超聲對改性明膠固定化木瓜蛋白酶活力的影響

白 鴿,鄭德娟,張 杰,陳 雪,曹雁平,2,*

(1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京工商大學,北京 100048;2.食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心,北京 100048)

超聲對改性明膠固定化木瓜蛋白酶活力的影響

白 鴿1,鄭德娟1,張 杰1,陳 雪1,曹雁平1,2,*

(1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京工商大學,北京 100048;2.食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心,北京 100048)

本文探討了超聲處理對戊二醛改性明膠包埋的木瓜蛋白酶酶解反應條件以及酶學特性的影響。采用均勻實驗的方法優化超聲處理固定化木瓜蛋白酶的反應條件。利用偏最小二乘回歸法分析均勻實驗結果,得到最優條件為:135 kHz、0.05 W/cm2、20 min、40 ℃,此條件下實測相對酶活為221.25%,與理論值相對誤差為3.58%。超聲并沒有改變固定化酶的最適pH和最適溫度,即超聲并不改變固定化酶的酶學特性。

超聲,固定化木瓜蛋白酶,酶活力

明膠是動物膠原蛋白部分水解后的產物。它是一種非常重要的高分子材料,具有可降解、抗原性低、組織相容性好等優點[1]。毛跟年等[2]用明膠作為載體,固定化乙醇脫氫酶,其穩定性增強,酶活損失小,10次使用后相對酶活仍能保證52.89%。高啟禹等[3]用明膠作為固定化木聚糖酶的載體,使其熱穩定性得到顯著提升,擴大了應用范圍。但由于明膠存在機械性能不足、熱穩定性差等缺點,通常將其改性后使用,以擴大其應用范圍[4]。明膠改性方法主要有物理改性法、化學改性法和共混改性法。戊二醛作為明膠改性劑之一,具有反應快,機械強度高,產品穩定等優點[5],是最常用的明膠改性方法。陳書霖等[6]發現經戊二醛改性后,使明膠膜的耐水性和阻濕性顯著提高。

明膠是一種良好的固定化酶載體材料。固定化酶與游離酶相比,具有可重復使用,穩定性好,便于回收的優點[7]。但是由于立體屏蔽、微擾動、分配效應、擴散限制效應等因素的影響,會降低固定化酶的酶活力[8]。有實驗表明適當的超聲處理會提高固定化酶的反應速率,提高酶活[9]。Badgujar等[10]發現超聲可以提高固定化脂肪酶的酶活,與非超聲相比,超聲處理后酶活提升4.5倍。Wang等[11]發現超聲可以提升固定化酶的活力,從而加快菜籽蛋白的酶解,超聲處理后的水解度增加了74.38%。Costa等[12]發現高強度的超聲可以有效提高固定化胰蛋白酶水解蛋白質的效率,消化率提升了11倍。

本文采用戊二醛改性后的明膠,利用包埋-交聯法得到固定化木瓜蛋白酶,研究超聲頻率、超聲功率、超聲時間、超聲溫度對固定化木瓜蛋白酶的影響,以及超聲對固定化酶酶學特性的影響。本研究為固定化木瓜蛋白酶的工業應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明膠、25%溶液戊二醛、無水碳酸鈉、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、三氯乙酸、醋酸丁酯 國藥集團化學試劑有限公司;福林酚試劑、木瓜蛋白酶(測定活力4.96×105U/g) Sigma公司;干酪素 北京奧博星生物技術有限責任公司;L-谷胱甘肽 拜爾迪生物技術有限公司。

JXD-02型多頻槽式處理系統 北京金星超聲波技術設備有限公司;DC-2006型低溫恒溫水浴 浙江寧波新芝生物科技股份有限公司;UVmini-1240型紫外可見分光光度計 日本島津公司;CP214電子分析天平 上海市奧豪斯儀器有限公司;FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省鞏義市予華有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 固定化木瓜蛋白酶的制備 稱取4 g明膠溶于20 mL pH=8的磷酸鹽緩沖液中,磁力攪拌加熱至完全溶解,在一定溫度下緩慢加入0.5 mL,0.5%戊二醛溶液,反應25 min后,加入0.5 mL 0.5%戊二醛溶液,反應10 min[13],冷卻至40 ℃左右,緩慢加入0.5 mL酶液(10 mg/mL),再加入0.5 mL 4%戊二醛溶液,反應30 min,將混合溶液滴加到不斷攪拌的冷的(0 ℃)醋酸丁酯中,通過調節轉速控制球珠的大小(4±1)mm,形成球珠后撈出浸泡在100 mL 0.5%戊二醛溶液中,4 ℃冰箱貯藏30 min后[14],水洗三遍,濾干,放置在冰箱中備用。

1.2.2 超聲處理固定化木瓜蛋白酶單因素實驗

1.2.2.1 超聲頻率對固定化木瓜蛋白酶活力的影響 為研究超聲頻率對固定化木瓜蛋白酶活力的影響,超聲頻率分別為28、40、50、135 kHz,超聲功率為0.45 W/cm2,超聲溫度為40 ℃,分別進行酶促反應10 min,測定酶活力。

1.2.2.2 超聲功率對固定化木瓜蛋白酶活力的影響 為研究超聲功率對固定化木瓜蛋白酶活力的影響,超聲頻率為135 kHz,超聲功率為0.05、0.15、0.25、0.35、0.45 W/cm2,超聲溫度為40 ℃,分別進行酶促反應10 min,測定酶活力。

1.2.2.3 超聲時間對固定化木瓜蛋白酶活力的影響 為研究超聲時間對固定化木瓜蛋白酶活力的影響,超聲頻率為40 kHz,超聲功率為0.15 W/cm2,超聲溫度為40 ℃,超聲時間分別為10、15、20、25、30 min,測定酶活力。

1.2.2.4 超聲溫度對固定化木瓜蛋白酶活力的影響 為研究超聲溫度對固定化木瓜蛋白酶活力的影響,超聲頻率分別為40 kHz,超聲功率為0.15 W/cm2,超聲溫度為30、40、50、60、70 ℃,分別進行酶促反應20 min,測定酶活力。

1.2.3 超聲處理固定化木瓜蛋白酶酶活力條件的優化 根據單因素實驗結果,選取超聲頻率、超聲功率、超聲時間、超聲溫度4個因素,利用DPSv15.10數據處理系統進行實驗因素設計混合水平均勻實驗優化超聲處理固定化木瓜蛋白酶活力的條件。

表1 實驗因素水平表Table 1 Factors and levels for the trial

1.2.4 超聲處理對固定化木瓜蛋白酶最適條件的影響

1.2.4.1 超聲處理對固定化木瓜蛋白酶最適pH的影響 固定化木瓜蛋白酶分別與pH=6、6.25、6.5、6.75、7的酪蛋白在非超聲(水浴)和超聲條件下進行反應。非超聲與超聲反應溫度均為40 ℃,反應時間為20 min,超聲頻率為135 kHz,超聲功率為0.05 W/cm2。反應后測定酶活。

1.2.4.2 超聲處理對固定化木瓜蛋白酶最適溫度的影響 固定化木瓜蛋白酶與酪蛋白在最適pH的條件下,分別在30、40、50、60、70 ℃的體系溫度下反應,測定最適溫度。非超聲與超聲反應時間均為20 min,超聲頻率為135 kHz,超聲功率為0.05 W/cm2。反應后測定酶活。

1.3 酶活力測定方法

參照福林酚法[15]測定固定化酶活力。

式(1)

式中:E1為超聲后固定化木瓜蛋白酶的活力;E0為非超聲固定化木瓜蛋白酶的活力。

1.4 數據處理

實驗中每個處理重復三次,實驗各值均為三個平行數據的均值。采用DPSv15.10數據處理系統進行均勻實驗設計。數據統計結果與分析應用Microsoft Excel 2007和Origin 9.0軟件。

2 結果與分析

2.1 超聲處理對固定化木瓜蛋白酶活力的影響

2.1.1 超聲頻率對固定化木瓜蛋白酶活力的影響 使用不同頻率的超聲對固定化木瓜蛋白酶進行處理,結果如圖1所示。

圖1 超聲頻率對固定化木瓜蛋白酶相對酶活力的影響Fig.1 Effect of ultrasound frequency on the relative enzyme activity of immobilized papain

由圖1可知,隨著超聲頻率的增大,相對酶活呈現先增大后減小的趨勢,經過28、40、50、135 kHz超聲處理,相對酶活力分別為171.99%、219.95%、169.35%、143.73%,較非超聲處理時的酶活力都有所提高,并在40 kHz處達到最大值,相對酶活為219.95%。王振斌等[16]發現超聲預處理中固定化纖維素酶隨著超聲頻率的增大,其酶活性先升高后降低,并在24 kHz處取得最大值。Badgujar等[10]發現固定化脂肪酶隨著超聲頻率的增加呈現先增加后減小的趨勢,并在33 kHz處達到最大值,與本研究的趨勢一樣。隨著超聲頻率的增加,聲波膨脹時間會變短,空化核尚未增長到產生空化作用的尺寸,或空化泡即將形成但因壓縮時間短,空化氣泡來不及收縮便崩塌,以致空化效應不明顯。但并不是頻率越低越好,過低的頻率會使氣泡存在時間過長,產生的自由基與固定化酶相結合,會使酶活下降。由此可見適宜的超聲處理產生的空化作用會提升固定化酶的活力。

2.1.2 超聲功率對固定化木瓜蛋白酶活力的影響 使用不同功率的超聲對固定化木瓜蛋白酶進行處理,結果如圖2所示。

圖2 超聲頻率對固定化木瓜蛋白酶相對酶活力的影響Fig.2 Effect of ultrasound power on the relativeenzyme activity of immobilized papain

由圖2可知,隨著超聲功率的增大,相對酶活呈現先增大后減小的趨勢,并在0.15 W/cm2處達到最大值,相對酶活為275.85%。Govind等[17]發現超聲可以促進固定化酶的酶活,并且隨著超聲功率的增加,酶活力呈現先增大后減小的趨勢,并在100 W時超聲作用最明顯。朱國輝等[18]發現經超聲不同功率處理菠蘿果蛋白酶的酶活較非超聲均有所增加,且最適功率為100 W,超聲功率再增加,酶活反而會有所降低,這與本研究的趨勢一致。

2.1.3 超聲時間對固定化木瓜蛋白酶活力的影響 在不同的時間下超聲處理固定化木瓜蛋白酶,結果如圖3所示。

圖3 超聲時間對固定化木瓜蛋白酶相對酶活力的影響Fig.3 Effect of ultrasound treatment time on the relative enzyme activity of immobilized papain

由圖3可知,隨著超聲時間的增大,相對酶活呈現先增大后減小的趨勢,并在20 min處達到最大值,相對酶活為164.06%。Long[19]發現隨著超聲時間的增加,固定化酶提取亞麻籽油的能力先增加后趨于平緩,在9 h時酶活力達到最大值。王振斌等[20]實驗表明淀粉酶的相對酶活力隨超聲時間的增大而先增加后減小,且最適時間為10 min,分析可能是因為隨著超聲時間的增加,有利于酶的空間結構改善、淀粉的溶解和淀粉與酶的有效接觸幾率的提高,而時間過長,會使淀粉酶空間結構遭到破壞,導致酶活性降低。

2.1.4 超聲溫度對固定化木瓜蛋白酶活力的影響 在不同的溫度下超聲處理固定化木瓜蛋白酶,結果如圖4所示。

圖4 超聲溫度對固定化木瓜蛋白酶相對酶活力的影響Fig.4 Effect of ultrasound treatment temperature on the relative enzyme activity of immobilized papain

由圖4可知,隨著超聲溫度的增大,相對酶活呈現先增大后減小的趨勢,并在40 ℃處達到最大值,相對酶活為166.56%。Sneha等[21]發現固定化脂肪酶的活性隨著超聲溫度的升高,呈現先升高后降低的趨勢。石文奇等[22]發現α-淀粉酶酶活會隨著超聲溫度的升高先升高后下降,與本研究結果相一致。林劍等[23]分析認為超聲處理導致酶活力降低的原因為:超聲溫度過高可能會導致酶的失活和構象發生變化,從而使α-淀粉酶的酶活降低。

2.1.5 超聲處理固定化木瓜蛋白酶催化活性的條件優化 采用偏最小二乘回歸分析方法對混合水平均勻實驗結果進行分析。實驗結果如表2所示,得到最優超聲條件為135 kHz,0.05 W/cm2,20 min,40 ℃,相對酶活是229.18%。在最優條件下進行驗證實驗,相對活力為221.25%,相對誤差為3.58%。雖然N9、N11、N17、N19值比實測值大，但經過SPSS分析，該四組結果與實測值無顯著性差異。對比預測值和實測值,可以說明建立的預測模型具有一定的實踐指導意義。

表2 超聲處理固定化木瓜蛋白酶條件優化的均勻實驗結果Table 2 Uniform design matrix and corresponding results

2.2 超聲處理對固定化木瓜蛋白酶最適條件的影響

2.2.1 超聲處理對固定化木瓜蛋白酶最適pH的影響 由圖5可知,非超聲的固定化酶活力隨著pH的升高,呈現出先增大再減小的趨勢,在pH=6.5時酶活力達到最高為2.75 U/g;經超聲處理后的固定化酶,酶活力也在pH=6.5處達到最高為3.30 U/g。由此可見,超聲處理并未改變固定化酶的最適pH的水平和范圍,但是可以提升固定化酶的活力。吳葛洋等[24]實驗超聲對固定化木瓜蛋白酶酶學特性的實驗發現,超聲只是提升了固定化酶的酶活,并未改變其最適pH,與本研究的結果相符合,分析認為超聲處理固定化木瓜蛋白酶只對其產生物理作用,并未使其化學結構發生變化,故最適pH范圍不會改變。

圖5 超聲處理對固定化酶最適pH的影響Fig.5 The effects of ultrasonic treatment on optimum pH of the immobilized enzyme

2.2.2 超聲處理對固定化木瓜蛋白酶最適溫度的影響 由圖6可知,非超聲的固定化酶活力隨著溫度的升高,呈現出先增大再減小的趨勢,在60 ℃時酶活力達到最高為3.67 U/g;經超聲處理后的固定化酶,酶活力也在60 ℃處到最高為2.82 U/g。由此可見,超聲處理并未改變固定化酶的最適溫度。蘇二正等[25]經實驗測得游離木瓜蛋白酶的最適溫度50 ℃,發現固定化可以提高酶的最適溫度,經測定固定化后最適溫度會提升到60～70 ℃,與本研究的結果相吻合。同時溫度對酶促反應具有兩方面影響:溫度升高可以促進酶與底物分子的運動,從而提高碰撞幾率,提高酶活力,但是,溫度繼續升高,會使蛋白質分子會發生變性,導致酶活性中心結構的改變,阻礙酶促反應的效率。在60 ℃時非超聲比超聲后酶活大,分析可能是因為,超聲的空化作用會使酶的結構發生變化,影響了酶的結構,從而使酶活有所降低。

圖6 超聲處理對固定化酶最適溫度的影響Fig.6 The effects of ultrasonic treatment on optimum temperature of the immobilized enzyme

3 結論與討論

通過單因素實驗,研究超聲頻率、超聲功率、超聲時間、超聲溫度對固定化酶活性的影響。在單因素實驗的基礎上,通過均勻實驗,確定最優超聲條件為135 kHz、0.05 W/cm2、20 min,40 ℃,相對酶活力為229.18%。驗證實驗證明最優的超聲條件下測得固定化木瓜蛋白酶的相對酶活力為221.25%,相對誤差為3.58%,說明建立的預測模型具有一定的實踐指導意義。改性明膠固定化木瓜蛋白酶的最適pH為6.5,最適溫度為60 ℃,超聲處理并未改變固定化酶的酶學特性。

超聲處理固定化酶,可以改善固定化后酶活性降低等缺點。由于超聲能夠有效地提高酶的活力,從而改善食品的物理化學性質,這對提高食品的加工性能、貯藏性能以及營養功能等具有重要的意義,使得超聲處理酶具有廣闊的應用前景。超聲對固定化酶的作用復雜,本文只實驗了超聲頻率、超聲功率、超聲時間、超聲溫度的影響。但超聲對于固定化酶作用機理及對酶催化選擇性的探究等,有待于進一步實驗。

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Effect of ultrasound treatment on the activity of immobilized papain prepared by modified gelatin

BAI Ge1,ZHENG De-juan1,ZHANG Jie1,CHEN Xue1,CAO Yan-ping1,2,*

(1.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Technology & Business University(BTBU),Beijing 100048,China;2.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients,Beijing 100048,China)

Immobilized papain was prepared through modified gelatin with glutaraldehyde. The effects of power,frequency,time and temperature on the efficacy of ultrasound treatment to stimulate the activity of immobilized papain were investigated in this study. The optimal ultrasound treatment conditions were determined by uniform design and least square regression analysis to be 135 kHz,0.05 W/cm2,20 min and 40 ℃. The results of validation experiments showed an actual value of 221.25% with a relative error of 3.58% compared to thearetical value. The optimal temperature and the optimal pH were not influenced by ultrasonic treatment.

ultrasound;immobilized papain;enzyme activity

2016-05-27

白鴿(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：固定化酶，E-mail：baige821@163.com。

*通訊作者:曹雁平(1961-)，男，博士，教授，研究方向：食品化學與安全，E-mail：caoyp@th.btbu.edu.cn。

國家自然科學基金項目(31371722)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)02-0118-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.013