金鯧魚內臟酸性蛋白酶的分離純化及酶學性質研究

張 培,申鉉日,李 川,段慶飛,王科威

(海南大學食品學院,海南海口 570228)

金鯧魚內臟酸性蛋白酶的分離純化及酶學性質研究

張 培,申鉉日*,李 川*,段慶飛,王科威

(海南大學食品學院,海南海口 570228)

以金鯧魚內臟為原料,依次采用pH7.0的磷酸鈉緩沖液浸提,0～55%硫酸銨沉淀,Sephadex G-100和Sephadex G-50凝膠過濾法得到純化的酸性蛋白酶,并研究了其酶學性質。結果表明,純化酶的分子量為18.5 ku,最適pH為4.0,最適溫度為35 ℃,具有較好的酸穩定性和耐鹽能力;以血紅蛋白為底物時,該蛋白酶的米氏常數Km為10.13 g/L;胃蛋白酶抑制劑(pepstatin A)對該酶活性有抑制作用,而乙二胺四乙酸(EDTA)、反-環氧丁二酰基-L-亮氨酰胺基(4-胍基)丁烷(E-64)和苯甲基磺酰氟(PMSF)對此酶活性基本無影響,據此推斷該蛋白酶是一種天冬氨酸蛋白酶;此酶對羅非魚魚皮明膠的酶解能力強于豬胃蛋白酶,與木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶的能力相近。

金鯧魚,內臟,酸性蛋白酶,酶學性質

蛋白酶是市場上需求最大的三種酶之一[1],在食品[2]、藥品[3]和化工[4]等方面都有著廣泛的應用。蛋白酶主要來源是陸生動物、植物和微生物,但來源于海洋和其他水生動物的蛋白酶并沒有被廣泛應用。有研究報道指出,一些水生來源蛋白酶在大范圍pH和溫度條件下都具有高活性,在食品加工中具有廣泛的應用前景[5]。

食品加工行業對魚類蛋白水解酶的需求量日益增加。魚內臟是水產品的加工過程中產生的主要副產品之一,可作為提取蛋白酶的重要來源。魚內臟中主要的消化蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶(如胃蛋白酶)和絲氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和膠原酶)。酸性蛋白酶最適活性在pH2.0～4.0之間,而堿性蛋白酶最適活性在pH8.0～10.0之間[6]。天冬氨酸蛋白酶一般在酸性或中性pH范圍內呈現活性,并且在活性位點都包含兩個天冬氨酸殘基[7]。目前,國內外學者已經從沙丁魚[8]、鱸魚[9]和黃鱔[7]等魚類內臟器官中分離出了天冬氨酸蛋白酶。

金鯧魚是我國南方沿海重要的海產經濟魚類之一,其魚肉細嫩,味道鮮美,國內市場對金鯧魚的需求不斷上升。目前,對于金鯧魚內臟酶類資源的開發利用研究較少。本實驗將對金鯧魚內臟蛋白酶進行分離純化,并對分離純化的酸性蛋白酶性質進行初步研究,為該酶的進一步開發應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮金鯧魚 海口沿江三路市場;蛋白質標準品 美國Thermo Fisher公司;胃蛋白酶(1200 U/g) 國藥集團化學試劑有限公司;木瓜蛋白酶(2000 U/mg)、堿性蛋白酶(200 U/mg) 西寧龐博生物工程有限公司;Sephadex G-100、Sephadex G-50 北京瑞達恒輝科技發展有限公司;牛血紅蛋白、E-64、pepstatin A、PMSF 美國Sigma公司;其他試劑 均為國產分析純。

ST-16R高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州奧華儀器有限公司;TV-1900/TV-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;DYY-2C電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗酶提取物的制備 粗酶提取物的制備參考肖鑫鑫等[10]的方法作適當修改。具體方法如下:新鮮的金鯧魚即殺后取內臟(46 g),使用冷蒸餾水洗凈,將內臟切成小段,加入預冷的三倍體積50 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液(pH7.0)進行勻漿,置于4 ℃下浸提3 h,離心(10000×g,15 min),所得上清液即為金鯧魚內臟粗酶提取物。

1.2.2 分離純化

1.2.2.1 硫酸銨沉淀 金鯧魚內臟粗酶粗提物(155 mL)經0～55%飽和度硫酸銨沉淀后,在4 ℃,10000×g下離心15 min,沉淀溶解在5 mL的50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中,然后在4 ℃的蒸餾水中透析24 h,每8 h換一次蒸餾水。

1.2.2.2 Sephadex G-100凝膠過濾層析 透析液上樣于Sephadex G-100凝膠柱(1.6 cm×100 cm),采用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.0)進行平衡,并用相同的緩沖液洗脫,流速為1.2 mL/min,3.6 mL/管,檢測波長為280 nm,收集活性峰。在冷蒸餾水中透析12 h后冷凍干燥。

1.2.2.3 Sephadex G-50凝膠過濾層析 將凍干樣品溶解于2 mL,50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中,上樣于Sephadex G-50凝膠柱(1.6 cm×100 cm),采用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.0)平衡柱子,并用相同緩沖液進行洗脫,流速為1.2 mL/min,3.6 mL/管,檢測波長為280 nm,收集活性峰。在冷蒸餾水中透析12 h后冷凍干燥。

1.2.3 酶活測定 蛋白酶活性的測定參考Anson等[11]的方法并適當修改,具體測定方法如下:50 μL酶液與500 μL 0.1 mol/L甘氨酸-HCl緩沖液(pH4.0)混合,加入500 μL 2%酸變性牛血紅蛋白后開始反應。在35 ℃下孵育20 min后,混合物添加500 μL的20.0%三氯乙酸(TCA),然后在10000×g下離心10 min。上清液在280 nm下測定吸光度。在上述反應體系中,將20 min內蛋白酶消化底物使其上清液吸光度增加1.0定義為一個酶活單位。蛋白酶活重復測定,重復樣本間的差異小于5%;中間值被采用。

1.2.4 蛋白含量測定 以牛血清白蛋白為標準樣品,按Lowry法[12]進行測定。

1.2.5 蛋白酶分子量測定 根據Laemmli法[13],采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定,分離膠濃度為12.5%。

1.2.6 最適pH和溫度 在35 ℃下,以2%牛血紅蛋白作為底物,pH1.0～7.0的范圍內測定酶活來確定酶的最適pH。在pH4.0,20～60 ℃的不同溫度條件下測定酶活,計算相對酶活來確定最適溫度。最適pH和溫度下的酶活設定為100%。選用的緩沖液體系為:100 mmol/L甘氨酸-HCl緩沖液,pH1.0～4.0;100 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液,pH5.0～6.0;100 mmol/L磷酸緩沖液,pH7.0。

1.2.7 pH穩定性和熱穩定性 將酶置于不同pH環境中處理30 min后,在35 ℃下,以2%牛血紅蛋白為底物,測定酶液殘余活力,以確定金鯧魚內臟酸性蛋白酶pH穩定性。酶液分別在20、30、35、40、50、60 ℃條件下處理30 min后,測定酶液殘余活力,以確定金鯧魚內臟酸性蛋白酶熱穩定性。

1.2.8 NaCl濃度對酶活的影響 分別測定NaCl濃度為5%、10%、15%、20%和25%條件下的酶活,不加NaCl作為空白對照組,對應的酶活設定為100%。

1.2.9 米氏常數Km的測定 在35 ℃,pH4.0的條件下分別以質量濃度為5、4、3、2、1、0.5 g/L的血紅蛋白溶液為底物,用雙倒數作圖法(Lineweaver-Burk法)作圖,y=0時的x負倒數即為Km值。

1.2.10 抑制劑對酶活的影響 分別添加四種不同類型的蛋白酶抑制劑(pepstatin A、E-64、EDTA和PMSF)到酶液中,使其終濃度分別為:0.1 mg/mL、0.1 mg/mL、5 mmol/L和5 mmol/L。混合物35 ℃下放置30 min后,以血紅蛋白為底物分別測定其相對活力,以不添加抑制劑的酶液活性作為對照,設為100%。

1.2.11 幾種不同蛋白酶對羅非魚魚皮明膠酶解能力研究 羅非魚魚皮明膠采用郭培等[14]的方法制備。取1 mL濃度為10 mg/mL的羅非魚皮明膠溶液,加入0.85 U的金鯧魚內臟酸性蛋白酶、豬胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶,然后在各自適宜的pH和溫度(金鯧魚內臟酸性蛋白酶為pH4.0,35 ℃;豬胃蛋白酶為pH2.0,37 ℃;木瓜蛋白酶為pH6.0,50 ℃;堿性蛋白酶為pH10.0,50 ℃)下反應60 min后,煮沸3 min終止反應。用分離膠為7.5%,濃縮膠為4.5%的SDS-PAGE檢測反應后的分子量分布。

1.2.12 統計分析 每組實驗分別進行三次獨立的重復實驗,用SPSS 19.0 for Windows軟件對數據進行方差分析。采用Origin 7.5軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 金鯧魚內臟酸性蛋白酶的分離純化

金鯧魚內臟粗提物經0～55%飽和度的硫酸銨沉淀后,運用Sephadex G-100層析柱洗脫,如圖1(A)得到5個蛋白峰,第1個峰酶活最高,合并活性峰組分,透析凍干后,上樣于Sephadex G-50層析柱,如圖1(B)所示,得到3個蛋白峰,收集合并活性最高峰峰1,透析凍干后備用。

圖1 金鯧魚內臟酸性蛋白酶的純化圖Fig.1 Sephadex G-100(A),Sephadex G-50(B)column chromatographic profiles for purification of acid protease from golden pompano viscera注:A:Sephadex G-100凝膠層析;B:Sephadex G-50凝膠層析。

純化實驗結果如表1所示,經過硫酸銨鹽析、Sephadex G-100和Sephadex G-50凝膠過濾等一系列步驟純化后,得到12.65 mg蛋白,酶活得率為20.95%,純化倍數為17.79。Khaled等[8]從沙丁魚內臟中分離出的天冬氨酸蛋白酶得率為23.3%,純化倍數為9.47。林建城等[15]從日本鰻鱺腸道中分離出蛋白酶得率為42.01%,純化倍數為18.12。實驗中純化得率較低可能是由于分離純化過程沒有達到最優化,造成蛋白酶的損失。

SDS-PAGE結果如圖2所示,考馬斯亮藍染色顯示一條蛋白帶,純化酶相對分子量約為18.5 ku。該分子量低于黃鱔[16]胃部蛋白酶(36 ku)和魷魚[17]肝胰腺中組織蛋白酶D(36.5 ku)的分子量。與Khaled等[8]從沙丁魚內臟中提取的天冬氨酸蛋白酶分子量接近(17 ku)。

圖2 金鯧魚內臟酸性蛋白酶的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of acid proteasefrom golden pompano viscera注:1:蛋白Marke;2:純化酶。

2.2 pH對純化酶酶活及穩定性的影響

如圖3最適pH曲線所示,純化酶在pH4.0酶活達到最大值,說明該酶的最適pH為4.0,為酸性蛋白酶。隨著pH的升高,金鯧魚內臟酸性蛋白酶在pH1.0～4.0范圍內活性逐漸增加;在pH4.0～7.0范圍內活性逐漸減小。pH為1.0和7.0時酶活較低,推測可能由于蛋白酶在強酸和中性條件下,自身所帶電荷數改變從而導致蛋白構象發生變化引起。

圖3 pH對純化酶酶活及穩定性的影響Fig.3 The effect of pH on the activity and stability of purified protease

如圖3 pH穩定性曲線所示,純化酶在偏酸性環境下有較高的穩定性,在35 ℃下孵育30 min后,在pH1.0～5.0范圍內酶活維持了初始活性的60%以上。這與之前的研究結果相符,Khaled等[8]從沙丁魚中提取出一種酸性蛋白酶在pH1.0～5.0條件下穩定。

2.3 溫度對純化酶的酶活及穩定性影響

金鯧魚內臟酸性蛋白酶的溫度曲線如圖4所示。在35 ℃下達到最大值,說明其最適溫度為35 ℃。隨著溫度的升高,金鯧魚內臟酸性蛋白酶在20～35 ℃范圍內活性逐漸增加;在35～60 ℃范圍內活性逐漸減小。該酶最適溫度低于長鰭金槍魚[18](50 ℃)和海鯛[19](45 ℃)酸性蛋白酶,與歐洲鰻鱺[20](35 ℃)酸性蛋白酶相同。最適溫度的不同可能與生長環境和物種導致的酶構效差異有關。

圖4 溫度對純化酶酶活及穩定性的影響Fig.4 The effect of tempreature on the activity and stability of purified protease

熱穩定性曲線如圖4所示。金鯧魚內臟酸性蛋白酶表現出一定的耐熱性,20～40 ℃時孵育30 min仍保持60%以上的活性。溫度高于40 ℃,酶活急劇下降。60 ℃下殘留活性降至24.4%。

2.4 NaCl濃度對酶活的影響

NaCl濃度對金鯧魚內臟酸性蛋白酶酶活的影響如圖5所示。隨著NaCl濃度的增加,酶活逐漸降低。當NaCl濃度為10%時,相對活性為60.27%;濃度為25%時,相對活性降至31.5%。活性降低可能由于NaCl濃度增加引起“鹽析”作用有關。高濃度的氯化鈉可能與酶競爭水結合,導致更強的蛋白質-蛋白質相互作用,從而引起沉淀。Khaled等[8]報道了沙丁魚純化酶在10% NaCl濃度下相對活性降為20%。Klomklao等[21]也報道了一種鱈魚胃中提取的兩種蛋白酶活性隨著NaCl濃度的升高而活性降低。

圖5 NaCl濃度對純化酶酶活的影響Fig.5 The effect of NaCl concentration on the activity of purified protease

2.5 酶的米氏常數Km

通過測定不同底物濃度下的反應速度,可以確定酶催化反應的米氏常數Km。采用雙倒數作圖法(Lineweaver-Burk法),以1/V為縱坐標,1/[S]為橫坐標作圖。如圖6所示,金鯧魚內臟酸性蛋白酶的Km為10.13 g/L。

圖6 Lineweaver-Burk圖Fig.6 Lineweaver-Burk

2.6 抑制劑對酶活的影響

不同抑制劑對金鯧魚內臟酸性蛋白酶活性的影響如表2所示,Pepstatin A(天冬氨酸蛋白酶抑制劑)對純化酶活性有強烈抑制作用,說明該酶活性中心具有天冬氨酸殘基,是一種天冬氨酸蛋白酶;E-64(半胱氨酸蛋白酶抑制劑)、EDTA(金屬蛋白酶抑制劑)和PMSF(絲氨酸蛋白酶抑制劑)對純化酶活力基本無影響,說明該酶可能不屬于半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶。

表2 不同抑制劑對金鯧魚內臟酸性蛋白酶活性的影響Table 2 Effect of inhibitors on activity of acid protease from golden pompano viscera

注:ND代表未檢出。

2.7 幾種不同蛋白酶對羅非魚魚皮明膠酶解能力研究

圖7 羅非魚魚皮明膠酶解產物電泳圖Fig.7 SDS-PAGE of Tilapia skin gelatin hydrolysates注:1:未添加酶的羅非魚魚皮明膠;2:純化酶處理明膠;3:豬胃蛋白酶處理明膠;4:木瓜蛋白酶處理明膠;5:堿性蛋白酶處理明膠。

圖7為利用不同蛋白酶酶解羅非魚魚皮明膠獲得的明膠水解產物的電泳圖,如泳道1所示,不添加酶的羅非魚魚皮明膠電泳圖上方有膠原蛋白特征的3條帶,分別為α1、α2和β鏈。分析試樣2～5的電泳條帶可知,添加酶反應60 min后,大分子量條帶均呈現不同程度的水解現象。其中金鯧魚內臟酸性蛋白酶處理的明膠水解產物與豬胃蛋白酶處理組相比分子量更小,說明金鯧魚內臟蛋白酶對羅非魚明膠的酶解能力強于胃蛋白酶。該結果與肖鑫鑫等[10]的實驗結果相似。內臟酸性蛋白酶處理的明膠水解產物與木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶處理組相近,說明金鯧魚內臟蛋白酶對羅非魚明膠的酶解能力與木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶相似。酶法是制備明膠水解產物的方法之一,酶促水解得到的水解明膠分子量分布較窄,容易被人體吸收。Ngo等[22]使用不同的蛋白酶酶解羅非魚魚鱗明膠制備出具有抗氧化活性的水解產物。本實驗可為金鯧魚內臟蛋白酶制備小分子膠原蛋白肽的應用方面提供參考。

3 結論

本研究經純化得到的金鯧魚內臟酸性蛋白酶比酶活為45.72 U/mg,純化倍數為17.79,回收率為20.95%;SDS-PAGE測定該酶的分子量約為18.5 ku。金鯧魚內臟酸性蛋白酶的最適pH為4.0,最適溫度為35 ℃,具有較好的酸穩定性和耐鹽能力。該酶的米氏常數Km為10.13 g/L,天冬氨酸蛋白酶抑制劑Pepstatin A能強烈抑制其酶活,而E-64、EDTA和PMSF對其基本沒有抑制效果,說明該酶屬于天冬氨酸蛋白酶類。用純化得到的金鯧魚內臟酸性蛋白酶酶解羅非魚魚皮明膠,結果發現其酶解能力強于豬胃蛋白酶,與木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶相似。本文為金鯧魚內臟酸性蛋白酶的進一步應用提供依據。

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Isolation,purification and enzymatic characterization of acid protease from golden pompano viscera

ZHANG Pei,SHEN Xuan-ri*,LI Chuan*,DUAN Qing-fei,WANG Ke-wei

(College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

Golden pompano viscera was taken as raw material in the present study. Acid protease was obtained by homogenation of tissue in sodium phosphate buffer(pH7.0),precipitation by 0～55% ammonium sulfate,Sephadex G-100 gel and Sephadex G-50 gel.Then the enzymatic characterization was also studied. The experimental results showed that the molecular weight of purification enzyme was 18.5 ku,the optimum pH was 4.0 and the most suitable temperature was 35 ℃. It had good acid stability and salt tolerance. Using hemoglobin as a substrate,the Kmwas 10.13 g/L. Pepstatin A inhibited the enzyme,while EDTA,E-64 and PMSF had no influence on the enzyme,which indicated that this enzyme was probably aspartic proteinase. It had the similar hydrolysis ability of gelatin of tilapia fish skin to papain and alkaline protease,and stronger than porcine pepsin.

golden pompano;viscera;acid protease;characterization

2016-08-09

張培(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：水產資源高效利用技術，E-mail:zhangpeilzx2014@163.com。

*通訊作者:申鉉日(1968-)，男，博士，教授，研究方向：海洋生物資源利用、食品科學、組織工程學，E-mail:shenxuanri2009@163.com。 李川(1986-)，男，博士，講師，研究方向：熱帶水產品的精深加工、食品營養與功能評價，E-mail:lichuanbest@126.com。

國家自然科學基金資助項目(31260376)；海南省科協青年科技英才學術創新計劃項目(HAST201624)；海南大學科研啟動基金項目(KYQD1609)。

TS254.1

A

1002-0306(2017)02-0210-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.032