飛燕草素聯合3-MA增敏抗HER-2陽性乳腺癌細胞效應

陳靜瑤,周 杰,韓 彬,李 飛,朱彥鋒,余小平

(成都醫學院公共衛生系,四川成都 610500)

飛燕草素聯合3-MA增敏抗HER-2陽性乳腺癌細胞效應

陳靜瑤,周 杰,韓 彬,李 飛,朱彥鋒,余小平*

(成都醫學院公共衛生系,四川成都 610500)

目的:研究飛燕草素(delphinidin,Dp)聯合自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladnine,3-MA)對HER-2+乳腺癌細胞MDA-MB-453的抑制效應。方法:用不同濃度飛燕草素處理MDA-MB-453細胞,CCK-8檢測細胞增殖情況;熒光斑點實驗和Weston Blot實驗檢測飛燕草素對細胞自噬的誘導情況;Weston Blot實驗檢測3-MA對自噬的抑制狀況,CCK-8檢測飛燕草素聯合3-MA對細胞增殖狀況的影響。結果:飛燕草素能有效抑制MDA-MB-453細胞增殖,誘導MDA-MB-453細胞自噬并呈劑量依賴效應;3-MA有效抑制MDA-MB-453細胞自噬,同時增強自噬飛燕草素抗HER-2+乳腺癌細胞MDA-MB-453增殖效應。結論:飛燕草素聯合自噬抑制劑3-MA,能促進飛燕草素抗HER-2+乳腺癌細胞MDA-MB-453增殖。

飛燕草素,乳腺癌,自噬,增敏

乳腺癌是全球第二大最常見腫瘤,其發病率位于女性腫瘤之首,直至2012年,全球每年有167萬女性新增病例,占所有腫瘤的25%[1]。HER-2受體陽性型乳腺癌占乳腺腫瘤的25%～30%[2],預后不佳。因此,積極開發HER-2受體靶向治療藥物對HER-2+乳腺癌的治療至關重要。目前乳腺癌的常規治療方案表現出明顯的毒副作用,嚴重影響患者生存質量[3-4]。膳食類植物含有的化學物質在膳食中廣泛存在,易獲得,毒副作用低,對乳腺癌的預防和輔助治療能發揮積極作用[5]。

近年來黃酮類化合物花青素的抗癌作用受到關注,發現其能發揮除抗氧化作用外的抗增殖和轉移效應[6]。然而,花青素抗HER-2+乳腺癌的機制仍有不明確的部分,飛燕草素作為花青素六種主要單體化合物之一,在花青素中豐度較高,活性較強[7],被認為抗癌療效優于其他花青素單體而成為本次研究的對象。

自噬是一種進化保留過程,在抗癌作用中表現出雙刃劍作用,其中,當細胞處于惡性微環境如饑餓或代謝應激壓力時,能介導細胞內長壽蛋白轉化,消除損傷或多余的細胞器,維持細胞代謝平衡,發揮保護癌細胞效應[8-9]。近年來研究多顯示,抑制自噬的保護效應對增敏化療抗癌作用至關重要[10-11],因此,本文將探討飛燕草素在抑制HER-2+乳腺癌細胞MDA-MB-453增殖的同時是否誘導保護性自噬,以及抑制自噬能否增敏飛燕草素抗HER-2+乳腺癌效應。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人乳腺癌細胞MDA-MB-453 HER-2+中國科學院上海細胞庫;飛燕草素(純度≥95%)、3-Methyladnine(M9281) 美國Sigma公司;L-15培養基、轉染液OPTI-MEM 美國Gibco公司;胎牛血清 美國Millipore公司;質粒提取試劑盒 德國QIAGEN公司;CCK-8 日本Dojindo公司;pEX-GFP-hLC3WT熒光質粒 上海交通大學;Lipofectamine2000 美國Invitrogen公司;BCA蛋白定量試劑盒 美國Thermo公司;LC3-I/II(2775) 美國Cell Signaling Technology公司;ATG5(ab78073) 英國Abcam公司。

IX71型倒置熒光相差顯微鏡 日本OLYMPUS公司;臺式高速冷凍離心機、ND-2000型微量紫外可見光分光光度計 美國Thermo公司;化學發光凝膠成像儀、Weston blot及轉膜設備 美國Bio-Rad公司;酶標儀 美國BioTek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 MDA-MB-453細胞用含有10%胎牛血清的L-15培養基于細胞培養箱37 ℃,5%CO2條件培養,每48 h換液,選對數生長期細胞實驗。

1.2.2 CCK-8檢測細胞增殖抑制 將對數期細胞用胰酶消化后制成細胞懸液。將細胞稀釋至8×104個/mL,接種于96孔板,24 h后,加入飛燕草素。設計0、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、200 μmol/L十個濃度,每個濃度3個復孔。DMSO作為溶劑對照。飛燕草素作用48 h后,吸棄原培養基,加入含10% CCK-8的新培養基100 μL/孔,37 ℃孵育2 h,于酶標儀450 nm波長下檢測吸光度即OD值。計算藥物細胞存活率及IC50值。存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)。用SPSS21.0軟件回歸法中的probit程序計算IC50值。

1.2.3 實驗設計與分組 根據CCK-8實驗結果,熒光斑點實驗和自噬誘導鑒定實驗分為,對照組:含DMSO的L-15培養基,實驗組:以IC50值為基準,再左右各取一個濃度的飛燕草素處理細胞;自噬抑制實驗,選擇對細胞增殖抑制最強和自噬誘導能力最強的飛燕草素濃度作為實驗劑量,分為對照組、飛燕草素處理組、自噬抑制組,鑒定使用3-MA后自噬是否被抑制,為下一步檢測抑制自噬后細胞生長增殖能力做準備;使用抑制劑后的細胞生長增殖能力檢測實驗,分為對照組、3-MA處理組、飛燕草素處理組、3-MA和飛燕草素聯合處理組。聯合處理組先以5 mmol/L的3-MA預處理2.5 h后,再加入飛燕草素處理48 h,檢測細胞增殖抑制情況。

1.2.4 熒光斑點實驗檢測細胞自噬水平 將細胞以2.5×104個/mL的密度接種于六孔板,24 h后,去除培養基后將配置好的轉染試劑滴加到六孔板中,輕搖混勻,孵育24 h,觀察細胞與脂質體融合狀態,當細胞與脂質體融合度達70%～80%,吸出脂質體混合物,用培養基清洗細胞后分別以含DMSO的培養基為對照組,根據IC50值(40 μmol/L)選擇濃度為20、40、80 μmol/L的飛燕草素為實驗組處理細胞,48 h后觀察細胞內熒光斑點數目。

1.2.5 蛋白分離和定量 將細胞用PBS清洗后加入200 μL細胞裂解液和蛋白酶抑制劑混合物,于冰上裂解30 min,收集細胞于EP管,低溫高速離心(4 ℃ 1.6×104r/min,15 min),回收上清液,用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,在酶標儀450 nm波長下得出OD值,繪制標準曲線,回歸系數>0.99方可定量檢測蛋白濃度,根據標準品曲線計算待測樣品蛋白濃度,根據蛋白濃度,按每孔50 μg總蛋白制備上樣樣品。

1.2.6 Weston Blot檢測蛋白表達水平 將定量后的蛋白與4×樣品緩沖液按比例混合,煮沸5 min后,將蛋白定量加于SDS-PAGE膠體孔中,加以80 V 30 min,120 V 1 h電壓進行蛋白分離;再將蛋白轉移致PVDF膜(200 mA,2 h),之后用5% BSA溶液于37 ℃封閉1 h后直接加入相應蛋白抗體,4 ℃孵育過夜。TBST清洗(3×10 min)后加入HRP-共軛二次抗體,37 ℃孵育2 h,再以TBST 清洗(3×10 min),最后用ECL化學發光底物顯色。

1.2.7 數據處理 實驗數據用均數±標準差(±s)表示,采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),組間比較采用Dunnett-t檢驗,p值設為0.05。

2 結果與分析

2.1 飛燕草素有效抑制MDA-MB-453細胞增殖

飛燕草素是具有抗腫瘤特性的黃酮類植物化合物,能通過多種機制抑制不同的腫瘤細胞增殖。如飛燕草素通過抑制AKT/ERK1/2/AMPK信號通路抑制卵巢透明細胞癌,通過轉染小RNA促進惡性膠質瘤死亡,通過調節凋亡相關的腫瘤壞死因子誘導配體抑制前列腺癌細胞等[12-14],并且還能通過抑制腫瘤細胞血管內皮生長因子,普遍抑制受該因子調節的腫瘤細胞的生長[15]。為探討飛燕草素對HER-2+乳腺癌細胞增殖的影響機制,將檢測飛燕草素是否影響HER-2+乳腺癌細胞增殖,以及影響程度與實驗計量的關系。

以不同濃度的飛燕草素處理MDA-MB-453細胞,通過CCK-8實驗檢測飛燕草素對細胞生長抑制狀況的影響。實驗結果顯示,飛燕草素能有效抑制MDA-MB-453乳腺癌細胞增殖,擬合繪制細胞存活率曲線(圖1),計算得出IC50值約為40 μmol/L。以此為依據,選擇20、40、80 μmol/L濃度的飛燕草素作為實驗劑量,進行進一步實驗。

圖1 飛燕草素對MDA-MB-453細胞存活率的影響Fig.1 The effect of delphinidinto MDA-MB-453 cell on viability

2.2 飛燕草素能誘導MDA-MB-453細胞自噬

為檢測飛燕草素是否誘導MDA-MB-453細胞自噬,將GFP-LC3質粒轉染入細胞分別用20、40、80 μmol/L濃度的飛燕草素刺激該細胞,檢測細胞內自噬體的數量。實驗結果顯示,飛燕草素處理乳腺癌細胞后,細胞內熒光斑點數量增加,并存在劑量依賴效應(圖2A)。20 μmol/L飛燕草素處理(圖2b)后造成個別細胞呈現全亮綠色現象,這可能是由于熒光斑點過密且相互重疊造成。為進一步確認飛燕草素誘導乳腺癌細胞自噬,通過Weston Blot檢測LC3蛋白在細胞內轉化情況,實驗結果發現,飛燕草素處理乳腺癌細胞MDA-MB-453導致細胞內LC3-I型蛋白轉化為LC3-II型蛋白,并且,LC3-II型蛋白表達水平隨飛燕草素濃度的增加而增加,LC3-I型蛋白表達逐漸減弱(圖2B),呈現劑量依賴效應。同時,檢測了調控自噬表達的關鍵蛋白ATG5。自噬的形成是通過一系列自噬相關基因協同作用產生,特別是當調節自噬體膜形成的關鍵基因Atg7被激活后,Atg7將激活自噬相關基因Atg12,Atg12又進一步激活Atg10,并最終與Atg5結合,形成自噬體前體細胞,為最終形成自噬體做準備。因此,ATG5蛋白作為Atg5基因的活性形式,是調節自噬體形成的關鍵蛋白的終末環節,若自噬相關基因Atg系列被激活將最終表現為ATG5蛋白表達增強。通過檢測ATG5蛋白的表達情況說明飛燕草素誘導的自噬是受ATG5蛋白調控的結果,同時也驗證自噬體的形成。實驗結果發現,與對照組相比,ATG5蛋白隨飛燕草素濃度的增加表達增強(圖2C),說明飛燕草素通過ATG5調控自噬體的形成。

近年研究已表明自噬與腫瘤細胞的生長密切相關,誘發保護性自噬能促進腫瘤細胞的存活,誘發致死性自噬則加速細胞死亡,稱自噬性細胞死亡。飛燕草素抑制乳腺癌細胞增殖同時誘發自噬,推測乳腺癌細胞的增殖抑制可能與自噬密切相關,因此,進一步研究了自噬與乳腺癌細胞生長增殖的關系。

圖2 飛燕草素能誘導MDA-MB-453乳腺癌細胞自噬Fig.2 Delphinidin induced autophagy in MDA-MB-453 cells注:A:MDA-MB-453細胞瞬時轉染GFP-LC3熒光質粒后分別以DMSO(對照組)以及20、40、80 μmol/L(實驗組)飛燕草素處理48 h;熒光斑點數的平均值來源于50次隨機視野計數平均值,放大倍數為400×;B:免疫印跡發檢測分別以DMSO(對照組)以及不同濃度的飛燕草素處理48 h后LC3-II/LC3-I蛋白的表達情況;C:免疫印跡發檢測分別以DMSO(對照組)以及不同濃度的飛燕草素處理48 h后ATG5蛋白的表達情況;“-”:對照組;“+”:處理組;*p<0.05；a:DMSO;b:20 μmol/L;c:40 μmol/L;d:80 μmol/L。

2.3 3-MA抑制自噬促進HER-2+乳腺癌細胞死亡

保護性自噬的誘發與化療耐藥的產生息息相關,嚴重影響化療藥物療效,如一型干擾素誘導抗乳腺癌細胞效應被自噬效應中和,當自噬被化學或基因沉默的方法抑制后方表現一型干擾素增敏效應[20];自噬抑制增加乳腺癌對激素藥物他莫昔芬的敏感性[21];3-MA能增加HER-2單克隆抗體曲妥珠對HER-2 陽性乳腺癌的治療作用[22]。由此可見,自噬抑制的增敏作用已成為乳腺癌治療的有效措施。

實驗發現,飛燕草素有效抑制癌細胞增殖的同時誘導了自噬,基于自噬的雙刃劍作用,使用化學抑制劑3-MA抑制自噬,檢測自噬對乳腺癌細胞增殖的影響。3-MA是自噬早期抑制劑,能通過抑制自噬體的成熟從而抑制自噬進程,導致LC3-II蛋白表達減少[16-17],根據前述的實驗結果可知,80 μmol/L濃度的飛燕草素抑制細胞增殖和誘導細胞的自噬能力最強,因此選作實驗劑量,并通過CCK-8實驗檢測自噬對細胞生長增殖的影響。

為確定3-MA對乳腺癌細胞的自噬抑制作用,通過熒光斑點實驗和檢測自噬標記蛋白LC3-II/LC3-I檢測自噬抑制情況。實驗結果表明,與飛燕草素單獨處理組相比,3-MA與飛燕草素共處理組細胞內熒光斑點數目明顯減少(圖3A),LC3-II蛋白表達明顯減弱,LC3-I蛋白表達明顯增強(圖3B)。說明3-MA有效抑制了飛燕草素誘導的MDA-MB-453細胞自噬。

為進一步檢測抑制自噬后的細胞增殖狀況,通CCK-8實驗檢測細胞存活率。結果顯示,與對照組相比,3-MA處理組的細胞增殖情況未受到明顯影響,與之相反,3-MA與飛燕草素聯合處理組與飛燕草素單獨處理組相比,細胞明顯產生增殖抑制現象(圖3C)。這說明抑制自噬能有效促MDA-MB-453細胞死亡,而自噬在飛燕草素抑制乳腺癌細胞增殖過程中可能產生了保護效應。目前已有研究顯示,多種植物化學物質,如槲皮素、白花丹素、紫檀芪等均能誘導癌細胞產生保護性自噬,即抑制自噬能有效增敏化療效應,促進腫瘤細胞死亡[18-19]。這對于開發飛燕草素等一系列低毒副作用的植物化學物質作為臨床輔助用藥治療乳腺癌,減小耐藥作用,提高患者生存質量具有積極意義。

圖3 3-MA抑制自噬促進MDA-MB-453細胞死亡Fig.3 3-MA promotes MDA-MB-453 cellsdeath by suppressing autophagy注:A:熒光斑點數的平均值來源于50次隨機視野計數平均值,放大倍數為400×,a:DMSO;b:80 μmol/L飛燕草素;c:80 μmol/L飛燕草素+3-MA;B:免疫印跡發檢測分別以DMSO(對照組)、80 μmol/L飛燕草素、80 μmol/L飛燕草素+3-MA處理48 h后LC3-II/LC3-I蛋白的表達情況;*p<0.05。

3 結論

綜上所述,飛燕草素有效抑制HER-2+乳腺癌細胞增殖并誘導保護性自噬,抑制自噬,增敏飛燕草素抗HER-2+乳腺癌細胞效應。

[1]Ferlay J,Soerjomataram I,Ervik M,et al. GLOBOCAN 2012 v1.0,Cancer Incidence and Mortality Worldwide:IARC CancerBase No. 11. Lyon,France:International Agency for Research on Cancer;2013. Available from:http://globocan. iarc.fr. Accessed on 28 May 2014.

[2]Slamon DJ,Leyland-Jones B,Shak S,et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2[J]. N Engl J Med,2001,344:783-792.

[3]Guo S,Wong S. Cardiovascular toxicities from systemic breast cancer therapy[J].Front Oncol,2014(4):346.

[4]Duchnowska R,Biernat W,Szostakiewicz B,et al. Correlation between Quantitative HER-2 protein expression and risk for brain metastases in HER-2+advanced breast cancer patients receiving Trastuzumab-containing therapy[J]. Oncologist,2012,17:26-35.

[5]Pratheeshkumar P,Son YO,Korangath P,et al. Phytochemicals in cancer prevention and therapy[J]. Biomed Res Int,2015:324021.

[6]Chen XY,Zhou J,Luo LP,et al. Black rice anthocyanins suppress metasis of breast cancer cells by targeting RAS/RAF/MAPK pathway[J]. Biomed Res Int,2015:414250.

[7]羅麗萍,余小平,韓彬,等. 花青素主要成分與HER-2激酶區的分子對接[J].生物工程學報,2014,30(3):504-513.

[8]Lu J,Sun DP,Gao S,et al. Cyclovirobuxine D induces autophagy-associated cell death via the Akt/mTOR Pathway in MCF-7 human breast cancer cells[J]. J Pharmacol Sci,2014,125(1):74-82.

[9]Shi YM,Yang L,Geng YD,et al. Polyphyllin I induced-apoptosis is enhanced by inhibition of autophagy in human hepatocellular carcinoma cells[J]. Phytomedicine,2015,22(13):1139-1149.

[10]Rodríguez CE,Reidel SI,Bal de Kier Joffé ED,et al. Autophagy protects from trastuzumab-induced cytotoxicity in HER2 overexpressing breast tumor spheroids[J]. PLoS One,2015,10(9):e0137920.

[11]Brigger D,Schl?fli AM,Garattini E,et al. Activation of RARαinduces autophagy in SKBR3 breast cancer cells and depletion of key autophagy genes enhances ATRA toxicity[J]. Cell Death Dis,2015(6):e1861.

[12]Ko H,Jeong MH,Jeon H,et al. Delphinidin sensitizes prostate cancer cells to TRAIL-induced apoptosis,by inducing DR5 and causing caspase-mediated HDAC3 cleavage[J]. Oncotarget,2015,6(12):9970-9984.

[13]Lim W,Jeong W,Song G.Delphinidin suppresses proliferation and migration of human ovarian clear cell carcinoma cells through blocking AKT and ERK1/2 MAPK signaling pathways[J]. Mol Cell Endocrinol,2016,15(422):172-181.

[14]Chakrabarti M,Ray SK. Direct transfection of miR-137 mimics is more effective than DNA demethylation of miR-137promoter to augment anti-tumor mechanisms of delphinidin in human glioblastoma U87MG and LN18 cells[J]. Gene,2015,573(1):141-152.

[15]Keravis T,Favot L,Abusnina AA,et al. Delphinidin Inhibits Tumor Growth by Acting on VEGF Signalling in Endothelial Cells[J]. PLoS One,2015,10(12):e0145291.

[16]Wu YT,Tan HL,Shui G,et al. Dual role of 3-methyladenine in modulation of autophagy via different temporal patterns of inhibition on class I and III phosphoinositide 3-kinase[J]. J Biol Chem,2010,285(14):10850-10861.

[17]Levine B,Kroemer G. Autophagy in the pathogenesis of disease[J]. Cell,2008,132(1):27-42.

[18]Chen WC,Hsu KY,Hung CM,et al. The anti-tumor efficiency of pterostilbene is promoted with a combined treatment of Fas signaling or autophagy inhibitors in triple negative breast cancer cells[J]. Food Funct,2014,5(8):1856-1865.

[19]Yan-Cong Li,Shu-Ming He,Zhi-Xu He,et al. Plumbagin induces apoptotic and autophagic cell death through inhibition of the PI3K/Akt/mTOR pathway in human non-small cell lung cancer cells[J]. Cancer Lett,2014,344(2):239-259.

[20]Ambj?rn M,Ejlerskov P,Liu Y,et al. IFNB1/interferon-β-induced autophagy in MCF-7 breast cancer cells counteracts its proapoptotic function[J]. Autophagy,2013,9(3):287-302.

[21]Amaral C,Varela C,Azevedo M,et al. Effects of steroidal aromatase inhibitors on sensitive and resistant breast cancer cells:aromataseinhibition and autophagy[J]. J Steroid Biochem Mol Biol,2013,135:51-59.

[22]Lozy F,Cai-McRae X,Teplova I,et al. ERBB2 overexpression suppresses stress-induced autophagy and renders ERBB2-induced mammary tumorigenesis independent of monoallelicloss[J]. Autophagy,2014,30,10(4):662-676.

Delphinidin sensitizes anti-tumor effect to HER-2+breast cancer cells by combining with 3-MA

CHEN Jing-yao,ZHOU Jie,HAN Bin,LI Fei,ZHU Yan-feng,YU Xiao-ping*

(Department of Public Health,Chengdu Medical College,Chengdu 610500,China)

Objective:To research the effect of delphinidin(Dp)combines with 3-Methyladnine(3-MA),inhibitor of autophagy,to HER(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)positive breast cancer cell MDA-MB-453. Methods:HER-2+breast cancer cells MDA-MB-453 were treated by Dp. Proliferation of MDA-MB-453 cells was detected by CCK-8. Fluorescence dot assay and Weston Blot were used to identify autophagy in breast cancer cells. Weston blot was used to assay condition of autophagy inhibition of 3-MA to MDA-MB-453 cell and CCK-8 tests combination effect of Dp and 3-MA to MDA-MB-453 cell. Results:Dp suppressed proliferation effectively and induced autophagy in dose-dependent manner in MDA-MB-453 cells. However,3-MA could restrain the autophagy,which sensitized anti-proliferation of Dp to MDA-MB-453 cell. Conclusion:Combination of Dp and 3-MA which suppresses autophagy can sensitize anti-proliferation effect of HER-2+breast cancer cell MDA-MB-453.

delphinidin;breast cancer;autophagy;sensibilization

2016-07-18

陳靜瑤(1988-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：植物化學物抗腫瘤分子機制，E-mail：cdyxucjy@sina.com。

*通訊作者:余小平(1970-)，男，博士，教授，研究方向：植物化學物抗腫瘤分子機制，E-mail：cyggwsyxp@sina.com。

國家自然科學基金(81573154)；國家自然科學基金(81273074)；四川省省屬高校科研創新團隊項目(14TD0023)；四川省青年科技創新研究團隊項目(2014TD0021)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)02-0354-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.060