德宏水牛乳餅中乳酸菌的分離鑒定及發酵性能研究

王昱敬,黃艾祥,*,劉雪英,王馨聆,郭 潔

(1.云南農業大學食品科學技術學院,云南昆明 650201;2.云南農業大學龍潤普洱茶學院,云南昆明 650201)

德宏水牛乳餅中乳酸菌的分離鑒定及發酵性能研究

王昱敬1,黃艾祥1,*,劉雪英1,王馨聆1,郭 潔2

(1.云南農業大學食品科學技術學院,云南昆明 650201;2.云南農業大學龍潤普洱茶學院,云南昆明 650201)

德宏水牛奶乳餅是云南特有的乳制品,微生物資源豐富,是乳酸菌的重要來源,也是分離篩選優良發酵劑的天然基礎。本文采用16S rRNA基因序列分析法和純培養法對15份水牛奶乳餅中乳酸菌種屬進行分離鑒定,通過對菌株產酸、產香、發酵乳活菌計數等比較,以篩選出具有優良發酵特性的乳酸菌。結果表明:15份水牛奶乳餅樣品中共分離鑒定出57株乳酸菌(3個屬,6個種和1個亞種),其中Lactobacillusfermentum和Lactobacillusoris為優勢菌屬,占總菌屬的36.84%和24.56%。57株乳酸菌發酵特性比較后得到兩株優勢菌株MGR3-1和MBR1-1。此研究為后續開發和應用優良發酵劑提供理論基礎。

乳酸菌,分離鑒定,16S rRNA基因序列,發酵性能

乳餅是云南傳統乳制品之一,以發酵乳清水為凝乳劑制作而成,其乳酸菌資源豐富。然而,這些研究中,乳餅一般以羊奶為原料,不同地域的自然環境和氣候以及不同的原料奶與加工工藝,造成了不同乳餅中乳酸菌菌種的差異,不乏具有優良益生特性和生產特性的菌株。吳少雄等[1]研究表明云南撒尼地區乳餅中乳酸菌資源豐富,共分離鑒定出46株乳桿菌和27株乳球菌,并篩選出具有優良發酵特性的菌株。因此探索德宏水牛奶乳餅中的優良乳酸菌,有助于豐富乳業發酵菌種。

乳酸菌分離鑒定多采用傳統微生物分離、培養和鑒定方法,此方法耗時、耗力、鑒定結果較不穩定。運用16S rRNA基因序列分析技術結合傳統培養法,使得實驗結果更加科學、客觀和可信。這兩種方法在傳統發酵乳的乳酸菌多樣性分析中已有成功報道[2]。研究表明,乳制品中的乳酸菌具有產酸、產香等優良生產性能[3],其中徐成勇等[4]以酸度篩選出優良的乳酸菌菌株。乳酸菌產酸是生產優質酸奶的關鍵,李延華等[5]通過對發酵乳的風味成分分析,篩選出了發酵特性優良的乳酸菌株。乙醛和雙乙酰是構成酸奶風味的主要成分,使得酸奶口感獨特。

本實驗運用16S rRNA基因序列分析法和傳統純培養法對德宏水牛奶乳餅中的乳酸菌進行分離鑒定,并對菌株產酸、后酸化、產乙醛、產雙乙酰等發酵特性進行研究,為食品發酵劑的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云南省德宏州芒市15份水牛乳餅 勐旺村3份,芒丙村3份,拉懷村4份,芒崗村5份,4 ℃低溫環境下帶回實驗室;丙三醇、乙醇、3%過氧化氫水溶液等 均為分析純,購自天津市風船化學試劑科技有限公司;MRS肉湯、MRS培養基 購自北京陸橋技術有限責任公司;革蘭氏染色試劑盒 購自北京索萊寶科技有限公司;DNA抽提試劑盒 購自北京全式金生物技術有限公司;PCR擴增引物 購自上海美吉生物技術有限公司。

SW-CJ-LF超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限責任公司;DW-86L290澳柯瑪超低溫冰箱 青島澳柯瑪超低溫冷凍設備有限公司;TGL20M冷凍離心機 湖南湘立科學儀器有限公司;DPH-9052恒溫培養箱 上海恒科學儀器有限公司;YXQ-LS-70A高壓滅菌器 上海博訊實業醫療設備廠;BH200光學顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司;ST320pH計 奧豪斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品稀釋液pH的測定 對乳餅樣品,從其表面和內部各取12.5 g,置于同一研缽內研碎,加入225 mL 0.9% NaCl溶液滅菌,充分混勻,配制成樣品10倍稀釋液,用pH計測定其pH。

1.2.2 樣品中乳酸菌落計數 無菌條件下,取1 mL樣品10倍稀釋液于9 mL NaCl溶液(質量分數0.9%)中,充分混勻,以10倍稀釋法對其進行梯度稀釋后,吸取1 mL稀釋度為10-7、10-8、10-9的稀釋液于無菌培養皿中(每個稀釋梯度做2個平行),倒入已滅菌并處于保溫狀態的MRS培養基中,向每個平皿中傾注20～25 mL,混合樣品稀釋液與培養基。待平板中培養基冷卻凝固后,倒置平皿放入恒溫培養箱,并置于30 ℃培養48 h。菌落形成后,選擇菌落數在30～300之間的平板,進行計數[6]。

1.2.3 樣品的分離、純化與生理生化鑒定 根據菌落形態特征,劃線分離純化2～3次后,挑取單菌落于MRS培養液中(36±1) ℃的條件下培養24 h。經革蘭氏染色后鏡檢,同時進行過氧化氫酶實驗,將純種、革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的菌株置于-80 ℃超低溫冰箱中保藏[7-14]。

1.2.4 乳酸菌16S rRNA基因的PCR擴增 將單克隆菌株用試劑盒法提取基因組DNA,PCR擴增16S rRNA基因引物為細菌通用引物,正向引物為FA-27F(5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′);反向引物為RA-1495R(5′-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGT TACGA-3′)[15]。16S rRNA基因的PCR擴增體系:2.5 μL Tap Buffer;2.0 μL MgCl2;1.0 μL引物FA-27F(10 mmol/L);1.0 μL引物RA-1495R(10 mmol/L);0.5 μL dNTP mix(2.5 mmol/L);0.5 μL Tap DNA Polymerase(5 U/μL);2.0 μL DNA模板(100 mg/L);15.5 μL ddH2O。擴增反應條件為:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性1 min;56 ℃退火1 min;72 ℃延伸2 min;30次循環;72 ℃末端延伸10 min[16]。擴增反應完畢后,取約 2 μL的PCR擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,若在1500 bp處有清晰的擴增條帶且無拖尾、彌散現象,則PCR擴增成功。

1.2.5 乳酸菌16S rRNA序列測定 PCR產物送到上海美吉生物技術有限公司進行雙向測序,每株菌獲得兩條16S rRNA基因的序列,用Seq Man軟件拼接,獲得約1500 bp的有效序列[17-18]。登陸網站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/進行序列比對,結合形態學特征和理化特性確定與比對的目的基因序列同源性最高的已知分類的菌種。

1.2.6 系統發育樹的構建 從GenBank數據庫中下載與所測菌株相對應的16S rRNA基因序列,利用ClustalX 2.0.12進行多重比對,得到同源性。利用MEGA 4.0軟件構建系統發育樹,采用Neighbor-Joining法進行系統發育分析,并進行1000次重復的Boot-straps統計學檢驗[19]。

1.2.7 發酵性能測定

1.2.7.1 菌株產酸活性測定 將活化好的菌株按體積分數以2%的比例接種到全脂復原乳中發酵,初始pH為6.6,37 ℃厭氧培養,分別于6 h和24 h取樣測可滴定酸,用0.1 mol/L NaOH滴定,酚酞作為指示劑,以乳酸的百分比表示結果[20]。

1.2.7.2 活菌數的測定 稱取5 mL發酵乳樣品于45 mL PBS緩沖液中,振蕩均勻,取0.5 mL混合液加入4.5 mL PBS緩沖液中,選擇10-7、10-8、10-9的發酵乳稀釋液,利用平皿計數法測定發酵乳在4 ℃冷藏期間1、3、5、7 d乳酸菌的活菌數。

1.2.7.3 產香能力的測定 測定pH達到4.5,并于4 ℃冷藏1、3、5、7 d的發酵乳中的乙醛和丁二酮含量[21]。

1.2.8 數據統計 每組實驗做3個平行,利用Excel軟件、SPSS19.0 軟件對數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 乳餅的pH和乳酸菌的計數

由表1可知,15份水牛乳餅樣品的10倍稀釋液的pH均<7.0,呈酸性;樣品10倍稀釋液在(36±1) ℃培養24 h后pH最大值已達到4.47±0.09,表明樣品中可能潛在大量產酸微生物;樣品中乳酸菌數最高為(9.40±0.01)×108cfu/mL,最低為(2.00±0.04)×108cfu/mL,由乳酸菌活菌計數結果可知,所有乳餅樣品活菌數均大于108cfu/mL。結果表明德宏水牛乳餅中乳酸菌產酸能力強,菌株存活率高,有利于下一步的分離鑒定。

2.2 菌株理化特性及初步鑒定

由表2可以看出,MRS培養基中菌斑有白色圓點或圓斑、白色三角錐形、乳白色梭狀,且表面濕潤、邊緣整齊或褶皺等不同形態以及長在培養基的不同位置。通過在顯微鏡下觀察到的形態為長桿狀、短桿狀,彼此排列成假分枝狀、圓球狀、單生或成對等,與吳少雄等[1]從云南撒尼乳餅中分離得到的菌株形態描述較為一致。將分離得到的單菌株分別進行革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗,發現57株菌均為革蘭氏陽性,過氧化氫酶陰性;根據菌株的形態學結果結合乳酸菌的理化特性,初步鑒定57株菌為疑似乳酸菌。

表2 菌株形態特征Table 2 Morphological characteristics strain

表1 pH和乳酸菌計數Table 1 pH value and lactic acid bacteria counts

注:角標含有不同字母的每列數據之間差異顯著(p<0.05)。

2.3 乳酸菌系統發育樹

由圖1得出,菌株MBR1-3、MGR2-3、MGR1-4、MBR1-4、MBR1-1和LactobacillusorisX94229聚為一類,且同源性為98%,將其鑒定為Lactobacillusoris;菌株MWR1-3、MWR3-1、MWR3-2和LactobacillusreuteriiJCM1112聚為一類,且同源性為96%,將其鑒定為Lactobacillusreuterii;菌株MGR2-2、MGR5-3、MBR1-2、MWR1-1、MWR1-2與LactobacillusfermentumJN175331聚為一類,同源性為99%,將其鑒定為Lactobacillusfermentum;菌株MGR1-2和LactobacillusplantarumAJ965482聚為一類,同源性為98%,將其鑒定為鑒定為Lactobacillusplantarum;菌株MGR3-2、MGR1-1、MGR4-1與WeissellaconfusaAB023241聚為一類,同源性為93%,將其鑒定為Weissellaconfusa;菌株MBR2-2和EnterococcusduransAJ276354聚為一類,故將其鑒定為Enterococcusdurans;菌株MGR5-2、MGR3-1與Lactobacillusdelbrueckiisubsp. CR954253聚為一類,因此將其鑒定為Lactobacillusdelbrueckiisubsp。

圖1 部分乳酸菌的16S rRNA基因序列系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rRNA sequences of lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌16S rRNA同源性分析

表3 水牛乳餅中乳酸菌的分布結果Table 3 Distribution of lactic acid bacteria in buffalo milk cake

續表

表4 冷藏期間乳酸菌活菌計數(lgCFU/mL)Table 4 During cold storage viable count of lactic acid bacteria(lgCFU/mL)

注:數據以±s表示(n=3);每一列中具有相同字母的數值差異不顯著(p>0.05),具有不同字母的數值之間差異顯著(p<0.05),表5～6同。

表5 酸奶冷藏過程中乙醛含量測定結果(Lg/mL)Table 5 Acetaldehyde assay results during refrigerated yogurt(Lg/mL)

表6 酸奶冷藏過程中雙乙酰含量測定結果(mg/L)Table 6 Frozen yogurt during diacetyl assay results(mg/L)

由表3可知，經16S rRNA序列測定和同源性分析57株乳酸菌菌株歸為3個屬(Lactobacillus、Weissella、Enteroccoccus)中的6個種,包括21株Lactobacillusfermentum、14株Lactobacillusoris、12株Weissellaconfusa、6株Lactobacillusreuterii、1株Enterococcusdurans、1株Lactobacillusplantarum和1個亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.),其中Lactobacillusfermentum和Lactobacillusoris為優勢菌屬,占總菌屬的36.84%和24.56%。

2.5 發酵性能

2.5.1 乳酸菌的產酸活性 由圖2可知,利用57株菌在全脂粉11.5%、蔗糖6.5%的100 mL脫脂牛奶中培養6 h和24 h時的可滴定酸含量分析乳酸菌的產酸活性。培養6 h時,可滴定酸的范圍是0.28%～1.45%,培養24 h時的范圍是0.55%～2.49%,產酸活性最強的是MBR1-1(L.oris)。NANDA D K等[22]將6 h可滴定酸值大于0.6%作為篩選產酸能力強的乳酸菌標準,組間差異不顯著(p>0.05),本實驗中有6株菌滿足這一條件,產酸能力強弱依次為:MBR1-1>MGR1-1>MGR1-2>MGR2-2>LHR1-5>MGR3-1。

圖2 菌株培養6 h和24 h后的可滴定酸Fig.2 Strains were cultured 6 h and 24 h after titratable acidity

2.5.2 發酵乳的活菌數 由表4可知,6株菌在4 ℃貯藏過程中,酸奶具有良好的活性,活菌數保持較為穩定,在貯存3 d 時的活菌數比發酵終點時的活菌數還略高。根據GB19302-2010的要求,對發酵乳中乳酸菌的數量不低于6 lgCFU/mL[23],本實驗篩選的6株菌在發酵乳7 d后活菌數均大于國家標準,符合發酵劑的標準。菌株MBR1-1(L.oris)的發酵乳7 d后活菌數仍達到12.93 lgCFU/mL,可見菌株MBR1-1是一株具有良好活性的菌株。

2.5.3 菌株產香性能 由表5可知,菌株MGR1-2、MGR2-2、MGR3-1在貯藏7 d中乙醛含量變化在5～14 mg/L之內,是風味較好的菌株,菌株MBR1-1乙醛含量變化在9.13～19.81 mg/L之間,是良好的產乙醛特性的菌株,菌株LHR1-5乙醛含量7 d中都低于5 mg/L,是極弱風味菌種,不適合做發酵劑。由表6可知,菌株MBR1-1、MGR1-2、MGR2-2在貯存期間的雙乙酰含量較為穩定,均達到10 mg/L以上,而菌株MGR3-1在貯存期間雙乙酰最高含量為(13.83±0.52)mg/L,組間差異顯著(p<0.05),是良好產香特性的菌株。

3 結論

運用16S rRNA基因序列分析技術和純培養法對德宏水牛乳餅中的乳酸菌進行了分離和鑒定。共鑒定出57株乳酸菌,包括乳桿菌屬、腸球菌屬、魏斯氏菌屬,共3個屬7個種或亞種,其中Lactobacillusfermentum和Lactobacillusoris為優勢乳酸菌。對57株菌發酵特性比較,篩選出菌株MBR1-1、MGR1-1、MGR1-2、MGR2-2、LHR1-5、MGR3-1,具有較強的產酸能力;菌株MBR1-1(L.oris)在發酵乳冷藏7 d后活菌數為12.93 lgCFU/mL,乙醛含量變化在9.13～19.81 mg/L之間,是一株活力高且產香性能良好的菌株。菌株MGR3-1(L.delbrueckiisubsp.)在貯存期間雙乙酰最高,具有良好的產香性能。因而篩選出具有優良發酵特性的菌株MBR1-1和MGR3-1可以為今后乳制品發酵劑提供支持。

[1]楊希良,陳少遷,殷建忠,等. 云南撒尼地區乳餅中乳酸菌的分離及生物學形態研究[J]. 中國乳品工業,2013，41(11):23-26.

[2]呼斯楞,劉紅新,于潔,等. 內蒙古呼倫貝爾地區傳統發酵乳中乳酸菌的多樣性分析[J]. 微生物學通報,2016,43(5):984-990.

[3]邵亞東,孟和畢力格.傳統發酵乳制品中乳酸菌產雙乙酰特性的研究[D]. 內蒙古:內蒙古農業大學,2007.

[4]李延華,王偉軍,張蘭威,等. 德氏乳桿菌保加利亞亞種發酵乳風味成分分析[J].食品科學,2009,30(4):257-259.

[5]徐成勇,吳昊,鄭思聰,等. 弱后酸化酸奶發酵劑的篩選[J].中國乳品工業2013,35(3):12-16.

[6]Yu J,Wang WH,Menghe BLG,et al. Diversity of lactic acid bacteria associated with traditionalfermented dairy products in Mongolia[J]. Journal of Dairy Science,2011,94(7):3229-3241.

[7]楊潔彬,郭興華.乳酸菌:生物學基礎及應用[M]. 北京:中國輕工業出版社,1991:1-3.

[8]SUN Z,LIU W,GAO W,et al. Identification and characterization of the dominant lactic acid bacteria from kurut:The naturally fermented yak milk in Qinghai,China[J]. The Journal of General and Applied Microbiology,2010,56(1):1-10.

[9]孟令帥,張穎,鄒婷婷,等.辣白菜中乳酸菌的分離鑒定[J].食品科學,2015,36(11):11-130.

[10]呂俊梅,李進波,黃艾祥.2011.牦牛“奶渣”中乳酸菌的分離鑒定[J].中國奶牛,20:57-60.

[11]HOLT J G,SNEATH P H. Bergey’s manual of systematic bacteriology(vol. 2)[M].4th ed. Baltimore:Williams & Wilkins,2008,35(8):129-301.

[12]李銀聰,闞健全,杜木英.自然發酵酸耗牛奶的微生物區系及其抗氧化活性研究[D]. 重慶:西南大學,2011.

[13]南志強.西藏地區發酵牛乳的化學組成和微生物分析及乳酸菌的分離篩選[D].西藏:西藏大學,2010.

[14]龐會利,談重芳,蔡義民,等.乳酸菌分類鑒定方法的研究進展[J].中國釀造,2009(6):1-5.

[15]IU W J,BAO Q H,JIRIMUTU,et al. Isolation and identi cation oflactic acid bacteria from Tarag in Mongolia of China by 16S rRNA sequences and DGGE analysis[J].Microbiological Research,2012(167):110-115.

[16]LIU W,GAO W. Identification and characterization ofthe dominant lactic acid bacteria from kurut:The naturally fermentedyak milk in Qinghai,China[J]. The Journal of General and Applied Microbiology,2010,56(1):1-10.

[17]FAYE T,TAMBURELLO A,BEGARUD G E,et al. Survival of lactic acid bacteria from fermented milks in aninvitrodigestion model exploiting sequential incubation in human gastric and duodenum juice[J]. Journal of Dairy Science,2012,95(2):558-567.

[18]WU R,WANG L P,MENGHE B,et al. Isolation and preliminary probiotic selection of Lactobacilli from koumiss in Inner Mongolia[J]. Journal of Basic Microbiology,2009,49(3):318-326.

[19]TAMURA K,DUDLEY J,NEI M,et al. MEGA4:molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0[J]. Molecular biology and evolution,2007,24(8):1596-1599.

[20]中華人民共和國衛生部. GB 5413.34-2010食品安全國家標準乳和乳制品酸度的測定[S]. 北京:中國標準出版社,2010.

[21]李妍,邢慧敏,邵亞東,等.發酵乳中丁二酮和乙醛含量檢測方法探討[J].食品與發酵工業,2008,34(3):157-159.

[22]NANDA D K,TOMAR S K,SINGH R,et al. Phenotypic and genotypic characterization of lactobacilli isolated from camel cheese produced in India[J]. International Journal of Dairy Technology,2011,64(3):437-443.

[23]中華人民共和國衛生部. GB 19302—2010食品安全國家標準發酵乳[S]. 北京:中國標準出版社,2010.

Isolation and identification of lactic acid bacteria from buffalo milk cakes in Dehong and analysis of fermentability

WANG Yu-jing1,HUANG Ai-xiang1,*,LIU Xue-ying1,WANG Xin-ling1,GUO Jie2

(1.College of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2.College of Pu-erh Tea,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)

Dehong buffalo milk cake is a specific dairy product in Yunnan,which contains abundant microbes and is the main source of lactic acid bacteria. Meanwhile,it is a basis for isolation and screening of qualified fermentation starter. In this study,the 15 samples were isolated and identified using pure culture and 16S rRNA gene sequence analysis. In order to select out lactic acid bacteria with excellent fermentation characteristics,the acidification,aroma and counts of these strains were compared. The result showed that 57 lactic acid bacteria(3genus,6 species and 1 subspecies)were separated from the 15 pieces of buffalo milk cakes,LactobacillusfermentumandLactobacillusoriswere thedominant species,held 36.84% and 24.56% of the total bacteria number respectively. Compared fermentation properties of the 57 lactic acid bacteria,MGR3-1 and MBR1-1 were defined as two dominant bacteria. So the research could be excellent fermentation starter to develop and use.

lactic acid bacteria;isolation and identification;16S rRNA gene sequences;fermentability

2016-06-30

王昱敬(1991-),男,碩士,研究方向:食品科學,E-mail:609948586@qq.com。

*通訊作者:黃艾祥(1963-),男,教授,研究方向:食品科學,E-mail:aixianghuang@126.com。

云南省高校食品加工與安全控制項目(云教科[2014]16號);云嶺產業技術領軍人才項目(云發改人事[2014]1782號);云南省現代奶牛產業技術體系項目(2016KJTX008)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)02-0226-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.035