青藏高原部分地區牦牛與黃牛源沙門氏菌的分離鑒定與藥敏實驗

柏 雪,郭春華,劉少文,譚子璇,陳 宇,文勇立

(1.西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041;2.西南民族大學青藏高原研究院,四川成都 610041)

青藏高原部分地區牦牛與黃牛源沙門氏菌的分離鑒定與藥敏實驗

柏 雪1,郭春華1,劉少文1,譚子璇1,陳 宇1,文勇立2,*

(1.西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041;2.西南民族大學青藏高原研究院,四川成都 610041)

沙門氏菌(Salmonella)是一種重要的人畜共患病原菌。本研究采集了來自青藏高原部分地區的無腹瀉癥狀的牦牛樣品(194份)及黃牛樣品(98份)共計292份,進行沙門氏菌株分離與鑒定并進行抗生素藥敏實驗。結果發現在牦牛樣品中分離出15株沙門氏菌,其中糞便的檢出率為9.23%,肌肉檢出率為4.44%,肝臟檢出率為11.86%,總檢出率為7.73%,共5種血清型;在無腹瀉癥狀的黃牛樣品中分離出12株沙門氏菌,其中糞便的檢出率為22.86%,肌肉檢出率為2.70%,肝臟檢出率為11.54%,總檢出率為12.24%,共4種血清型。在藥敏實驗中,牦牛源的沙門氏菌總體耐藥性小于黃牛源。但牦牛和黃牛源都對四環素、林可霉素、麥迪霉素等抗生素都呈現較高的耐藥性。從實驗結果可以得出,牦牛的沙門氏菌感染率和耐藥性都低于黃牛。

黃牛,牦牛,沙門氏菌,血清型,抗生素

沙門氏菌(Salmonella)是一種重要的人畜共患病原菌[1]。近年來,沙門氏菌給青藏高原地區家畜生長帶來嚴重損害,同時也威脅著廣大牧民的身體健康。研究表明,牦牛沙門菌病在青藏高原牧區長期流行,發病率達20%～40%,致死率達30%～60%[2-3]。王慧玲等[4]對甘蘭州合作市的186頭有腹瀉癥狀的犢牦牛進行病原菌調查,發現沙門氏菌檢出率達13.5%;關龍伏等[5]研究表明,健康牦牛腸系膜淋巴結沙門氏菌檢出率為6.7%。沙門氏菌病原體對外界抵抗力強,可在土壤、水、糞便中存活數10個月[1],該病感染牛不分年齡,不分品種。目前,關于青藏高原地區健康牦牛和黃牛沙門氏菌感染的報道并不多見,而有關牦牛肉等畜產品中沙門氏菌污染的報道更為罕見。因此,本研究采集了來自中國青藏高原川西北地區的無腹瀉癥狀牦牛樣品(194份)及黃牛樣品(98份)共計292份,應用常規沙門氏菌國標分離技術進行菌株分離與鑒定,最后采用17種抗生素進行藥敏實驗,以期了解青藏高原反芻動物牦牛及黃牛沙門氏菌的感染程度以及對各類抗生素的耐藥程度,同時為保障高原地區動物健康及畜產品安全提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

緩沖蛋白胨水(BPW)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂和沙門氏菌-志賀氏菌瓊脂培養基(SS) 杭州微生物試劑有限公司;沙門氏菌屬診斷血清 寧波天潤生物藥業有限公司;頭孢噻肟(CTX)、氨芐西林(AMP)、頭孢拉定(CED)、頭孢曲松(CR0)、鏈霉素(STR)、慶大霉素(GEN)、萬古霉素(VA)、卡那霉素(KAN)、四環素(TET)、氯霉素(CHL)、林可霉素(MY)、左氧氟沙星(LEV)、環丙沙星(CIP)、吡哌酸(PPA)、麥迪霉素(MID)、乙酰螺旋霉素(SPI)和羅紅霉素(Rox) 杭州微生物試劑有限公司。

SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;THZ-98C恒溫振蕩培養箱 上?？茖W儀器有限公司;SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 樣品采集

2015年12月至2016年3月于四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣和汶川縣采集無腹瀉癥狀牦牛糞便(65份)、肝臟(59份)、肌肉(45份)、腸系膜(12份)和心肌(13份);于四川省阿壩藏族羌族自治州汶川縣和四川省成都市青白江屠宰場采集無腹瀉癥狀黃牛糞便(35份)、肝臟(26份)和肌肉(37份)。由于現場采樣困難,黃牛的腸系膜與心肌樣品未能采集。

1.3 采樣方法

糞便樣品來自于屠宰前位于地表上部的新鮮未污染糞便。其它肉樣屠宰后立即采集?？紤]到現場采樣的難度,黃牛與牦牛肌肉選擇腹部肌肉。采集的樣品放入無菌封樣袋內,并作好標記,-4 ℃冰箱保存,6 h內送回西南民族大學生命科學與技術學院動物營養實驗室,立即檢測樣品沙門氏菌感染情況。

1.4 檢測方法

參照國家標準GB 4789.4-2010《食品衛生微生物學 沙門氏菌檢驗方法》[6]對樣品進行沙門氏菌檢測及血清學分型。藥敏實驗參照WHO推薦的K-B瓊脂紙片擴散法。挑取已純化的沙門氏菌單菌落,接種于MH營養肉湯液體培養基中,37 ℃培養18～24 h,測定菌體濃度,用滅菌后的生理鹽水稀釋菌液至0.5麥氏單位的標準菌懸液,再準確吸取1 mL菌液至營養瓊脂平板內均勻涂布,放置數分鐘后,用無菌鑷子夾取藥敏試紙片于瓊脂培養基表面,倒置培養18～24 h后測定抑菌圈直徑(d)。藥敏結果按NCCLS標準作出判斷,即:d≤1 cm為耐藥;1 cm1.5 cm為高度敏感[7]。

2 結果與分析

2.1 青藏高原地區牦牛及黃牛沙門氏菌檢測情況

由表1可知,青藏高原地區牦牛樣品沙門氏菌總體檢出率為7.73%,而黃牛為12.24%。黃牛糞便沙門氏菌檢出率為22.86%,是牦牛的2.5倍;牦牛與黃牛肝臟沙門氏菌檢出率差距不大,均為11.50%左右,牦牛稍高;牦牛與黃牛肌肉中的沙門氏菌檢出率均較低,不超過5.0%,牦牛為4.44%,黃牛為2.70%;牦牛腸系膜與心肌中未檢測出沙門氏菌。

表1 青藏高原牦牛及黃牛樣品沙門氏菌感染情況Table 1 The Salmonella contamination in yak and cattle

2.2 沙門氏菌血清型分布

青藏高原地區牦牛及黃牛源沙門氏菌血清型分布見表2。由表2可知,牦牛樣品一共分離到15株沙門菌株,共5種沙門血清型,黃牛樣品中一共分離到12株沙門菌株,共4種沙門血清型,其中紐波特沙門氏桿菌(S.newport)只在牦牛中檢出。無論是牦牛還是黃牛,腸炎沙門氏桿菌(S.enteritidis)血清型的比例都較高。

牦牛糞便中含都柏林沙門氏菌(S.dublin)、鼠傷寒沙門氏桿菌(S.typhimurium)、圣保羅沙門氏菌(S.saintpaul)和腸炎沙門氏桿菌(S.enteritidis),黃牛糞便中不含都柏林沙門氏菌(S.dublin),其它三種血清與牦牛相同。牦牛肝臟中的沙門血清為腸炎沙門氏桿菌(S.enteritidis)、圣保羅沙門氏菌(S.saintpaul)和都柏林沙門氏菌(S.dublin),而黃牛肝臟中只分離到了腸炎沙門氏桿菌(S.enteritidis)和圣保羅沙門氏菌(S.saintpaul)。牦牛肌肉中的沙門氏菌分別為紐波特沙門氏桿菌(S.newport)和腸炎沙門氏桿菌(S.enteritidis),而黃牛僅為傷寒沙門氏菌(S.typhi)。

表2 牦牛與黃牛源沙門氏菌血清型Table 2 The serovar of yak and cattle Salmonella

表3 牦牛及黃牛源沙門氏菌對抗生素的敏感程度Table 3 The antibiotic resistance of Salmonella

2.3 抗生素敏感實驗

牦牛及黃牛源沙門氏菌抗生素藥敏實驗結果見表3。由表3可知,牦牛和黃牛中分離得到的沙門氏菌對不同類別的抗生素均呈現不同程度的敏感和耐藥。牦牛源沙門氏菌對β-內酰胺類抗生素的耐藥率均不超過15%，其中對頭孢曲松表現為高度敏感(93.33%)；而黃牛樣品中分離出的沙門氏菌同樣對β-內酰胺類抗生素的耐藥率較低，對頭孢噻肟則表現為高度敏感(75%)。

氨基糖苷類抗生素中,牦牛源沙門氏菌對萬古霉素的耐藥率最高,為60%,對鏈霉素和卡那霉素的耐藥率為0;黃牛源沙門氏菌同樣對萬古霉素的耐藥率最高,為41.67%,而對鏈霉素的耐藥率為16.67%,高于牦牛樣品,中等敏感率為33.33%,低于牦牛樣品,同時對慶大霉素表現為高度敏感。

本研究分離到的牦牛樣品和黃牛樣品中的沙門氏菌對四環素類、林可霉素類、氯霉素類和大環內酯類表現出相似的耐藥規律:對林可霉素類抗生素和麥迪霉素耐藥率非常高(牦牛:93.33%,黃牛:83.33%;牦牛:93.33%,黃牛:91.67%);對四環素和對乙酰螺旋霉素的耐藥率高于60%;對羅紅霉素的耐藥率高于40%;相較于前幾種抗生素,對氯霉素的耐藥率相對較低(牦牛:20%;黃牛:33.33%)。

喹諾酮類抗生素中,牦牛樣品中沙門氏菌對左氧氟沙星的耐藥率為0,同時高度敏感率為66.67%,對環丙沙星的耐藥率為6.67%;黃牛樣品中沙門氏菌對左氧氟沙星的耐藥率為8.33%,高度敏感率為41.67%,但對環丙沙星的耐藥率遠高于牦牛樣品,為41.67%。

3 討論

3.1 牦牛及黃牛感染沙門氏菌的比較

中國青藏高原地區面積廣闊,牧草資源豐富,是國內高原畜產品的供應基地。據2001年統計,我國青藏高原牦牛(奶、肉、皮毛制品)每年至少為牧民創造64億元財富[8],極大地促進了中國西部民族地區經濟的發展。然而,牦牛與黃牛每年因沙門氏菌病造成的危害與損失也不計其數。詹發茂[9]調查發現,由都柏林沙門氏菌引起的放牧牦牛副傷寒在甘肅省天?？h普遍存在,發病率高達30%。儲倩等[10]采集了1262例來自甘孜藏族自治州和阿壩藏族羌族自治州的健康牦牛分離基物,分離得到103株沙門氏菌,分離率為8.17%。本研究中,對于健康牦牛樣品,沙門氏菌的總檢出率為7.73%,與其結果類似。

本研究中,無腹瀉癥狀黃牛樣品中沙門氏菌檢出率高于牦牛,特別是黃牛糞便沙門氏菌檢出率約為牦牛糞便的2.5倍,推測原因可能有以下幾點:一是此次采樣,黃牛飼養方式均為圈養,牦牛為圈養與放牧均有,由于沙門氏菌為傳染性疾病,而圈養密度大于放牧,所以在圈養環境中如果控制不當,沙門氏菌的感染率會更高;二是由于使用大量抗生素在黃牛疾病上,導致黃牛源沙門氏菌的耐藥性大于牦牛。其次,無腹瀉癥狀黃牛肌肉樣品中沙門氏菌的檢出率低于牦牛肌肉樣品,但是均不超過5%?？赡苁怯捎陉笈２蓸拥氐耐涝讏龅耐涝篆h境比黃牛采樣地的屠宰場差導致的。

與此同時,本研究在無腹瀉癥狀牦牛的心肌和腸系膜樣品中未分離出沙門氏菌,提示心肌和腸系膜可能不是沙門氏菌寄生的主要靶器官。

3.2 牦牛及黃牛源沙門氏菌的血清型分布

沙門氏菌在自然界分布極廣,且種類繁多。目前,全世界已分離得到的沙門氏菌血清型多達2500多種[11-12]。董映輝等[13]調查發現,川西北高原甘孜州爐霍縣的牦牛主要感染腸道沙門氏菌,且該菌在24 h內可使小鼠全部死亡。張斌等[14]從青藏高原部分地區的健康牦牛糞便中分離到8種不同的血清型,包括腸炎沙門菌(29.03%)、都柏林沙門菌(32.26%)、鼠傷寒沙門菌(12.9%)、紐波特沙門菌(3.22%)和布利丹沙門菌(6.45%)等,而本實驗在牦牛糞便和組織中只分離出了5種(腸炎沙門菌、都柏林沙門菌、鼠傷寒沙門菌、紐波特沙門菌和圣保羅沙門氏菌),但值得注意的是圣保羅沙門菌未見文獻報道。

本研究發現無腹瀉癥狀黃牛分離出的沙門氏菌血清種類少于牦牛,特別是肌肉中沙門氏菌血清型(傷寒沙門菌)與牦牛(腸炎沙門菌、紐波特沙門菌)完全不同,這可能和不同血清型的沙門氏菌的侵襲力不同有關[15-16],也和牦牛與黃牛不同飼養方式下機體免疫狀態有關。本研究樣品采集時間為12月到3月,氣候寒冷(特別是牦牛生活在高海拔地區),草料枯竭,牦牛處于饑餓的維持狀態,體質較差,病原菌侵襲機體更為容易。

3.3 牦牛及黃牛源沙門氏菌抗生素耐藥性

通過藥敏實驗可以看出,無論是15株青藏高原牦牛源還是12株黃牛源沙門氏菌,對17種抗生素都呈現出不同的耐藥性,這與王傲雪[17]等的研究結果大致相同。對于治療疾病常用的四環素等,無論是牦牛源還是黃牛源都表現出極高的耐藥性,這些藥物長久以來一直作為我國獸用的常規抗生素,使用泛濫,造成了嚴重的耐藥性,此種類的抗生素應謹慎使用。整體看來黃牛源沙門氏菌對于抗生素的耐藥率遠高于牦牛,這與其飼養管理的方式密切相關。黃牛生活在半農半牧區,養殖方式一般為散養加圈養,而牦牛幾乎都是處于全放牧的原始養殖模式,因此黃?？股氐挠昧恳h遠高于牦牛,這導致其沙門氏菌的耐藥性較高。

儲倩等[10]2011年采集四川阿壩州和甘孜州的健康成年牦牛進行沙門氏菌藥敏實驗的結果表明,分離出的9株菌對氯霉素、四環素、氨芐青霉素和阿莫西林等14種抗生素均表現為敏感,沒有發現耐藥菌株。而在本研究中,牦牛源沙門氏菌對氯霉素和四環素的耐藥率分別為20%和60%,高于前者報道,這可能與各地區流行菌株不同和抗菌藥物的使用不同有關,但更可能的原因是隨著畜牧業的發展,青藏高原地區的抗生素的使用也變得更為廣泛和頻繁,這導致了抗生素耐藥性情況愈發嚴重,值得注意。要預防這類問題的出現,必須堅決杜絕抗生素的濫用,加強對該菌耐藥性的監測力度和耐藥機制的研究。

4 結論

對來自青藏高原部分地區無腹瀉癥狀的牦牛和黃牛進行沙門氏菌分離鑒定,分別分離出15株牦牛源沙門菌株和12株黃牛源沙門菌株,同時發現與黃牛相比,牦牛的沙門氏菌感染率更低,對抗生素的耐藥性也更低,但耐藥性有逐年加重的趨勢。因此,為保障牦牛與黃牛的健康與畜產品的安全,應加強對抗生素使用的管理,杜絕抗生素濫用。

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Study on the serovar and antibiotic resistance of yak and cattleSalmonellafrom some areas of Qinghai-Tibetan plateau

BAI Xue1,GUO Chun-hua1,LIU Shao-wen1,TAN Zi-xuan1,CHEN Yu1,WEN Yong-li2,*

(1.College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China;2.Institute of Qinghai-Tibetan Plateau,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

Salmonellais an important zoonotic pathogens. This study collected 292 healthy yak and cattle samples in Sichuan Northwest plateau forSalmonellaseparation and of which antibiotic resistance research. The results showed that 15 plantsSalmonella(5 serovars)were isolated in yak which had no diarrhea symptoms samples,and the total detection rate was 7.73%,and the detection rate in fecal was 9.23%,muscle was 4.44%,liver was 11.86% respectively. 12 plantsSalmonella(4 serovars)were isolated in cattle which had no diarrhea symptoms samples,and total detection rate was 12.24%,the detection rate in fecal was 22.86%,muscle was 2.70%,liver was 11.54% respectively. In the antibiotic susceptibility test,the resistance of yakSalmonellawas less than cattle. However,yak and cattleSalmonellawere showed high resistance to tetracycline,lincomycin and midecamycin. The yakSalmonellainfection and antibiotic resistance were lower than cattle.

cattle;yak;Salmonella;serovar;antibiotic

2016-05-27

柏雪(1985-)，女，碩士，實驗師，主要從事飼料及畜產品安全方面的研究，E-mail:yukivy@163.com。

*通訊作者:文勇立(1959-)，男，博士，教授，主要從事生態及畜產品安全方面的研究，E-mail:wansit99@163.com。

國家科技支撐計劃課題“牛肉安全生產技術集成與示范”(2014BAD13B03)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)02-0196-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.029