響應面優化銀耳結締多糖提取工藝與抗氧化活性研究

師 萱,程曉慶,楊 勇,譚紅軍,梁旭明,*,石文娟,蘇智敏,

(1.重慶市中藥研究院,重慶 400065;2.海南大學食品學院,海南海口 570228;3.重慶市銀耳營養食品企業工程技術研究中心,重慶 409003)

響應面優化銀耳結締多糖提取工藝與抗氧化活性研究

師 萱1,程曉慶2,楊 勇1,譚紅軍1,梁旭明1,*,石文娟3,蘇智敏1,3

(1.重慶市中藥研究院,重慶 400065;2.海南大學食品學院,海南海口 570228;3.重慶市銀耳營養食品企業工程技術研究中心,重慶 409003)

利用單因素實驗結合響應面Box-Benhnken實驗設計對銀耳結締多糖提取工藝進行優化。對所得粗多糖初步純化后進行結構特征和抗氧化活性研究。結果表明,銀耳結締多糖最佳工藝條件為提取溫度92 ℃,提取時間4.2 h,液料比41∶1(mL/g),多糖提取得率為(23.41±0.92)mg/g,與預測值相對誤差較小(1.07%)。抗氧化活性分析表明,銀耳結締多糖對DPPH自由基、ABTS+自由基的清除率和還原能力呈濃度-效應關系,其在三種體系中的EC50值分別是6.59、4.04和4.94 mg/mL,說明銀耳結締多糖具有較強的抗氧化能力。

銀耳結締,多糖,響應面優化,抗氧化活性

銀耳(Tremellafuciformis)是一種名貴藥食兩用菌,具有滋補生津、潤肺養胃的功效[1]。我國是銀耳生產大國,主產集中在四川通江地區和福建等地,隨著銀耳栽培技術的發展,促使我國銀耳產量大幅提高,產值也躍居于世界前列。銀耳多糖是銀耳中的主要成分,研究表明,銀耳多糖與其具有的抗腫瘤[2]、抗氧化[2-4]、降血脂[3-4]、抗輻射[5]、減肥[6]、促進傷口愈合[4,7]、增強機體免疫力及預防腸道疾病[3-4,7]等多種藥理活性有關。

自日本學者首次從銀耳子實體中提取出多糖之后,銀耳多糖提取工藝的研究越來越受關注,采用的提取方法有溶劑提取法(熱水、酸和堿)、酶法、超聲波輔助、微波輔助提取、高壓蒸煮技術和高壓脈沖電場輔助等[1,8-11]。其中熱水浸提法是目前最為廣泛應用的一種技術,但有關銀耳多糖熱水浸提法工藝優化研究多采用“正交實驗設計法”,致使其僅限于局部區域考察實驗影響因素水平,很難全面反映影響因素的實際情況。而響應面分析法通過建立復雜多維空間曲面,直接反映出因素之間的交互作用對多糖提取率的影響,更能促使實驗結果接近實際[12]。

隨著銀耳栽培和加工技術的發展,銀耳爛菇、殘次和結締頭等廢料也越來越多,銀耳加工廢料不及時或者不適當地處理,多數情況未經處理而直接丟棄[13],既會嚴重污染生產生活的環境,又造成極大的資源浪費。因此如何正確處理和綜合利用銀耳加工廢料有待于進一步的開發和研究。鑒于此,本實驗采用單因素實驗與Box-Behnken設計法對銀耳結締多糖提取工藝進行優化,旨在建立銀耳結締多糖提取的二次回歸模型、確定最佳提取工藝,在此基礎上對結構和體外抗氧化活性進行了分析測定,以便為銀耳加工廢料正確處理、功能活性的深入研究、產業化應用和綜合利用提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀耳 于2015年11月份購于重慶市南山路農貿市場,取銀耳結締,用萬能粉碎機粉碎,過40目篩,置于干燥瓶中備用;葡萄糖、無水乙醇、濃硫酸、苯酚、三氯乙酸、鹽酸、氫氧化鈉 以上均為分析純,購于廣州化學試劑廠。

HH-4型數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;TDZ5-WS多管架自動平衡離心機 上海奧普勒儀器有限公司;754NPC紫外可見分光光度計 上海奧譜勒儀器有限公司;DHG-9070A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;RE52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;EL204電子分析天平 梅特勒有限-托利多儀器(上海)有限公司;300Y多功能粉碎機 伯歐五金廠;Nicolet 6700型傅立葉紅外光譜儀 Thermo scientific,USA。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀耳結締粗多糖提取工藝流程 銀耳結締粉末→熱水浸提法提取銀耳結締粗多糖→過濾→濾液濃縮→醇沉(無水乙醇)→離心→沉淀物→除蛋白(Sevage試劑)→干燥→銀耳結締粗多糖干品[14]。

1.2.2 多糖含量的測定 采用硫酸-苯酚法[15]。

1.2.2.1 標準曲線的繪制 采用蒸餾水分別配制成含量為0、12、24、36、48、60 μg/mL的葡萄糖標準溶液。然后加1.0 mL 6%苯酚溶液,搖勻,迅速滴加入5.0 mL濃硫酸,搖勻冷卻,室溫放置20 min,于490 nm測吸光值,以2.0 mL蒸餾水按同樣顯色操作作為空白對照,以濃度C(μg/mL)為橫坐標,吸收度A為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程:A=0.01449C-0.00337,R2=0.9999。

1.2.2.2 銀耳結締粗多糖提取得率的測定 按照王婉冰等的方法[15],精確稱取提取物,按照標準曲線繪制方法用硫酸-苯酚法測定吸光度值代入標準曲線方程中,得其多糖含量,粗多糖提取率按下式計算：

粗多糖提取得率(mg/g)=多糖含量測定值×稀釋倍數×提取物質量/原料質量

1.2.3 單因素實驗設計 研究不同液料比、提取溫度和提取時間對銀耳結締多糖提取效果的影響。具體內容:精確稱取0.5 g左右銀耳結締粉末,在提取時間4 h、液料比為40∶1(mL/g)條件下,探討不同提取溫度(60、70、80、90和100 ℃)對銀耳結締多糖提取率的影響;在提取溫度90 ℃、液料比為40∶1條件下,探討不同提取時間(1、2、3、4、5和6 h)對銀耳結締多糖提取率的影響;在提取溫度90 ℃、提取時間為4 h條件下,探討不同液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1和60∶1 mL/g)對銀耳結締多糖提取率的影響。

1.2.4 響應曲面優化實驗設計 在單因素實驗的基礎上根據響應面Box-Behnken設計原理選取提取溫度(X1)、提取時間(X2)和液料比(X3)3個因子優化銀耳結締多糖提取工藝,因素水平見表1。以多糖提取得率(Y)為響應值,用SAS 8.0軟件對實驗結果進行回歸分析建立數學模型,以確定銀耳結締多糖的最佳提取工藝條件。

表1 Box-Behnken響應面設計實驗因子與水平Table 1 Variables and levels of Box-Behnken response surface design

1.2.5 傅里葉紅外光譜(FTIR)分析 取傳統水浸提法所得銀耳結締多糖樣品(2.0 mg)按照1∶100的比例與KBr固體粉末(200 mg)混合均勻后,在紅外燈下將樣品與KBr粉末在研缽中混勻并充分研磨,然后利用真空壓片機進行壓片,采用傅立葉紅外光譜儀(Thermo scientific,USA)中進行紅外光譜測定,掃描范圍4000～400 cm-1,掃描分辨率2 cm-1,掃描次數20次,分析銀耳結締多糖的結構。

1.2.6 銀耳結締多糖抗氧化活性研究

1.2.6.1 ABTS+自由基清除能力的測定 參照Pellegrini等的方法[16],并略作修改。將7 mmol/L ABTS溶液和2.4 mmol/L過硫酸鉀溶液等量混合并在室溫、避光條件下反應12 h,然后用60 mL 95%乙醇稀釋1 mL ABTS儲備液,得到在室溫下于734 nm波長下的吸光度為0.700±0.001的工作液(A0)。取0.3 mL不同濃度的銀耳結締多糖溶液(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg/mL)與2.7 mL ABTS工作液反應30 min后,在734 nm波長下測定其吸光值(A1),記為樣品吸光值。按照公式(1)計算清除率:

ABTS+自由基清除率(%)=(A0-A1)/A0×100

式(1)

1.2.6.2 DPPH自由基清除能力的測定 參照Hanato等的方法[17],并略作修改。分別將0.3 mL不同濃度銀耳結締多糖溶液(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg/mL)加入不同比色管中,然后取2.7 mL濃度為40 μg/mL的DPPH溶液于各比色管中,振蕩使其充分混合均勻,在室溫下靜置60 min。之后,在波長517 nm處測定混合液的吸光值(A1)。用2.7 mL DPPH溶液與0.3 mL溶劑混合,靜置60 min后,在波長517 nm處檢測其吸光值(A0)。按照公式(2)計算清除率:

DPPH自由基清除率(%)=[A0-A1]/A0×100

式(2)

1.2.6.3 還原能力的測定 參照Oyaizu等的方法[18],并略作修改。將2.5 mL銀耳結締多糖溶液(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg/mL)分別與2.5 mL 0.2 mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖溶液混合,再加入1.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液在50 ℃下水浴30 min。然后加入2.5 mL 10%三氯乙酸,混勻后在3000 r/min下離心10 min,取上清液2.5 mL與2.5 mL蒸餾水、0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液混合,靜置10 min后在700 nm下測定其吸光值。

1.2.7 數據統計 每組實驗均重復3次,利用SPSS 21.0統計軟件(SPSS公司,芝加哥,美國)對數據進行統計分析。采用Graphpad prism5.0和Origin8.0畫圖軟件對實驗數據進行畫圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 不同提取溫度對銀耳結締多糖提取得率的影響 由圖1可以看出,銀耳結締多糖提取得率隨溫度的變化呈先增大后減小趨勢,在90 ℃左右時達到最大值,為(23.36±1.31) mg/g,且與其他提取溫度對銀耳結締多糖提取得率的影響差異顯著(p<0.05)。可能是由于提取溫度的升高可增加多糖的溶解性[19]。當提取溫度超過90 ℃后銀耳結締多糖提取得率呈下降趨勢,其原因可能是提取溫度過高時會導致多糖分子降解或破壞而導致銀耳結締多糖含量減少[20]。因此選擇銀耳結締多糖的提取溫度為90 ℃,研究結果與周帥飛等[21]銀耳子實體多糖提取研究基本一致,傳統的熱水浸提法提取銀耳多糖,當料水比1∶40(g/m L),溫度90 ℃,時間3 h,提取次數為2次時,銀耳多糖的提取率為16.63%。

圖1 不同提取溫度對銀耳結締多糖提取得率的影響Fig.1 Effect of different extraction temperature on the yield of Tremella fuciformis pedicel(TPP)注:圖中不同的小寫字母表示在0.05水平上差異顯著(n=3),圖2、圖3同。

2.1.2 不同提取時間對銀耳結締多糖提取得率的影響 由圖2可知,銀耳結締多糖提取得率隨提取時間的延長呈先升高而后降低的趨勢。在1 h到4 h之間,銀耳結締多糖提取得率隨時間的延長而升高,而在4 h到6 h之間,銀耳結締多糖提取得率則隨時間的延長而降低。即在提取時間為4 h時,銀耳結締多糖提取得率達到峰值。其原因可能是提取時間過短,銀耳結締多糖不能被充分提取;而過長會導致多糖降解和蛋白質等雜質的產生而降低,因而選擇銀耳結締多糖提取時間為4 h。

圖2 不同提取溫度對銀耳結締多糖提取得率的影響Fig.2 Effect of different extraction time on the yield of TPP

2.1.3 不同液料比對銀耳結締多糖提取得率的影響 由圖3可以看出,液料比在20∶1和40∶1之間銀耳結締多糖提取得率隨液料比的增大而提高,在40∶1和60∶1之間則快速降低,即在40∶1時銀耳結締多糖提取得率達到峰值后下降,并與其他處理差異顯著。其原因可能是液料比過小不僅會導致多糖溶解不完全,也不利于多糖的溶出,并且也會導致后續醇沉等工藝難度加大,從成本節約角度考慮選擇液料比為40∶1(mL/g)。

圖3 不同料液比對銀耳結締多糖提取得率的影響Fig.3 Effect of different liquid-solid ratio on the yield of TPP

2.2 響應面優化實驗結果

2.2.1 響應面回歸模型的建立與分析 以銀耳結締多糖提取得率為指標,采用響應面優化銀耳結締多糖提取工藝的實驗結果見表2。采用SAS8.0對實驗數據進行回歸擬合分析,可得到提取條件與以銀耳結締多糖提取得率之間的二次多項式模型為:Y=23.16667+3.22625X1+0.385X2+1.38625X3-7.434583X12+0.745X1X2- 0.7575X1X3-1.892083X22+0.37X2X3-4.109583X32。式中,Y為銀耳結締多糖提取得率的預測值;X1、X2、X3分別代表提取溫度、液料比和提取時間的編碼值。

表3 回歸方程系數顯著性檢驗表Table 3 Test of significance for regression equation coefficients

注:*差異顯著(p<0.05),**差異極顯著(p<0.01)。

表2 響應面實驗設計與結果Table 2 Response surface experimental design and results

回歸方程各項方差分析表明X12因素對銀耳結締多糖提取得率有極其顯著的影響(p<0.01),X1和X32因素對銀耳結締多糖提取得率有顯著的影響(p<0.05),而因子X2、X3、X22、X1X2、X1X3和X2X3對銀耳結締多糖提取得率影響不顯著(p>0.05)。各因子對銀耳結締多糖提取得率的影響依次是X1(提取溫度)>X3(提取時間)>X2(液料比)。

2.2.2 驗證實驗 經SAS8.0軟件分析X1、X2和X3的代碼值分別為0.217、0.160和0.156,將這三個值代入變換式,得到與之相對應理論組合值為:92.17 ℃、40.8∶1和4.16 h。為檢驗模型預測的準確性,方便實際操作,將最佳條件調整為:提取溫度92 ℃、提取時間4.2 h、液料比41∶1(mL/g),理論計算提取得率達到23.66 mg/g。在此條件下進行驗證實驗,銀耳結締多糖提取得率為(23.41±0.92) mg/g,與模型預測值的相對誤差為1.07%。表明實驗所得回歸方程的最大預測值與驗證值非常接近,說明回歸方程能較真實地反映各篩選因素的影響,建立的模型與實際情況比較吻合。值得一提的是,本實驗方法所得銀耳結締的多糖提取得率23.41 mg/g,要明顯低于同樣采用傳統熱水浸提法所得銀耳子實體的多糖含量166.30 mg/g。這可能與提取方法,特別是與銀耳多糖不同部位中多糖含量不同有關,由于銀耳結締中的纖維素含量相對銀耳子實體更高,致使銀耳結締中多糖含量要明顯低于銀耳子實體中多糖的含量[21]。

2.3 銀耳結締多糖紅外光譜分析結果

由圖4可以看出,銀耳結締多糖在3400 cm-1附近即3445.09 cm-1處有較強且寬的吸收峰,而3400 cm-1是多糖分子間或分子內O-H的伸縮振動峰,表明此處是O-H鍵的伸縮振動;2920 cm-1附近的吸收峰是-CH3與=CH2的C-H伸縮振動,而銀耳結締多糖在2924.68 cm-1處出現吸收譜帶,表明銀耳結締多糖存在-CH3與=CH2的C-H鍵的伸縮振動;1400～1200 cm-1之間則是烷基C-H的變角振動吸收峰;以上三個吸收峰可以證明該樣品為多糖類化合物[22]。1720 cm-1附近即1724.08 cm-1處出現了吸收峰,則表示銀耳結締多糖中存在C-O彎曲糖醛酸的振動。1418cm-1附近即1419.43 cm-1處出現了吸收峰,則表示銀耳結締多糖中存在-COO-中的C=O對稱伸縮振動,1076 cm-1附近即1077.77 cm-1處出現了強寬峰,則銀耳結締多糖中存在吡喃型糖環,918 cm-1附近即917.96 cm-1出現了弱吸收峰,則表明銀耳結締多糖中存在吡喃環非對稱環伸縮振動的特征峰,而799 cm-1附近即798.40 cm-1處出現的弱吸收峰,則證明銀耳結締多糖中存在甘露糖殘基。此外,在920 cm-1和800 cm-1處吸收峰分別表示與之對應的是β-糖苷鍵和α-糖苷鍵[23-25],在608.84 cm-1處出現強吸收譜帶,此處為-NH2的伸縮振動。綜合以上條件分析可得出結論,銀耳結締多糖可能含有酸類、胺類、醇類化合物等[26-27]。

表4 銀耳結締多糖清除自由基EC50值Table 4 The EC50 values of scavenging capacities for free radicals of polysaccharides from Tremella fuciformis pedicel

圖4 銀耳結締多糖的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of polysaccharides from Tremella fuciformis pedicel

2.4 銀耳結締多糖抗氧化活性分析結果

銀耳結締多糖分別在DPPH自由基清除體系、ABTS+自由基清除體系和Fe3+-Fe2+氧化還原體系中抗氧化活性測定結果見表4。由表4可知,在所選質量濃度范圍內,銀耳結締多糖對DPPH自由基、ABTS+自由基的清除率和還原能力均隨著質量濃度的提高而增大,表明呈濃度-劑量效應關系。銀耳結締多糖在三種體系中的EC50值分別是6.59、4.04和4.94 mg/mL,表明銀耳結締多糖在三種評價體系中抗氧化能力強弱存在較大差異,相比較而言,銀耳結締多糖在ABTS自由基清除體系中的抗氧化能力表現最好。但銀耳結締多糖的抗氧化活性要低于文獻報道的銀耳多糖,如吳振等報道熱風干燥銀耳多糖的DPPH和還原力的EC50分別為2.19 mg/mL和3.48 mg/mL[28]。其原因是可能一方面與銀耳結締多糖為粗多糖有關,同時還可能與原料品種和部位有關,因為本實驗選用原料為市場上直接購買的干銀耳的結締,銀耳原料干制工藝不清楚,因而難以判斷銀耳品質。如國內外研究發現,真菌多糖的理化組成、水溶性等理化性質、分支度、分子量大小、黏度和高級螺旋結構等與其生物活性功能聯系密切,并受到樣品處理方法、提取工藝和干燥方法三大類因素的影響[4,29]。此外,吳振等的研究還表明,傳統熱風干燥相比于冷凍干燥和抽真空干燥對銀耳多糖的抗氧化活性影響更大[28],類似的研究在白樺茸多糖和靈芝多糖上也有發生,說明傳統高溫干燥破壞了真菌多糖的品質和活性[30]。

3 結論

本研究采用單因素與響應面實驗設計對銀耳結締多糖常規水提醇沉法的提取工藝參數進行了優化,影響銀耳結締多糖提取得率的主次順序為提取溫度>提取時間>液料比,實驗優化所得銀耳結締多糖熱水提取工藝條件為提取溫度92 ℃、提取時間4.2 h和液料比41∶1(mL/g),在此條件下所得銀耳結締多糖實際提取得率為(23.41±0.92) mg/g。在此基礎上對所得銀耳結締多糖除蛋白(Sevage試劑)后,進一步利用紅外光譜和體外抗氧化體系分別對銀耳結締多糖的結構和抗氧化活性進行了分析測定,結果顯示銀耳結締多糖對ABTS+和DPPH自由基均具有較好的清除作用,其EC50分別為4.04和6.59 mg/mL,同時,銀耳結締多糖還具有較強的還原力(EC50為4.94 mg/mL)。此外,銀耳結締中纖維素含量相對較高,這些可能是引起銀耳結締多糖抗氧化活性偏低的原因,但具體什么原因還有待于進一步深入研究。

值得一提的是,在生產過程中銀耳結締多作為下腳料而丟棄,本實驗所得粗多糖提取工藝簡單、可重復性強,因而具有較高的開發利用前景。

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Optimization the extraction process of polysaccharide by response surface methodology from theTremellafuciformispedicel and its antioxidant activity

SHI Xuan1,CHENG Xiao-qing2,YANG Yong1,TAN Hong-jun1,LIANG Xu-ming1,*,SHI Wen-juan3,SU Zhi-min1,3

(1.Chongqing Academy of Chinese Materia Medica,Chongqing 400065,China;2.College of Food Science,Hainan University,Haikou 570228,China;3.Chongqing Engineering Research Center for Tremella Nutrition Food Enterprises,Chongqing 409003,China)

Optimization of hot water extraction of polysaccharide fromTremellafuciformispedicel(TPP)were investigated using the single-factor test and the response surface methodology(RSM)in the paper. The property structure and antioxidant activities of TPP were analyzed after the crude polysaccharide was preliminarily separated by Sevage method. The results showed that the optimum technological conditions were extraction temperature 92 ℃,extraction time 4.2 h,liquid-solid ratio of 41∶1(mL/g),and the yield of TPP achieved the maximum of(23.41±0.92) mg/g. The evaluation of antioxidant activity suggested that TPP exhibited good antioxidant activity,and there was a certain dose-effect relation between polysaccharide concentration and eliminating rate. The EC50for reducing power and scavenging activities against ABTS+and DPPH radical were 4.94,4.04,and 6.59 mg/mL,respectively.

Tremellafuciformispedicel;polysaccharides;response surface methodology;antioxidant activity

2016-08-09

師萱(1980-)，女，碩士，助理研究員，主要從事天然產物及保健食品研究與開發方面的研究，E-mail：shixuan0932@126.com。

*通訊作者:梁旭明(1979-)，男，博士，副研究員，主要從事中藥新藥研發和天然產物方面的研究，E-mail：Liangxuming2004@yahoo.com.cn。

重慶市基本科研業務費計劃項目(2014cstc-jbky-01902)。

TS255.1

B

1002-0306(2017)02-0297-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.049