如意草生物堿提取及抑菌活性研究

楊園園,史 娟,徐添鑫

(陜西理工大學化學與環境科學學院,陜西漢中 723000)

如意草生物堿提取及抑菌活性研究

楊園園,史 娟*,徐添鑫

(陜西理工大學化學與環境科學學院,陜西漢中 723000)

通過采用單因素及正交實驗,以如意草中生物堿的光吸收值為指標進行檢測,優化如意草生物堿的最佳提取工藝為:以乙醇為溶劑時,乙醇濃度75%,料液比1∶10,超聲時間120 min,超聲溫度40 ℃。在此條件下,如意草生物堿提取率最高,達到1.656%。此外,研究了如意草生物堿對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌的抑菌活性,實驗結果表明:如意草生物堿對四種供試菌種均有明顯抑制作用,對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌最低抑菌濃度分別為40、50、40、50 μg/mL。

如意草,生物堿,超聲波提取,抑菌活性

如意草(CorydalistaliensisFr.)是罌粟科紫堇屬植物,別名大理紫堇、斷腸草、水黃連、水如意、五味草,主要分布于四川、貴州、云南等地。如意草味苦,性寒,歸肺、肝經,具有祛風、清熱、止痛和清肝明目等作用[1]。罌粟科植物富含生物堿,全世界有43個屬,約700種,主要分布在北溫帶[2]。目前,如意草中已被鑒定有出含有七個生物堿[3],包括紫堇靈堿(corynoline)、原阿片堿(protopine)、乙酰紫堇靈(acetylcorynoline)、消旋紫堇靈(±)corynoline、必枯枯靈bicucline等,并被證實具有抗菌、鎮靜及保護肝臟損傷等多種活性作用[4]?，F代研究發現,如意草中含有的生物堿成分,如原阿片堿、乙酰紫堇靈、紫堇靈堿等多具有廣泛的藥理活性[5],是許多中草藥及藥用植物的有效成分[6-8],具有消炎、抗菌[9]等多種特點。國外最新報道,紫堇靈生物堿在抗壞血病問題上有較大潛力,而乙酰紫堇靈通過抑制樹突狀細胞的功能有望成為提高免疫力的藥劑之一[10-12]。生物堿常用的提取方法有水或偏酸性水溶液提取、醇提法[13]、親脂有機溶劑提取法、超聲波提取法[14]。

國內對如意草的研究報道較少,利用超聲技術對如意草中生物堿類物質的提取還未見文獻報道。超聲波提取法能提高有效成分的溶出速度和溶出次數、縮短提取時間、節省溶劑的消耗、提取率高[15],本文采用超聲波提取法提取如意草中的生物堿,同時對超聲波提取工藝進行探討,采用正交實驗優選出最佳提取條件,為如意草生物堿的開發和利用提供客觀的實驗數據。

近年來,國內對如意草生物堿的抑菌作用還未見文獻報道。為了更好地開發利用如意草資源,本文采用幾種常用的抑菌方法(尹愛武[16]、何水平[17]等人在抑菌實驗中的研究)對如意草生物堿對四種供試菌種的抑菌作用進行探索,為如意草生物堿的進一步研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

如意草 2014年10月份采自陜西省榆林山區,清洗去雜后置于烘箱內50 ℃下烘干至恒重,粉碎成60目后,裝袋放置備用;鹽酸小檗堿標準品 上海金穗生物科技有限公司;無水乙醇、溴甲酚綠、檸檬酸、檸檬酸鈉、氯仿等試劑 均為分析純;胰蛋白胨、酵母粉、NaCl、瓊脂粉 北京奧博星生物技術有限責任公司;革蘭氏陽性菌:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis);革蘭氏陰性菌:大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella) 陜西理工學院生物工程學院微生物實驗室。

AL204-IC電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;Cary50型紫外可見分光光度計 美國瓦里安中國有限公司;DGG-9140B型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司;RE-2A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;FW100型高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公;SW-CJ-IB型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;SHP-80型生化培養箱 上海森德實驗儀器有限公司;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;SB3200DTDN超聲波清洗機 寧波斯芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹽酸小檗堿標準曲線的繪制 準確稱取3.75 mg鹽酸小檗堿標準品,溶于少量蒸餾水中定容至25 mL,配成150 mg/L的鹽酸小檗堿標準溶液。準確吸取鹽酸小檗堿標準溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL移入25 mL刻度比色管中,分別加入1 mL蒸餾水、2 mL溴甲酚綠緩沖溶液(檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液配制的0.04%溴甲酚綠溶液)、4 mL pH為5.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液及5 mL三氯甲烷,充分振蕩搖均勻后靜置1 h觀察,以三氯甲烷做為參比,在414 nm處測定不同濃度鹽酸小檗堿的吸光度,得到鹽酸小檗堿濃度C(mg/mL)與吸光度A的回歸方程。

1.2.2 如意草生物堿的提取方法 稱取一定質量的如意草粉末,加入75%乙醇溶液作為溶劑浸泡12 h后,用超聲波提取、抽濾,收集濾液,將濾液旋轉蒸發濃縮得到浸膏,再用檸檬酸溶解浸膏,調其pH至2.5,再用無水Na2CO3調pH至10.5,即得到粗產物生物堿沉淀,離心后棄去上層清夜,在下層沉淀中加入10 mL乙醇溶解[18-21],在414 nm處測其吸光度并計算提取率。

如意草生物堿提取率(%)=(C×V×n)/m×100

其中,C為如意草生物堿濃度,V為提取體積,n為稀釋倍數,m為原料質量。

1.2.3 如意草生物堿的單因素實驗 以如意草生物堿的吸光值為指標,分別考察乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度4個因素對提取率的影響,每個因素設定5個梯度,進行單因素實驗,各單因素實驗重復3次,并取平均值。

1.2.3.1 乙醇濃度對生物堿提取率的影響 準確稱取2 g如意草粉末5份,置于5個錐形瓶中,按1.2.2中的方法超聲波提取,在料液比1∶25,超聲時間120 min,超聲溫度70 ℃的條件下,改變乙醇濃度為55%、65%、75%、85%、95%,考察乙醇濃度對生物堿吸光度的影響。

1.2.3.2 料液比對生物堿提取率的影響 準確稱取2 g如意草粉末5份,置于5個錐形瓶中,以85%乙醇為溶劑,固定超聲溫度70 ℃,超聲時間120 min,改變料液比為1∶10、1∶20、1∶25、1∶35、1∶45,考察料液比對生物堿吸光度的影響。

1.2.3.3 超聲時間對生物堿提取率的影響 準確稱取2 g如意草粉末5份,置于5個錐形瓶中,以85%乙醇為溶劑,固定料液比1∶20,超聲溫度70 ℃,改變超聲時間為60、90、120、150、180 min,考察超聲時間對生物堿吸光度的影響。

1.2.3.4 超聲溫度對生物堿提取率的影響 準確稱取2 g如意草粉末5份,置于5個錐形瓶中,以85%乙醇為溶劑,固定料液比1∶20,超聲時間120 min,改變超聲溫度為40、50、60、70、80 ℃,考察超聲溫度對生物堿吸光度的影響。

1.2.4 如意草生物堿的正交實驗 在單因素實驗的基礎上,以乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間和料液比為因素,設計L9(34)實驗以確定如意草生物堿提取的最佳工藝條件,各因素水平的設定如表1所示。

表1 L9(34)正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34)orthogonal experiments

1.2.5 如意草生物堿抑菌活性實驗

1.2.5.1 如意草生物堿的制備 取如意草粉末5 g,加入50 mL 75%乙醇,超聲時間120 min、超聲溫度40 ℃,此時如意草生物堿的濃度為100 mg/mL,將得到的如意草生物堿取100 μL用無菌水稀釋配制成濃度分別為0.05、0.2、0.3、0.8、1.07 mg/mL的如意草生物堿濃度溶液,此時乙醇的體積在溶液中含量不足百分之一可以忽略其對抑菌的影響。

1.2.5.2 菌懸液的制備 在超凈工作臺中,將四種供試菌種用接種環挑取單個菌落分別接種于LB液體培養基中,于37 ℃在搖床上振蕩培養24 h進行菌種活化,挑取活化的菌種于平板LB固體培養基中進行菌種分離純化(防止實驗過程中的交叉感染應定期純化菌種,使實驗更加準確可靠),用接種環挑取單個菌落再次接種于LB液體培養基中,對純化的菌液進行活菌計數,最后將菌液稀釋配制成含菌量106cfu/mL的菌懸液,備用。

1.2.5.3 牛津杯法測定如意草生物堿抑菌效果 將已干燥滅菌的不銹鋼牛津杯(內孔直徑為6 mm)用無菌鑷子夾取平放在含菌平板上,每個含菌平板上呈“品”字形放置3個牛津杯,分別在每個牛津杯中加入200 μL(濃度為1.07、0.8、0.3、0.2、0.05 mg/mL)的如意草生物堿,無菌水做對照,每個濃度做3個重復。將平板置于37 ℃下培養24 h,取出后測量牛津杯抑菌圈直徑,每組測定6次取其平均值。

1.2.5.4 如意草生物堿最低抑菌濃度(MIC)測定 參考微量肉湯稀釋法[22-23],對如意草生物堿進行MIC的測定。將如意草生物堿樣品溶解在無菌水中,配制成樣品質量濃度為1 mg/mL,經計算,得到系列如意草生物堿質量濃度為:30、40、50、60、70 μg/mL。實驗組每支試管加入20 μL菌液及一定體積的LB液體培養基和一定體積的樣品(表2),對照組只加20 μL菌液100 μL無菌水和100 μL的LB液體培養基。將試管置于37 ℃的搖床上振蕩培養16～18 h,取出,觀察試管中液體的渾濁情況。液體澄清的為無菌生長,渾濁的為有菌生長。以第幾號試管以下不再發生明顯渾濁現象,這一試管的濃度即為該細菌的最低抑菌濃度(MIC)。

表2 如意草生物堿的試管實驗Table 2 Test on alkaloids of Corydalis taliensis Fr.

1.3 數據分析

實驗數據均為3次重復,取平均值,數據分析采用Origin8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 鹽酸小檗堿標準曲線

以鹽酸小檗堿濃度C(mg/mL)為橫坐標,吸光度A為縱坐標,得到標準曲線回歸方程式為:A=2.18452C-0.38939,R2=0.99326,表明鹽酸小檗堿的濃度(mg/mL)與吸光度有良好的線性關系,可將其用于提取率的測定中。

2.2 單因素實驗結果

2.1.1 最佳乙醇濃度的選擇 以吸光值為指標,如意草生物堿的吸光度越大提取率就越高。如圖1所示,在乙醇濃度為55%～85%內,隨著乙醇濃度的增大,如意草生物堿的吸光度逐漸增大,這是因為生物堿類物質較易溶于乙醇,乙醇濃度越大,如意草生物堿的溶出效果越好。當乙醇濃度為85%時,如意草生物堿測得的吸光度最大。但當乙醇濃度過高時,吸光度下降,可能是因為乙醇濃度過高,其它一些醇溶性雜質溶出也增多,影響了如意草生物堿的溶出。因此提取如意草生物堿時,選擇乙醇濃度為85%最佳。

圖1 不同乙醇濃度的提取效果Fig.1 Results of different ethanol concentration

2.1.2 最佳料液比的選擇 從圖2可知,如意草生物堿的吸光度隨著料液比增加先是大幅度升高,然后逐漸呈現不同幅度的下降,料液比在1∶20時,如意草生物堿的吸光度達到最大值,之后隨料液比的增大而不斷降低,這是由于在一定范圍內增加提取劑用量過大反而不利于如意草生物堿的溶出,從而造成影響提取效果;而溶劑過多則會吸收超聲波輻射能力,因而影響生物堿的溶出,從而影響產率。故選擇料液比1∶20最佳。

圖2 不同料液比的提取效果Fig.2 Results of different material/liquid ratio

2.1.3 最佳超聲時間的選擇 從圖3可以看出,在一定范圍內,如意草生物堿的吸光度隨超聲時間的延長而不斷提高,但當超聲時間超過120 min后,提取率逐漸變小,這可能是因為較長時間的超聲處理影響了部分如意草生物堿的組成及結構,并且隨著時間的延長,溶劑揮發也越多,進一步影響提取率。故選擇120 min為最佳超聲時間。

圖3 不同超聲時間的提取效果Fig.3 Extraction effect of different ultrasonic time

2.1.4 最佳超聲溫度的選擇 從圖4可以看出,超聲溫度為40～50 ℃時,如意草生物堿的吸光度隨溫度的升高而增大,溫度高于50 ℃時,吸光度下降。這是由于溫度過高,溶劑揮發損失,導致生物堿提取不完全,也可能會破壞如意草中的一些成分結構。因此,選擇50 ℃為最佳超聲溫度。

圖4 不同超聲溫度的提取效果Fig.4 Extraction effect of different ultrasonic temperature

2.2 正交實驗結果

2.2.1 正交實驗結果 由表3可知,各因素對如意草生物堿吸光度的影響大小是D>C>B>A,即超聲溫度>超聲時間>料液比>乙醇濃度。如意草生物堿的最佳提取工藝條件是A1B1C2D1,即乙醇濃度為75%,料液比為1∶10,超聲時間為120 min,超聲溫度為40 ℃。由表4方差分析結果可知,F比

表5 不同濃度的如意草生物堿的抑菌效果Table 5 Antibacterial effect of different concentration on alkaloids of Corydalis taliensis Fr.

注:6.00 mm(牛津杯內徑),表示未觀察到明顯抑菌圈。

表3 正交實驗結果Table 3 Orthogonal test design and results

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.2.2 驗證性實驗 為了進一步考察上述優選工藝的穩定性,按上述最佳條件:乙醇濃度為75%,料液比為1∶10,超聲時間為120 min,超聲溫度為40 ℃,進行三次平行實驗。用紫外可見分光光度計測定其吸光度值為5.641,并計算出如意草生物堿的提取率,得到的平均提取率為1.656%。

2.3 牛津杯法測定如意草生物堿的抑菌活性

2.3.1 如意草生物堿的抑菌效果 以牛津杯法測定的抑菌圈直徑為指標,評價如意草生物堿對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏菌的抑菌效果[24]:無抑菌圈者為抑菌效果不明顯、抑菌圈直徑7～9 mm為低度抑菌、抑菌圈直徑10～15 mm為中度抑菌、抑菌圈直徑>15 mm為高度抑菌。如意草生物堿對四種供試菌種的抑菌效果見表5,由表5可知如意草生物堿對2種具有致密細胞壁的革蘭氏陽性菌和2種細胞壁較疏松的革蘭氏陰性菌都有不同程度的抑菌作用,具有抑菌活性。此外,如意草生物堿對枯草芽孢桿菌的抑制效果最強,對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑制作用相當,對沙門氏菌的抑制能力較差。隨著提取物濃度的增大,其抑菌活性逐漸增強。由此可見,如意草生物堿具有一定的抑菌能力。

2.3.2 如意草生物堿最低抑菌濃度(MIC)的測定 如意草生物堿對四種細菌的最低抑菌濃度如表6所示,由表6中可知,如意草生物堿對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌濃度各不相同,最低抑菌濃度(MIC)分別40、40、50、50 μg/mL。隨著如意草生物堿濃度增大,抑菌活性也在逐漸增強。如意草生物堿對四種菌抑制能力最強的是大腸桿菌和沙門氏菌,其總的抑菌活性順序:大腸桿菌=沙門氏菌<金黃色葡萄球菌=枯草芽孢桿菌。

表6 如意草生物堿對供試菌種的最低抑菌濃度(MIC)Table 6 Minimal inhibitory concentration(MIC)of alkaloids of Corydalis taliensis Fr.different strains

注:-表示無菌生長;+表示菌生長少;++表示菌生長較多;+++表示菌生長多。3 結論

3.1 本實驗采用超聲波法對如意草生物堿進行了提取,在單因素實驗的基礎上采用正交實驗對提取工藝進行優化,得到如意草生物堿的最佳提取工藝是:乙醇濃度75%,料液比1∶10,超聲時間120 min,超聲溫度40 ℃,該條件下如意草生物堿的提取率為1.656%。

3.2 如意草生物堿的抑菌實驗結果表明,不同濃度的如意草生物堿對供試的4種細菌,呈現不同的抑制作用。其中,1.07 mg/mL的生物堿對枯草芽孢桿菌的抑制能力最強,其次為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌,沙門氏菌的抑菌效果最弱;其中枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC為40 μg/mL,大腸桿菌和沙門氏菌的MIC為50 μg/mL。本實驗表明,用超聲波提取如意草生物堿的方法可行,具有提取率較高、時間短、溫度低等特點,以乙醇為介質對如意草生物堿進行超聲波處理,有利于生物堿的提取。另外,此生物堿具有較明顯的抑菌活性,從資源利用的角度來看,如意草也具有較大的開發潛力。

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Extraction and antibacterial activity of alkaloidsfrom theCorydalistaliensisFr.

YANG Yuan-yuan,SHI Juan*,XU Tian-xin

(Chemistry and Environmental Science,Dept.,Shaanxi Sci-Tech University,Hanzhong 723000,China)

To select the basicextracting way of alkaloid from theCorydalistaliensisFr. with ultrasonic,the best one was selected with absorbency of alkaloid as index by single factor test and orthogonal test. The results showed the optimum extraction conditions were as follow:the concentration of ethanol 75%,material to liquid ratio was 1∶10,ultrasonic time was 120 min and ultrasonic temperature was 40 ℃.The alkaloidsextraction yield could reach 1.656% in the optimum conditions. In addition to,the antibacterial activities of alkaloidCorydalistaliensisFr. was determined. The minimum inhibitory concentration(MIC)ofCorydalistaliensisFr. alkaloidon Staphylococcus aureus,Escherichiacoli,BacillussubtilisandSalmonellatyphimuriumwas 40,50,40,50 μg/mL,respectively.

CorydalistaliensisFr. ;alkaloids;ultrasonic extraction;antibacterial activity

2016-06-28

楊園園(1995-)，女，大學本科，研究方向：天然產物的研究開發，E-mail：yangyuanyuan910@126.com。

*通訊作者:史娟(1978-),女，博士，研究方向：天然產物化學和有機合成，E-mail:446269824@qq.com。

TS201.3

B

1002-0306(2017)02-0277-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.045