.6 空間構象 剛果紅可與具有三股螺旋結構的多糖形成絡合物。在低濃度NaOH溶液中,三股螺旋結構與剛果紅試劑形成的絡合物,使溶液的最大吸收波長增加;高濃度時,三股螺旋被解開,不能形成絡合物,溶液的最大吸收波長開始下降。因此,可根據NaOH濃度由低到高增加時,溶液最大吸收波長的變化情況,判斷多糖樣品是否具有三股螺旋結構。

在不同NaOH濃度時,剛果紅試劑的最大吸收波長以及ZMPs-W與剛果紅作用后溶液的最大吸收波長變化情況如圖5所示。由圖5可知,剛果紅試劑的最大吸收波長隨著NaOH濃度的增加而減少,未發生特征性變化。而ZMPs-W與剛果紅作用后溶液的最大吸收波長發生了特征性變化,當NaOH濃度為0～0.3 mol/L時,體系的紫外吸收波長移向長波,NaOH濃度繼續增加時,最大吸收波長開始下降,由此可以判斷ZMPs-W能夠與剛果紅形成絡合物,具有三股螺旋結構。

圖5 不同NaOH濃度時剛果紅試劑與ZMPs-W作用后最大吸收波長變化情況Fig.5 Changes in maximum absorption wavelength of mixture of Congo red and ZMPs-W at various concentration of NaOH

2.2 ZMPs-W體外抗氧化活性

2.2.1 羥基自由基清除能力 以VC為陽性對照,考察ZMPs-W清除·OH的能力,結果見圖6。由圖6可知,當溶液濃度為0～4 mg/mL時,ZMPs-W與陽性對照VC清除·OH的能力均隨著溶液濃度的增加而增大,且濃度在0.1～0.5 mg/mL時,ZMPs-W的清除能力優于VC,隨后清除能力增幅明顯低于VC。當濃度為2 mg/mL時,VC的清除率達到97.94%,隨后趨于平緩,而ZMPs-W的清除率僅為36.46%,差異顯著。當溶液濃度為4 mg/mL時,VC的清除率達到99.5%,而ZMPs-W的清除率為64.66%。

圖6 ZMPs-W羥基自由基清除能力Fig.6 The·OH scavenging activities of ZMPs-W

2.2.2 DPPH自由基清除能力 以VC為陽性對照,考察ZMPs-W清除DPPH·的能力,結果見圖7。由圖7可知,陽性對照VC清除DPPH·的效果顯著,當濃度為0.1 mg/mL時,其DPPH·清除率即可達到95.81%,而此時ZMPs-W的清除率僅為11.31%。隨著溶液濃度的增加,ZMPs-W的清除能力不斷增強,而VC的清除能力相對平緩,當ZMPs-W溶液濃度達到4 mg/mL時,其清除率達到91.33%,與VC接近。

圖7 ZMPs-W DPPH自由基清除能力Fig.7 The DPPH·scavenging activities of ZMPs-W

2.2.3 金屬離子螯合能力 以EDTA-2Na為陽性對照,考察ZMPs-W螯合Fe2+的能力,結果如圖8所示。由圖8可知,當溶液濃度為0～4 mg/mL時,Fe2+能夠被ZMPs-W以劑量依賴方式所螯合。溶液濃度為4 mg/mL時,ZMPs-W螯合Fe2+的能力為50.42%,相當于陽性對照EDTA-2Na螯合能力的一半。

圖8 ZMPs-W螯合金屬離子能力Fig.8 The Fe2+ chelating activities of ZMPs-W

3 結論

以蘘荷花軸為原料,通過水提醇沉法制備了蘘荷水溶性多糖ZMPs-W。分析結果表明ZMPs-W是含有吡喃環的酸性雜多糖,并具有三螺旋結構。其總糖含量為73.76%,蛋白質含量為0.35%。單糖組成主要為半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、葡糖糖醛酸、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖,各組分之間的摩爾百分比為:33.12∶18.79∶15.93∶11.47∶9.81∶5.98∶5.90。體外抗氧化實驗表明,ZMPs-W具有一定的抗氧化活性。當溶液濃度為0～4 mg/mL時,ZMPs-W清除羥基自由基、DPPH自由基,以及螯合金屬離子的能力隨著添加劑量的增加而增強,其中清除羥基自由基和DPPH自由基的能力表現突出。

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Physicochemical characteristic and antioxidation activityinvitroof water soluble polysaccharides fromZingibermiogaRosc

ZHU Pei-lei1,2,WANG Ming-chun2,ZHAO Shi-wei2,ZHAO Gui-yun1,LIU Cai-yu1,*

(1.Institute of Horticulture,Academy of Anhui Agricultural Science,Hefei 230031,China;2.Department of Food Science and Engineering,College of Tea and Food technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)

Water-soluble polysaccharides(ZMPs-W),extracted from floral axis ofZingibermiogaRosc. by water extracting-alcohol precipitation method were studied by the means of chemical and apparatus analysis. The antioxidation activitiesinvitrowere also studied in this paper. The results showed that ZMPs-W were mainly constituted by galactose,glucose,galacturonic acid,glucuronic acid,arabinose,xylose,rhamnose(the mol ratio was 33.12∶18.79∶15.93∶11.47∶9.81∶5.98∶5.90). Triple helix structure,carboxyl group,sulfate group and pyran ring were found in the polysaccharides. The total sugar and protein content was 73.76% and 0.35%,respectively. Antioxidant experimentinvitrosuggested that ZMPs-W had antioxidant activities. Under the experimental conditions,the antioxidant activities(·OH clearance,DPPH· clearance and Fe2+chelation)increased with the increasing concentration. Especially,the clearance ablities of ·OH and DPPH· clearance were outstanding.

ZingibermiogaRosc.;polysaccharides;physicochemical property;antioxidation activity

2016-07-20

朱培蕾(1981-)，女，博士研究生，助理研究員，研究方向：園藝產品貯藏與加工，E-mail:wz.1107@aliyun.com。

*通訊作者:劉才宇(1964-)，男，副研究員，主要從事園藝產品采后處理與安全標準化生產方面的研究，E-mail:caiyu058@163.com。

安徽省農業科學院院長青年創新基金(14B0325)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)02-0136-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.017