低電壓脈沖電場對花楸果汁大腸桿菌滅活工藝優化

王艷麗,朱 寧,于 寧,張海平,朱 月,孫愛東

(1.北京林業大學生物科學與技術學院食品科學與工程系,北京 100083;2.北京林業大學林業食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

低電壓脈沖電場對花楸果汁大腸桿菌滅活工藝優化

王艷麗,朱 寧,于 寧,張海平,朱 月,孫愛東*

(1.北京林業大學生物科學與技術學院食品科學與工程系,北京 100083;2.北京林業大學林業食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

為探尋低電壓脈沖電場對花楸果汁中大腸桿菌的滅活效果,實驗考察了在指數衰減波的作用下,電壓、電容、電阻、介質電導率及處理次數對大腸桿菌致死率的影響。經單因素及正交優化實驗得到最佳處理工藝為:電壓400 V,電容300 μF,介質電導率0.5 mS/cm,處理次數3次,該條件下大腸桿菌致死率達到2.242。實驗結果表明,低電壓脈沖電場可以達到有效殺滅果汁中微生物的目的,這為該技術的進一步研究提供了理論基礎。

低電壓,脈沖電場,花楸,大腸桿菌,致死率

花楸是薔薇科落葉灌木或小喬木[1],于上世紀九十年代引入我國,主要種植于遼西地區[2-3]?；ㄩ敝懈缓S酮、花青素、雙聯苯酚、類山梨酸苷、生氰苷等成分,并具有強抗氧化、抗癌、抗輻射和止咳平喘等藥理作用[4-7],具有良好的開發前景,如制成果汁、果酒、果干等。但目前果蔬制品大多采用熱殺菌工藝,過程中常伴隨著功能性成分的破壞,大大降低了果蔬制品的食用價值。

脈沖電場作為一種安全無污染的非熱殺菌方式,能有效減少食品在處理過程中感官品質及物理性質的變化[8],因而在食品領域得到了越來越廣泛的研究和應用。目前,脈沖電場已成功應用于牛奶、啤酒、葡萄酒、番茄汁等液體食品[9-10]。然而傳統的脈沖電場殺菌設備需要外界提供幾千伏至幾十千伏的高電壓[11]才能達到有效殺滅微生物的目的,對脈沖發生器要求較高,同時對操作人員存在安全隱患,極大地限制了脈沖電場這一非熱殺菌方式的工業化應用。因此,如何在低電壓范圍內有效殺滅微生物成為脈沖電場技術研究的新課題。本文探討了在低電壓范圍內(≤400 V),使用指數衰減波作用于花楸果汁中的大腸桿菌時,電壓、電容、電阻、介質電導率及處理次數對大腸桿菌致死率的影響,以期為后續研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果腺肋花楸 吉林省延邊市,成熟果實為紫黑色,于-80 ℃冷藏待用;大腸桿菌菌種(Escherichiacoli,CGMCC1.1739) 中國科學院上海生物化學研究所;LB營養瓊脂培養基 北京奧博星生物技術有限公司。

THERMO 702型超低溫冰箱 美國Thermo Fisher SCIENTIFIC公司;BCD-649WLE型冰箱 青島海爾股份有限公司;MJ-BL25B3型攪拌機 廣東美的生活電器制造有限公司;L3660D型低速離心機 上海知信實驗儀器技術有限公司;TS-100B型臺式恒溫振蕩器 上海天呈實驗儀器制造有限公司;UV-6100型紫外/可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;DK-98-Ⅱ電子調溫萬用電爐 天津泰斯特儀器有限公司;LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;RSPO1-B型數字注射泵(進樣系統) 嘉善瑞創電子科技有限公司;ECM-830型細胞電穿孔信號發生器(脈沖發生器) 美國BTX公司;處理室 由北京林業大學功能性食品創新研究室自主研發,處理室使用平行板電極結構,電極間距為100 μm,低電壓脈沖電場滅菌裝置示意圖見圖1,電路示意圖見圖2。

圖1 低電壓脈沖電場裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of low-voltagepulsed electric field equipment

圖2 低電壓脈沖電場電路示意圖Fig.2 Circuit diagram of low-voltagepulsed electric field equipment

1.2 實驗方法

1.2.1 花楸果汁制備 實驗前將花楸從超低溫冰箱中取出,先放置于-20 ℃冰箱中冷凍過夜,再經常溫解凍,清洗后榨汁,4000 r/min離心20 min,離心所得上清液通過8層紗布過濾后經高壓蒸汽滅菌(121 ℃,20 min),冷卻至室溫后按1%接種量接種大腸桿菌菌懸液,菌體濃度達到106～108cfu/mL,備用,果汁電導率約為1.0 mS/cm。

1.2.2 微生物數量測定 微生物數量測定按照GB/T 4789.2-2010[12]中方法進行。

1.2.3 大腸桿菌生長曲線測定 吸取大腸桿菌培養液,按1%接種量接種于含LB液體培養基的試管中,于恒溫振蕩器中振蕩培養(150 r/min,37 ℃)。當培養時間為0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 h 時各取出一支試管,以未接種的培養基作為空白對照,測定各試管中菌懸液在600 nm處的吸光值,平行測定3次。

1.2.4 低電壓脈沖電場殺菌 低電壓脈沖電場殺菌設備放置于超凈工作臺內,使用前打開紫外燈殺菌30 min,除人員操作時間外保持紫外燈處于打開狀態,以防止微生物污染。進樣管路及樣品收集管路均可拆卸,使用前經高壓蒸汽滅菌,使用時使用無菌水沖洗5 min,以最大程度保證管路的無菌狀態。各實驗均重復操作3次。

1.2.4.1 電壓對殺菌效果的影響 設定電容為400 μF,電阻100 Ω,果汁電導率為1.0 mS/cm,設置電壓分別為200、250、300、350、400 V,處理次數為1次,考察不同電壓對大腸桿菌滅活效果的影響。

1.2.4.2 電容對殺菌效果的影響 設定電壓為400 V,電阻100 Ω,果汁電導率為1.0 mS/cm,設置電容分別為100、200、300、400、500、600 μF,處理次數為1次,考察不同電容對大腸桿菌滅活效果的影響。

1.2.4.3 電阻對殺菌效果的影響 設定電壓為400 V,電容400 μF,果汁電導率為1.0 mS/cm,設置電阻分別為100、200、300、400、500 Ω,處理次數為1次,考察不同電阻對大腸桿菌滅活效果的影響。

1.2.4.4 果汁電導率對殺菌效果的影響 設定電壓為400 V,電阻100 Ω,電容400 μF,調節NaCl含量使果汁電導率分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mS/cm,處理次數為1次,考察不同電導率對大腸桿菌滅活效果的影響。

1.2.4.5 處理次數對殺菌效果的影響 設定電阻為100 Ω,電容400 μF,調節果汁電導率為0.5 mS/cm,在不同電壓(200、250、300、350、400 V)下分別處理1、2、3次,考察不同處理次數對大腸桿菌滅活效果的影響。

1.2.4.6 正交優化實驗 根據單因素實驗結果,選取電壓、電容、電導率和處理次數4個因素進行正交優化實驗,以期得到最優殺菌工藝,正交實驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 計數方式 殺菌效果用致死率對數值lg S表示:

lg S=lg(N0/N)

式中:N0為處理前微生物數,cfu/mL;N為處理后微生物數,cfu/mL。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2003軟件進行數據處理,結果以平均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 大腸桿菌生長曲線測定結果

大腸桿菌生長曲線測定結果見圖3。由圖3可知大腸桿菌延遲生長期處于0～2 h之間,對數生長期為2～10 h之間,其中對數初期、中期、末期分別出現在培養2、6、10 h,穩定初期為培養10 h。由于處于對數期的細胞群體在細胞的化學組成、代謝活性和其他一些特性方面均最為接近一致[13],且對脈沖電場最為敏感[14],能最大程度反映出脈沖電場的致死作用,因此后續實驗中選擇培養時間為6.5 h的大腸桿菌作為處理對象。

圖3 大腸桿菌生長曲線Fig.3 Growth curve of E. coli

2.2 單因素實驗

2.2.1 電壓對花楸果汁中大腸桿菌滅活效果的影響 電壓對花楸果汁中大腸桿菌滅活效果的影響見圖4?？芍?隨著電壓的升高,大腸桿菌致死率明顯增大。當電壓升至350 V后,致死率呈緩慢上升趨勢。分析可知,平行板電極電場強度隨著電壓增大而增大,場強的增加會明顯促進微生物的死亡[14]。綜合考慮滅活效果及低電壓范圍(≤400 V),正交實驗中選取300、350、400 V三個水平。

圖4 電壓對大腸桿菌滅活效果的影響Fig.4 Effect of voltage on inactivation of E. coli

圖5 電容對大腸桿菌滅活效果的影響Fig.5 Effect of capacitance on inactivation of E. coli

2.2.3 電阻對花楸果汁中大腸桿菌滅活效果的影響 電阻對花楸果汁中大腸桿菌的滅活效果見圖6。由圖6可知,電阻的變化對大腸桿菌的致死率無顯著影響(p=0.066>0.05)。電阻的大小主要改變電路中電流的大小,而對果汁中微生物跨膜電壓的形成并無顯著影響。由于在脈沖電場作用下,微生物的死亡主要與其跨膜電壓的形成有關[15-17],因此,電阻這一參數的改變對殺菌效果無顯著影響。

圖6 電阻對大腸桿菌滅活效果的影響Fig.6 Effect of resistance on inactivation of E. coli

2.2.4 果汁電導率對花楸果汁中大腸桿菌滅活效果的影響 果汁電導率對花楸果汁中大腸桿菌滅活效果的影響見圖7。由圖7可知,隨著電導率的增加,大腸桿菌致死率逐漸減小。當電導率為0.5 mS/cm時,大腸桿菌致死率最大,為1.710;當果汁電導率增加至2.0 mS/cm后,大腸桿菌致死率降低至0.13。分析可知,介質電導率對大腸桿菌的滅活效果存在顯著影響(p<0.01),當介質電導率超過一定范圍后,低電壓脈沖電場無法有效殺滅大腸桿菌。這是由于電導率大的食品會在處理室中產生很小的峰值電場,使處理室兩端的電壓難以升高,不利于脈沖電場殺菌[18]。由于繼續減小果汁電導率,會導致果汁顏色發生明顯改變,嚴重影響其感官品質,因此正交實驗中選擇0.5、1.0、1.5 mS/cm三個水平。

圖7 電導率對大腸桿菌滅活效果的影響Fig.7 Effect of conductivity on inactivation of E. coli

表3 低電壓脈沖電場滅活大腸桿菌正交實驗方差分析表Table 3 Analysis of variance for the orthogonal array design for optimizationof inactivation of E. coli by low-voltage pulsed electric field

注:“***”表示F0.05),這可能是由于經過1次處理后,花楸果汁中的部分大腸桿菌處于亞致死狀態[19-21],第2次處理后,大部分亞致死狀態的大腸桿菌已死亡,因此繼續增加處理次數大腸桿菌致死率未出現明顯上升。另外也有文獻表明,隨著介質中菌落總數的減少,脈沖電場的殺菌效果減弱[22],這可能也是處理3次后大腸桿菌致死率沒有明顯上升的原因。

圖8 不同電壓下處理次數對大腸桿菌滅活效果的影響Fig.8 Effect of treatment times on inactivation of E. coli under different voltages

2.3 正交優化實驗

根據單因素實驗結果,設計正交優化實驗,正交實驗結果見表2。

表2 低電壓脈沖電場滅活大腸桿菌正交實驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design and results for optimizationofinactivation of E. coli by low-voltage pulsed electric field

由表3中極差分析結果可知,各因素對大腸桿菌滅活效果的影響大小依次為D>A>B>C,即處理次數>介質電導率>電壓>電容,最佳工藝組合為A1B3C3D3,在此條件下大腸桿菌致死率為2.388±0.044;由方差分析結果可知,A、B、D因素對結果影響高度顯著,C因素對結果影響不顯著,故為降低能量消耗,最佳工藝組合確定為A1B3C1D3,即果汁電導率為0.5 mS/cm,處理電壓為400 V,電容300 μF,處理次數為3次。在此條件下進行驗證實驗,得到大腸桿菌平均致死率為2.242,與正交實驗得出的最佳工藝相比,致死率無明顯降低。

3 結論

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Optimization of low-voltage pulsed electric field for inactivation ofEscherichiaColiin rowan juice

WANG Yan-li,ZHU Ning,YU Ning,ZHANG Hai-ping,ZHU Yue,SUN Ai-dong*

(1.Department of Food Science,College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2.Beijing Foresty University,Key Laboratory of Forestry Food Processing and Security,Beijing 100083,China)

In order to explore the effect of low-voltage electric field on the inactivation ofE.coliin rowan juice,different levels of voltage,capacitance,resistance,medium conductivity and treatment times were tested under the action of exponential decay wave. The results showed that the optimal conditions were obtained as follows:the voltage was 400 V,capacitance was 300 μF,medium conductivity was 0.5 mS/cm,treatment times was 3,and the lethality was 2.242. The low-voltage pulsed electric field could inactivate microbes in juice effectively. This result provided theoretical basis for further research.

low-voltage;pulsed electric field;rowan;E.coli;lethality

2016-08-16

王艷麗(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產物與功能性食品，E-mail:wangyanli03@qq.com。

*通訊作者:孫愛東(1968-)，女，博士，教授，研究方向：天然產物與功能性食品，E-mail：adsun@bjfu.edu.cn。

國家自然科學基金項目 (31471593)；“十三五”國家科技支撐計劃項目(2016YFD0400302)。

TS201.3

B

1002-0306(2017)02-0246-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.039