黑果腺肋花楸原花青素的提取及抑菌性研究

朱 月,李奮梅,王艷麗,朱 寧,張海平,安建輝,孫愛東

(北京林業大學生物科學與技術學院,食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

黑果腺肋花楸原花青素的提取及抑菌性研究

朱 月,李奮梅,王艷麗,朱 寧,張海平,安建輝,孫愛東*

(北京林業大學生物科學與技術學院,食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

本文利用響應面分析法對黑果腺肋花楸原花青素的提取工藝進行優化,并探究其抑菌性質。結果表明:黑果腺肋花楸原花青素的最佳提取條件為：乙醇濃度62%,液料比25∶1 mL/g,提取溫度72 ℃,提取時間60 min。在此條件下提取的黑果腺肋花楸原花青素含量為3.32%;經AB-8大孔樹脂純化,原花青素含量提高約4倍,為14.29%;抑菌性實驗表明黑果腺肋花楸原花青素對供試菌種的抑菌效果依次為:枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>釀酒酵母,抑菌作用隨原花青素濃度的增加而提高,且純化前的黑果腺肋花楸原花青素具有更強的抑菌性。

黑果腺肋花楸,原花青素,提取純化,抑菌性

黑果腺肋花楸(AorniamealnocarpaElliot),又名野櫻莓、不老莓,薔薇科,原產于美國東北部地區[1]。其果樹是以生產果實為主的經濟林樹種,果實具有較高的營養價值和藥用價值,是集食用、藥用、園林綠化、生態保護等價值于一身的珍貴樹種。自20世紀90年代初,遼寧省干旱地區造林研究所最先開始了我國腺肋花楸引種栽培和果實加工利用的實驗研究工作。

黑果腺肋花楸果實中含有多種營養物質,例如膳食纖維、糖類、蛋白質、多酚類化合物等,其中最重要的物質是酚類物質[2]。酚類物質如酚酸、原花青素、花青素、黃酮醇等含量豐富,且與黑果腺肋花楸的生物活性密切相關[3]。黑果腺肋花楸果實中多酚類物質主要分為單體多酚和聚合多酚。單體多酚主要為酚酸、類黃酮及其甙類化合物、花青素及其糖苷類化合物;聚合多酚為原花青素。黑果腺肋花楸果實中原花青素占總酚的41.9%～59.1%[4],可見黑果腺肋花楸酚類物質中原花青素含量最高,對黑果腺肋花楸的生物活性起著至關重要的作用。原花青素具有抗氧化活性、防治心血管疾病、抗癌、抗高血壓、降血糖等生物活性[5-8];其抗氧化能力是VE的50倍、VC的20倍,是迄今為止發現的最好天然抗氧化劑之一[9];原花青素的抗菌、抗病毒作用已研究近30年,研究表明一定濃度的原花青素溶液對立枯絲核菌、串珠鐮孢和大斑病長蠕孢等菌均有抑制作用[10]。目前,原花青素已被廣泛應用于藥品、保健品和食品等領域。原花青素的提取方法有超聲法、有機溶劑浸提法和微波法等。

本文以黑果腺肋花楸為原料,利用超聲輔助提取法,探究其原花青素的提取工藝,并利用響應面分析法對提取工藝參數進行優化,同時對黑果腺肋花楸原花青素的抑菌性進行研究,為黑果腺肋花楸原花青素的深度開發和綜合利用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

黑果腺肋花楸 黑龍江省;無水乙醇、無水甲醇、鹽酸 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;香草醛、表兒茶素 分析純,上海阿拉丁生化科技有限公司;AB-8大孔樹脂 上海阿拉丁生化科技有限公司;LB培養基、孟加拉紅培養基、LB肉湯培養基、麥芽汁培養基 分析純,北京奧博星生物技術有限公司;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌 本實驗室提供。

JYL-C010打漿機 九陽股份有限公司;UV-6100紫外分光光度儀 上海元析儀器有限公司;超聲破碎儀 昆山市超聲儀器有限公司;L3660D低速離心機 上海知信實驗儀器有限公司;FD-18冷凍干燥機 北京德天佑科技發展有限公司;LQ-A 30002電子天平 瑞安市樂祺貿易有限公司;HL-2S恒流泵 上海青浦滬西儀器廠;SW-CJ-2D超凈工作臺 北京天林恒泰科技有限公司;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;DHP-9272電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑果腺肋花楸原花青素的提取工藝 黑果腺肋花楸鮮果→去梗、清洗、破碎→超聲輔助提取黑果腺肋花楸原花青素→原花青素粗提物分離→真空濃縮→冷凍干燥→原花青素純化物→抑菌實驗。

1.2.2 黑果腺肋花楸原花青素含量測定 采用鹽酸-香草醛法[11]測定黑果腺肋花楸中原花青素含量,方法略作修改。

1.2.2.1 標準曲線的制作 將表兒茶素標準品用甲醇配制成濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL標準溶液,于25 mL試管中加入1 mL表兒茶素標準溶液、5 mL 5 g/100 mL香草醛-甲醇溶液和3 mL濃鹽酸,搖勻,常溫避光反應1 h,以甲醇代替樣液作為空白對照,于500 nm波長處測定反應液吸光度A。得回歸方程為:Y=2.8183X+0.0176，R2=0.9991。

1.2.2.2 原花青素含量的測定 在一定條件下提取黑果腺肋花楸原花青素,提取完畢后,將提取液在4000 r/min下離心20 min;取1 mL提取液,1∶5稀釋;取1 mL稀釋液加入5 mL 5 g/100 mL香草醛-甲醇溶液和3 mL濃鹽酸,搖勻,常溫避光反應1 h,以甲醇代替表兒茶素標準溶液作為空白對照,于500 nm波長處測定反應液吸光度A。原花青素含量計算公式如下:

原花青素含量(%)=[(A-0.0176)×N×V×2.8183]/M×100

其中,A:吸光度;N:稀釋倍數;V:溶液體積;M:黑果腺肋花楸勻漿重量(g)。

1.2.3 單因素實驗設計

1.2.3.1 乙醇濃度對原花青素含量的影響 取3 g黑果腺肋花楸勻漿(預處理的花楸鮮果于打漿機中打漿1 min),在液料比25∶1 mL/g、提取時間60 min、提取溫度70 ℃條件下,以不同乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%、80%)超聲輔助提取原花青素(超聲提取時間20 min,功率600 W[12]);提取完畢后采用1.2.2方法測定原花青素含量。

1.2.3.2 液料比對原花青素含量的影響 取3 g黑果腺肋花楸勻漿,在乙醇濃度60%、提取時間60 min、提取溫度70 ℃條件下,以不同液料比(20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1 mL/g)超聲輔助提取原花青素(超聲提取時間20 min,功率600 W);提取完畢后采用1.2.2方法測定原花青素含量。

1.2.3.3 提取溫度對原花青素含量的影響 取3 g黑果腺肋花楸勻漿,在乙醇濃度60%、提取時間60 min、液料比25∶1 mL/g條件下,以不同溫度(40、50、60、70、80 ℃)超聲輔助提取原花青素(超聲提取時間20 min,功率600 W);提取完畢后采用1.2.2方法測定原花青素含量。

1.2.3.4 提取時間對原花青素含量的影響 取3 g黑果腺肋花楸勻漿,在乙醇濃度60%、提取溫度70 ℃、液料比25∶1 mL/g條件下,以不同時間(40、60、80、100、120、140 min)超聲輔助提取原花青素(超聲提取時間20 min,功率600 W);提取完畢后采用1.2.2方法測定原花青素含量。

1.2.4 黑果腺肋花楸原花青素提取工藝優化 結合單因素實驗結果,選取乙醇體積分數、液料比、提取溫度對原花青素含量影響顯著的3個因素,在單因素實驗基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法優化原花青素提取工藝。

表1 黑果腺肋花楸原花青素響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodologyanalysis of black chokeberry

采用Design Expert 8.0.6 trial軟件對實驗數據進行回歸分析,通過獲得影響因素的一次效應、二次效應及其交互效應方程,對影響黑果腺肋花楸原花青素提取的因素進行更深入的研究。

1.2.5 AB-8大孔樹脂純化

1.2.5.1 AB-8大孔樹脂預處理 AB-8大孔樹脂用無水乙醇浸泡24 h,充分溶脹,去離子水洗至無醇;加入5% HCl溶液浸泡12 h后,去離子水洗至中性;加入5% NaOH溶液浸泡12 h后,去離子水洗至中性;抽濾吸干樹脂表面水分,待用[13]。

1.2.5.2 AB-8大孔樹脂吸附和洗脫 取26 mm×60 cm層析柱,將3 mg/mL的原花青素粗提液以1 mL/min流速上柱吸附,吸附完畢后用5 BV去離子水洗去蛋白質、多糖等雜質;然后用50%乙醇溶液以1 mL/min流速洗脫,收集洗脫液,真空濃縮,冷凍干燥后測定原花青素純化物含量。

1.2.6 黑果腺肋花楸原花青素的抑菌性實驗 采用牛津杯法[14]測定原花青素的抑菌性。具體實驗步驟為:供試菌株的活化、菌懸液的制備、原花青素溶液配制、含菌平板制作及牛津杯法抑菌效果檢測。

1.2.6.1 供試菌種活化 將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母從4 ℃冰箱取出,轉接至新鮮營養瓊脂表面,細菌于37 ℃培養24 h,酵母菌于30 ℃培養3 d。

1.2.6.2 菌懸液的制備 將活化的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌取一接種環放置于LB肉湯培養基中,搖床150 r/min振蕩8 h后,調整菌懸液濃度到108CFU/mL[15];將活化的釀酒酵母取一環放置于麥芽汁培養基中,搖床上150 r/min振蕩14 h。

1.2.6.3 原花青素溶液配制 將黑果腺肋花楸粗提物和純化物分別配制成6 mg/mL的原花青素水溶液,用水1∶2稀釋,測定兩個不同濃度對供試菌的抑制效果。

1.2.6.4 含菌平板的制作 新鮮配制的LB瓊脂培養基和孟加拉紅培養基于121 ℃下滅菌20 min,當培養基冷卻至50 ℃左右在超凈臺上將培養基倒入滅菌的培養皿中,每個培養皿倒入約20 mL左右培養基;待培養基凝固,取0.1 mL菌懸液用三角涂布棒分別涂布于培養基上備用。

1.2.6.5 牛津杯法 將滅菌牛津杯用無菌鑷子夾出,垂直放置于培養基表面,輕輕按壓,使杯底與培養基之間無縫隙,每個平板放置4個牛津杯,每個牛津杯注入200 μL藥液,并用無菌生理鹽水作對照。細菌于37 ℃培養24 h,酵母菌于30 ℃培養2 d。

1.3 數據處理

本文采用Excel軟件進行單因素實驗和抑菌性實驗數據處理;采用Design Expert 8.0.6 trial進行多元回歸擬合和方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素結果

2.1.1 乙醇濃度對黑果腺肋花楸原花青素含量的影響 由圖1可知,隨著乙醇濃度的增加,黑果腺肋花楸提取物中原花青素含量升高,當乙醇濃度為60%時,黑果腺肋花楸原花青素含量達到最大值,此后隨著乙醇濃度增加原花青素含量下降,所以60%乙醇濃度為黑果腺肋花楸原花青素的最佳乙醇提取濃度。

圖1 不同乙醇濃度對黑果腺肋花楸原花青素提取含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on procyanidins content from black chokeberry

2.1.2 液料比對黑果腺肋花楸原花青素含量的影響 由圖2可知,當液料比為25∶1 mL/g時黑果腺肋花楸原花青素含量最高為3.82%,隨著液料比增加,花楸原花青素含量緩慢下降。可能的原因是隨著料液比的增大,脂溶性雜質的成分溶出量增加,可與乙醇結合,為原花青素的競爭性抑制劑,導致原花青素含量下降。所以確定黑果腺肋花楸花楸原花青素最佳提取的液料比為25∶1 mL/g。

圖2 不同液料比對黑果腺肋花楸原花青素提取含量的影響Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on procyanidins content from black chokeberry

2.1.3 溫度對黑果腺肋花楸原花青素含量的影響 由圖3可知,隨著溫度的升高,原花青素含量增加,當溫度為70 ℃時原花青素含量最高,溫度高于70 ℃時含量緩慢下降。如果溫度過高,一方面其中活性成分會受到破壞,雜質溶出量增加,給后續操作帶來不便[16];另一方面因為提取原花青素所用有機溶劑為乙醇,溫度過高也會造成溶劑損失。綜合以上因素,提取溫度應在70 ℃較為合適。

圖3 不同溫度對黑果腺肋花楸原花青素提取含量的影響Fig.3 Effect of temperature on procyanidinscontent from black chokeberry

2.1.4 提取時間對黑果腺肋花楸原花青素含量的影響 由圖4可知,提取時間40、60、80 min對原花青素含量影響不大;隨著時間增加,原花青素含量下降,推測其原因:其一,長時間加熱會對原花青素結構造成破壞,本實驗在較高溫度下(70 ℃)提取原花青素,為保證原花青素活性,應選取較短時間提取原花青素;其二,80 min后原花青素可能與細胞內的其它物質反應,從而使原花青素含量減少。

表3 方差分析結果Tbale 3 Results of variance analysis

注:*表示影響顯著(p<0.05);**表示影響極顯著(p<0.01)。

綜上所述,本實驗選取60 min為黑果腺肋花楸原花青素最佳提取時間。根據相關性分析,時間是四個單因素中對原花青素含量的影響最小的因素,所以之后的響應面優化實驗中,綜合考慮乙醇濃度、液料比和提取溫度三個因素對黑果腺肋花楸原花青素含量的影響。

圖4 不同提取時間對黑果腺肋花楸原花青素含提取量的影響Fig.4 Effect of time on procyanidinscontent from black chokeberry

2.2 響應面分析法實驗結果

2.2.1 響應面實驗結果及方差分析 響應面實驗設計及結果如表2所示,通過多元回歸擬合分析得出乙醇濃度、液料比、提取溫度對黑果腺肋花楸原花青素含量影響，可以用二次多項回歸方程表示:原花青素含量Y=3.33+0.11A+0.066B+0.066C-0.12AB+0.087AC+0.14BC-0.23A2-0.31B2-0.28C2。

表2 黑果腺肋花楸原花青素響應面分析實驗設計及結果Table 2 Design and results of response surfacemethodology experiment of black chokeberry

T檢驗表明:方程中A、BC影響顯著(p<0.05),A2、B2、C2影響極顯著(p<0.001)。

2.2.2 雙因素交互作用分析 圖5～圖7表示各因素交互作用響應面圖。從響應面圖的陡峭程度可直觀反映出兩因素交互作用的強弱[17]。由圖5～圖7看出,料液比與提取溫度之間的交互作用最明顯,乙醇濃度與提取溫度交互作用次之,相比較而言乙醇濃度與料液比交互作用較弱。

表4 黑果腺肋花楸原花青素的抑菌效果Table 4 Antibacterial activity of procyanidins from black chokeberry

圖5 液料比與乙醇濃度響應面圖Fig.5 Response surfaces of liquid-to-solid ratio and alcohol concentration

圖6 液料比與提取溫度響應面圖Fig.6 Response surfaces of extraction temperture and liquid-to-solid ratio

圖7 提取溫度與乙醇濃度響應面圖Fig.7 Response surfaces of extraction temperture and alcohol concentration

結合回歸數學分析模型,可預測提取的最優條件參數為乙醇濃度62.48%、液料比25.49∶1 mL/g、提取溫度71.80 ℃,在此條件下原花青素含量為3.36%。結合實際情況,提取的最佳工藝參數為乙醇濃度62%,液料比25∶1 mL/g、提取溫度72 ℃,提取時間60 min。在此條件下對提取的黑果腺肋花楸原花青素進行驗證,實際測得原花青素含量為3.32%,與理論值預測值僅差0.04%,說明采用響應面法得到的優化工藝可行性強,優化結果可靠。

2.3 AB-8大孔樹脂分離實驗結果

經AB-8大孔樹脂分離后,測得純化物中原花青素含量為14.29%,與分離前原花青素含量(3.32%)相比,純度提高約4倍。說明經AB-8大孔樹脂純化后,原花青素含量顯著提高,結合文獻可知[18-19],AB-8大孔樹脂適合用于黑果腺肋花楸原花青素的分離純化。

2.4 黑果腺肋花楸原花青素抑菌性實驗結果

由表4可以看出,黑果腺肋花楸原花青素對幾種供試菌種的抑菌效果不同。黑果腺肋花楸粗提物和純化物對枯草芽孢桿菌的抑制作用最強,其次是金黃色葡萄球菌,再次是大腸桿菌,幾種樣品對釀酒酵母均無抑制作用。多酚類物質對細菌的抑制作用較明顯,對某些真菌無明顯的抑制作用,本實驗研究結果與文獻報道相似[20-21]。不同的原花青素樣品濃度對供試菌種的抑制作用也不盡相同,隨濃度提高,抑菌效果增強。黑果腺肋花楸原花青素粗提物比原花青素純化物的抑菌效果更強,表兒茶素相對于兩種提取物而言抑菌作用最弱。可能的原因是原花青素純化前大分子蛋白質,有機酸類物質等對微生物也有一定的抑菌作用;另一原因是由于多酚類物質協同效應,多種酚類物質共存會增加某一種酚類原有的活性,即總酚可能比單獨某種酚類物質的抑菌效果要好[20],從而純化前比純化后的原花青素樣品抑菌作用更強。

3 結論

經響應面優化得出黑果腺肋花楸原花青素最佳提取工藝參數為乙醇濃度62%,液料比25∶1 mL/g、提取溫度72 ℃,提取時間60 min。在此條件下提取的黑果腺肋花楸原花青素含量為3.32%;經AB-8大孔樹脂純化后,原花青素濃度由純化前的3.32%提高到14.29%,原花青素含量約提高4倍,說明AB-8大孔樹脂可以很好地分離純化黑果腺肋花楸原花青素。

抑菌性實驗表明黑果腺肋花楸原花青素對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有一定的抑制作用,抑菌作用大小依次為枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>釀酒酵母;純化前的原花青素樣品具有更強的抑菌作用,且隨濃度提高抑菌作用增強。

目前,國外關于黑果腺肋花楸多酚類物質的研究已取得階段性進展,而國內對其研究仍處于起步階段,本文首次研究黑果腺肋花楸原花青素的提取純化工藝并探究其抑菌性質。為我國黑果腺肋花楸產業的發展提供依據。

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Extraction and antibacterial activity of procyanidins fromAroniamelanocarpa

ZHU Yue,LI Fen-mei,WANG Yan-li,ZHU Ning,ZHANG Hai-ping,AN Jian-hui,SUN Ai-dong*

(Key Loboratory of Forestry Food Processing Security,College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing 100083,China)

Response surface methodology was employed to optimize the extraction conditions of procyanidins fromAroniamelanocarpaand antibacterial activity was researched by Oxford-cup tests. Results indicated that the optimum extractive conditions were determined as follows:ethanol concentration 62%,liquid to solid ratio 25∶1 mL/g,extraction temperature 72 ℃,extraction time 60 min,the content of procyanidins through this optimized procedure was 3.32%. The content of procyanidins were four times as much purification as crude extracts after the treatment by AB-8 macroporous resin,which content of procyanidins was 14.29%. Bacteriostatic experiment of procyanidins from black chokeberry on several strains tested showed antimicrobial effect as follows:Bacillussubtilis>Staphylococcusaureus>Escherichiacoli>Saccharomycescerevisiae. Antibacterial activity increased with increasing of procyanidins concentration and crude extracts ofAroniamelanocarpaprocyanidins had better antibacterial activity.

Aroniamelanocarpa;procyanidins;extraction and purification;antibacterial activity

2016-08-12

朱月(1993-),女,在讀碩士研究生,研究方向:天然產物與功能性食品,E-mail:zhuyue1109@163.com。

*通訊作者:孫愛東(1968-),女,教授,研究方向:天然產物生理活性物質的開發與利用,E-mail:adsun68@163.com。

國家自然基金項目(31471593)。

TS255.1

B

1002-0306(2017)02-0302-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.050