仿生硅化固定化葡萄糖氧化酶與辣根過氧化酶研究

周 冉,宋玉品,劉曉妹,荀賀風,侯冬梅,吳欣蕊,劉玲君

(1.石家莊學院化工學院,河北石家莊 050035;2.河北工業大學化工學院,天津 300130;3.河北三元食品有限公司,河北石家莊 050000)

仿生硅化固定化葡萄糖氧化酶與辣根過氧化酶研究

周 冉1,宋玉品1,劉曉妹1,荀賀風1,侯冬梅1,吳欣蕊2,劉玲君3

(1.石家莊學院化工學院,河北石家莊 050035;2.河北工業大學化工學院,天津 300130;3.河北三元食品有限公司,河北石家莊 050000)

采用分步法將仿生硅化與脂質體技術相結合,模擬細胞微結構,以卵磷脂為原料,制備脂質體微囊,以胺類為誘導劑,在其表面硅化形成氧化硅殼層,實現對葡萄糖氧化酶(GOx)與辣根過氧化酶(HRP)雙酶固定。研究了超聲時間、誘導劑PDADMA用量、硅前驅體水解液(TMOS)用量、Triton X-100濃度等因素對固定化酶活性影響。結果表明,在200 μL PDADMA、0.7 mL TMOS、超聲50 min制得的固定化酶活性最高,能迅速硅化形成直徑200 nm左右的球形微囊。在此優化條件下制備的固定化酶經重復使用7次,依然達到初始催化酶活的61.46%,經一個月冷藏后酶活仍能達到最初的74.1%。可見,經過固定化,雙酶系統的穩定性得到了顯著提高。

仿生硅化,脂質體,葡萄糖氧化酶,辣根過氧化酶,納米氧化硅微囊

含苯酚的廢水是一種常見工業污染物,主要來源于石油化工、木材加工、造紙和制藥等行業。殘存在環境中的高濃度酚類物質會對人類及動植物產生極大的危害,是一種公認的致癌致畸物質。酶作為一種高效專一的生物催化劑,將其應用于環境污染物處理,正得到日益廣泛重視與研究[1-2]。辣根過氧化物酶(HRP)能在較寬的溫度和pH范圍內催化芳香族化合物氧化生成酚氧自由基,這些自由基會進一步聚合生成溶解性較差的聚合物從溶液中沉淀出來。以往研究一般使用游離酶,但其本身存在易受廢水中其他污染物影響和不能循環使用等缺點,限制了其在廢水處理方面的應用,所以固定化酶的應用受到廣泛的重視。

酶來源于生物體,在設計固定化酶載體時可借鑒酶在生物體中的存在環境。生物硅化過程反應條件溫和,可在水環境、中性pH和較低的溫度下(通常在生理條件下)進行[3-5]。通過仿生硅化制備有機質/氧化硅納米復合物用作制備固定化酶的載體材料成為現在的研究熱點[6-16]。近年來,研究人員將脂質體技術與仿生相結合,研究出有機/無機雜化固定化載體,以達到綜合利用有機材料和無機材料的優點進行酶固定化的目的[17-25]。

應用HRP催化去除苯酚的過程為雙底物反應,應保證存在原位H2O2參加整個反應。H2O2本身對酶有抑制作用且濃度不易控制。本研究將仿生硅化與脂質體技術相結合,模擬細胞微結構,探討了以脂質體為模板固定化葡萄糖氧化酶(GOx)和HRP雙酶的可行性。結合固定化雙酶系統中包埋的GOx,加入葡萄糖作為底物產生原位H2O2,減弱了直接加入H2O2時對酶產生的抑制作用[23]。并優化反應條件,考察了超聲時間、誘導劑PDADMA的用量、硅前驅體水解液(TMOS)用量、Triton X-100的濃度等條件的影響,以及固定化酶的重復使用性和儲存穩定性。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

正硅酸甲酯(TMOS) 天津市化學試劑研究所;葡萄糖氧化酶>100 U/mg(GOx)、辣根過氧化物酶>150 U/mg(HRP) 上海源葉生物科技有限公司;聚二甲基二烯丙基銨[PDADMA(20 wt.% in H2O)] Sigma公司;4-氨基安替比啉(4-AAP)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100) 天津市科密歐化學試劑有限公司;大豆卵磷脂、膽固醇 北京奧博星生物技術有限公司。

冷凍高速離心機 Sigma公司;UV1100紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;Brukervector22傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;電子天平、pH計 上海精密科學儀器有限公司;S-4800掃描電鏡 JEOL公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 包覆雙酶脂質體模板的制備 將卵磷脂與膽固醇以質量比4∶1溶于10 mL氯仿中,于4 ℃下冷藏保存待用。取3.6 mL上述溶液于100 mL圓底燒瓶中,減壓除去氯仿,直至在燒瓶內壁形成均勻的透明薄膜[26]。加入12 mL GOx和HRP混合溶液,利用超聲形成均勻的脂質體乳濁液,控制超聲時間實現對模板形貌和酶活保持性的優化。

1.2.2 以脂質體為模板誘導形成氧化硅殼層 取經超聲后形成粒徑均勻的脂質體溶液,在攪拌速度200 r/min下依次滴加質量分數為2 mg/mL的PDADMA溶液、TMOS水解液(54.82 mmol/L硅醇溶液)。硅化1 h后離心洗滌5次[27]。

1.2.3 去除脂質體模板 將已除去游離酶和雜質的固定化酶在一定濃度的Triton X-100溶液中浸泡1 h,離心洗滌2次,得到除去模板的固定化酶。

1.2.3.1 誘導劑用量的影響 將3.6 mL卵磷脂溶液于100 mL圓底燒瓶中旋蒸成膜,加入混合酶液12 mL(其中VGOx∶VHRP=1∶2),超聲水浴振蕩形成均質乳化液。分別取樣1 mL于2 mL離心管中。以PDADMA(2 mg/mL,0.1 mol/L PBS,pH6.88)的用量作為變量(取140、160、180、200、220、240 μL),再分別加入0.6 mL TMOS鹽酸水解液,靜置硅化1 h,常溫300 r/min離心5 min,用蒸餾水洗滌四次后檢測酶活。

1.2.3.2 超聲時間的影響 本實驗采用薄膜分散法制備脂質體,超聲時間的長短會影響固定化酶活性。本實驗以超聲時間為變量(20,40,50,70,100,120,140 min),其余變量采用篩選所得最優條件,即200 μL PDADMA,硅化1 h后離心洗滌檢測酶活。

1.2.3.3 前驅體水解液用量的影響 將各管中分別加入200 μL PDADMA,以TMOS鹽酸水解液的用量為變量(0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9 mL),靜置硅化1 h,然后離心洗滌四次后檢測酶活。

1.2.3.4 WGOx與WHRP比例的影響 以雙酶的質量比例為變量(WGOx∶WHRP分別為1∶1,1∶2,1∶3,1∶4,1∶5,1∶6),按照上面優化好的條件進行實驗,最后離心洗滌檢測酶活。

1.2.3.5 Triton X-100濃度的影響 誘導劑和前驅體的用量采用優化得到的條件,即分別加入200 μL PDADMA,0.7 mL TMOS,靜置硅化1 h后離心洗滌備用。以Triton X-100的質量濃度為變量,在30%的濃度基礎上進行梯度稀釋,獲得濃度為0.3%、0.4%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%的溶液。各取1 mL上述溶液加入到已制得的固定化酶中浸泡1 h,離心棄上清用蒸餾水洗滌一次后,檢測酶活。

1.2.3.6 不同酶比例下固定化酶重復使用性 分別將不同比例下(WGOx∶WHRP分別為1∶4,1∶3,1∶2,1∶1)的固定化酶連續反應7次,檢測酶活。

1.2.3.7 儲藏穩定性 分別將游離雙酶和固定化雙酶在4 ℃儲藏30 d后,檢測游離雙酶和固定化雙酶的剩余酶活。相對酶活R(Relative activity,%)為以同一組實驗內酶活力最高點記為100%,相對酶活則為其他數據點酶活值與此最高值之比。

1.2.4 酶活測定方法 在此雙酶體系中,GOx催化底物葡萄糖產生原位H2O2,HRP催化原位H2O2與苯酚反應生成有色基團,根據此反應體系在500 nm下吸光值表征雙酶體系的催化速率。

1.2.4.1 底物溶液的配制 A液,0.35 mg 4-AAP和1 mL質量分數3%苯酚溶于20 mL 0.1 mmol/mL PBS中。B液,質量分數為13%的葡萄糖溶液。

1.2.4.2 游離GOx活性測定 在1 cm比色皿中,加1.5 mL A液、1.5 mL B液,充分混合,作為參比液;取一定量未固定的GOx于10 cm離心管中,加入1.5 mL A液混勻,加入1.5 mL B液的同時開始計時,測定其反應30 s時在500 nm下吸光值。

1.2.4.3 固定GOx活性測定 在1 cm比色皿中,加1.5 mL A液、1.5 mL B液,充分混合,作為參比液;取一定量固定化的GOx于10 cm離心管中,加入1.5 mL A液混勻,加入1.5 mL B液的同時開始計時,磁力攪拌反應1 min,以針筒式過濾器迅速過濾分離出固定化GOx以終止反應,測上清液在500 nm下吸光值。

1.2.5 SEM表征 固定化酶氧化硅粉體形貌采用Hitachi S-4300場發射掃描電子顯微鏡進行分析,樣品用無水乙醇超聲分散10 min,滴于硅片上,待乙醇完全揮發后觀察。

2 結果與討論

2.1 誘導劑用量

酶活隨PDADMA用量的變化情況如圖1所示。結果表明,當PDADMA的量為200 μL時酶活最高(相對濃度為0.02 mg PDADMA/mg脂質體,脂質體濃度為:18.75 mg/mL)。當PDADMA用量較低時不能充分發揮脂質體的模板作用,即PDADMA只能誘導少部分脂質體表面形成氧化硅微囊,其余為僅由脂質體包埋的囊狀結構。脂質體本身結構比較脆弱,在外界條件干擾下(振蕩、攪拌等)易發生破裂,導致包埋失效,使固定化酶在洗滌過程中流失,所以隨著PDADMA用量增加酶活逐漸升高,直至達到最大值。當PDADMA用量超過最適值(酶活最高時對應的PDADMA的量)后,過量的PDADMA不僅誘導脂質體表面進行硅化,同時也使脂質體發生粘連作用,導致脂質體的比表面積減小,分散性降低,嚴重影響硅化質量;此外,過量游離的PDADMA會使模板失去作用,即TMOS不借助脂質體的作用而形成不規則的結構,這兩者都是導致酶活逐漸下降的原因,這與前人的報道結果[26]一致。

圖1 PDADMA的用量與固定化酶活性的關系Fig.1 The relationship between the amount of PDADMA and the immobilized enzyme

2.2 超聲時間

超聲時間對固定化酶活性的影響如圖2所示。結果表明,在一定時間范圍內隨超聲時間延長酶活逐漸升高,在50 min時達到最大,達到最大值之后隨著超聲時間的延長酶活逐漸降低。

圖2 超聲時間對固定化酶活性影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on the activity of immobilized enzyme

2.3 前驅體水解液用量

酶活力隨TMOS用量的變化情況如圖3所示。當TMOS鹽酸水解液的用量為0.7 mL時酶活最高(0.306 mg TMOS/mg脂質體,脂質體濃度為:18.75 mg/mL)。TMOS可以在酸性水環境中迅速水解完全,而無需使用助溶劑來提高其水解能力。TMOS水解得到帶有四個硅氧鍵的溶膠粒子,縮聚能力極強,酶分子的加入更是加劇了溶膠粒子的縮聚速度。當前軀體TMOS的量較低時只能利用一部分脂質體在誘導劑的作用下形成納米氧化硅微囊。隨TMOS用量的增加,利用脂質體的量也逐漸升高,形成的包埋雙酶的氧化硅微囊逐漸增加,酶活逐漸升高直到達到最大。由于脂質體本身為納米級微粒,良好的分散性是保證酶與底物充分接觸、產物及時擴散出微囊的必要條件,所以當TMOS的用量超過最適值后,水解生成的大量硅酸會提高環境中的離子強度,影響脂質體的分散效果[26],導致酶活逐漸下降。

圖3 TMOS的用量對固定化酶活性的影響Fig.3 Effect of TMOS amount on the relativeactivity of immobilized enzyme

2.4 WGOx與WHRP比例

酶活隨雙酶比例的變化情況如圖4所示。結果表明,隨著GOx/HRP比例的降低,酶活逐漸升高,GOx催化葡萄糖分解產生的H2O2逐漸跟HRP反應。當GOx/HRP=1/4時酶活性最高,在此比例時,GOx催化葡萄糖分解產生的H2O2可能恰好與HRP反應完全,在苯酚和4-AAP的作用下產生大量粉色物質;當GOx過量時,HRP成為反應限制因素,GOx催化底物反應產生的過量H2O2,受脂質體的阻滯作用向微囊外擴散速率緩慢,導致其在氧化硅微囊中局部積累,對GOx產生抑制作用,所以此時測得的酶活較低;當HRP過量時,GOx為限制因素,其含量逐漸降低使產生的H2O2量逐漸減少,同樣使雙酶體系表現較低活性。

圖4 雙酶比例對固定化酶活性的影響Fig.4 The effect of activity of the ratio of GOx and HRP on immobilized enzyme

2.5 Triton X-100濃度的影響

酶活與Triton X-100的濃度變化關系如圖5所示。結果表明在低濃度范圍內隨著洗滌劑濃度的升高酶活逐漸增大,經濃度為1%的Triton X-100溶液浸泡的固化酶活性最高,超過該濃度后酶活逐漸下降最后維持在0.4左右。首先,Triton X-100作為一種非離子型的表面活性劑具有洗滌去污作用,能夠分解作為模板的脂質體,增加底物和酶的接觸機會,有效地降低傳質阻力;同時它能分解氧化硅微囊之間粘連的脂質,在一定程度上提高微囊的分散性,增大了底物進入微囊的概率[27],這兩點都是導致在一定范圍內隨著濃度升高酶活增大的原因。當TritonX-100溶液的濃度超過一定值后,過量的去污劑不僅會分解脂質體模板,而且會破壞氧化硅微囊的骨架結構導致酶釋放出來,經洗滌后流失,從而導致酶活逐漸下降。酶活降低到一定值后Triton X-100的濃度對酶活基本不再產生較大影響。

圖5 Triton X-100的濃度對固定化酶活性的影響Fig.5 Effect of Triton X-100 concentration on the relative activity of immobilized enzyme

2.6 固定化酶SEM表征

采用薄膜分散法所得固定化雙酶氧化硅微囊見圖6,其為球形粒子,其大小在200 nm左右,表面比較光滑,彼此之間有團聚現象。

圖6 固定化GOx 的SEM圖 Fig.6 SEM image of immobilized GOx particles

2.7 不同比例下固定化酶重復使用性

固定化酶可以有效解決反應后產物分離和重復使用兩大問題,在一定程度上可以降低生產成本。所以,固定化酶的重復使用性是評價其性能優劣的重要標準之一。固定雙酶系統的重復使用性見圖7。隨著反應次數增加,酶活力逐漸降低。當GOx∶HRP=1∶4時,酶活力損失程度較低,一方面是因為氧化硅微囊結構將內部酶系統和外界環境隔離開來,使GOx催化葡萄糖分解產生的H2O2聚集在微囊內,為反應提供較高底物濃度的微環境,提高反應速率。另一方面,隨著GOx含量升高,H2O2在反應微環境內富集現象明顯,導致H2O2局部濃度過高,對HRP產生毒害抑制作用,所以隨著GOx/HRP的升高酶活損失逐漸增大。另外,重復使用多次,酶的相對活性下降,這是因為每次反應會有部分酶分子泄露,而且產物富集會堵塞氧化硅的孔道,造成表觀酶活下降[28]。

圖7 固定化酶的重復使用性Fig.7 The number of reuses of immobilized enzyme

2.8 儲藏穩定性

目前來說衡量固定化酶性能優劣的一個非常重要的指標就是儲藏穩定性。如圖8所示,經過30 d的4 ℃冷藏存放后,游離雙酶系統活性為最初的65.5%,而固定化雙酶系統則為74.1%。一般來說微生物的降解作用是酶儲存過程中活力喪失的主要原因,固定化酶的微孔結構是防止微生物降解的主要屏障,所以固定化酶的儲藏穩定性優于游離酶。

圖8 固定化酶的儲藏穩定性Fig.8 The storage stability of immobilized enzyme

3 結論

將仿生硅化與脂質體技術相結合,在室溫條件下,實現了對葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶的同時固定,得到粒徑分布在200 nm左右的固定化酶微囊。研究發現,在200 μL PDADMA、0.7 mL TMOS、超聲50 min制得的固定化酶活性最高。在此優化條件下制備的固定化酶經重復使用7次,依然達到初始催化酶活的61.46%,經一個月冷藏后酶活仍能達到最初的74.1%。固定化雙酶較游離雙酶表現出更高的熱穩定性、操作穩定性及對變性劑的耐受能力。該固定化方法,既克服了有機載體易溶脹、機械強度差和無機載體質地脆、易破碎等缺點,又實現對氧化硅載體形貌的控制,獲得了活性和穩定性較高的固定化雙酶,為新型固定化酶系統的設計提供了新思路。

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權威·核心·領先·實用·全面

Immobilization of glucose oxidase and horseradish peroxidase in biomimetic silica particles

ZHOU Ran1,SONG Yu-pin1,LIU Xiao-mei1,XUN He-feng1,HOU Dong-mei1,WU Xin-rui2,LIU Ling-jun3

(1.School of Chemical Engineering,Shijiazhuang University,Shijiazhuang 050035,China;2.School of Chemical Engineering,Heibei University of Technology,Tianjin 300130,China;3.Hebei San Yuan Food Co.,Ltd.,Shijiazhuang 050000,China)

The fractional step method was applied to immobilize GOx and HRP by the combination of biomimetic silicification and liposome technology,using amine as an inducer,liposome as template. The time of ultrasonic,the dosage of PDADMA,the dosage of TMOS and the concentration of TritonX-100 on the effect of enzyme activity were studied. The results showed that the immobilized enzyme prepared with 200 μL PDADMA,0.7 mL TMOS,1% Triton X-100 and 50 min for ultrasound had the highest activity. The results of SEM showed that immobilized enzyme particles were near-spheres,which were about 200 nm. The immobilized enzyme prepared under the optimal conditions could be of higher stability and recovery rate. The immobilized enzyme repeated seven cycles could still retain 61.46% of its initial activity. In the storage of the 30 days,the relative activity of immobilized GOx could still retain 74.1% of its initial activity. Thus,the stability of the double enzyme system has been significantly improved after immobilization.

biomimetic silicification;liposome;glucose oxidase;horseradish peroxidase;nanosilica microcapsule

2016-07-18

周冉(1981-)女，博士，講師，研究方向：載體材料制備，E-mail：helly30072004@163.com。

河北省自然科學基金(H2016106034)；石家莊學院大學生創新訓練計劃項目(20160421)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)02-0221-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.034