單增李斯特菌的生長特性及其在冷藏牛奶中的預測模型

劉珊娜,趙 森,孫 濤,范志華,張陳云

(1.天津農學院食品科學與生物工程學院,天津 300384;2.天津市農副產品深加工技術工程中心,天津 300384)

單增李斯特菌的生長特性及其在冷藏牛奶中的預測模型

劉珊娜1,2,趙 森1,孫 濤1,范志華1,2,張陳云1,2

(1.天津農學院食品科學與生物工程學院,天津 300384;2.天津市農副產品深加工技術工程中心,天津 300384)

通過測定單增李斯特菌菌株在不同培養條件下菌液的OD600值,繪制生長曲線,分析培養基成分、溫度、pH、NaCl濃度、接種量以及轉速對單增李斯特菌生長的影響,并選取Gompertz方程、Logistic方程和Hill方程建立單增李斯特菌在冷藏牛奶中的生長模型。結果表明:菌株在TSB-YE和MRS培養基中生長良好;能夠耐受0.5%～3%的NaCl濃度范圍;最適生長溫度為37 ℃,最適生長pH為8,對氧氣的需求量表現不明顯。菌株可在4 ℃冷藏的全脂牛奶中緩慢生長,達到穩定期的菌數有2 lg CFU/mL的增長,Gompertz和Logistic方程模型可用于預測其生長情況。

單增李斯特菌,牛奶,預測,生長曲線

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)是一種人畜共患食源性致病菌,可以使人畜患心肌炎、腦膜炎、早產、敗血癥等疾病,危害嚴重[1]。2015年就有報道美國藍鈴公司銷售LM污染的冰激凌導致3人死亡[2]。我國寧夏地區2006～2013年LM污染率也高達18.38%[3]。LM廣泛存在于自然界中,是食品中最常見的食源性病原菌[4],可污染的食品包括乳制品、肉制品、海產品及蔬菜制品等。由于LM能夠耐受低溫、低pH和高鹽濃度[5],給食品的加工、運輸和保藏等環節帶來潛在風險。有效地控制食品中的LM已經成為食品安全的重要課題之一[6]。據報道,LM能夠耐受巴氏消毒,對生鮮乳、巴氏殺菌乳等相關乳制品造成食用風險[7]。因此,研究LM在不同條件下的生長情況對保障食品安全十分必要。

預測微生物學用于描述和預測微生物在一定條件下的生長情況,對食品安全做出快速評估,目前已經應用于蔬菜、肉制品、水產品和乳制品等食品中[8]。張引成[9]、趙楠等人[10]也分別建立了LM在新鮮蔬菜和醬鹵肉中的預測模型。本論文系統分析了一株LM在不同的培養基、pH、NaCl濃度、溫度等條件下的生長情況,建立了LM在冷藏牛奶中的生長預測模型。對LM生長特性的認識將會為該菌的純培養及實際防治提供參考依據,為評估食品安全帶來積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 單增李斯特菌CVCC1595,購于中國獸藥監察中心;培養基 TSB-YE培養基、MRS培養基、TGE培養基、LB培養基,按文獻進行配制[11-12];牛奶 市售全脂牛奶。

PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;722可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;GHP-9160恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;TS-100B搖床 上海儀純實業有限公司;NO-425-400E生物安全柜 天美(中國)科學儀器有限公司;SW-CJ-1FS超凈工作臺 蘇州金大凈化工程設備有限公司;5A2003電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化 用無菌接種環挑取4 ℃下保存的斜面菌種加入無菌的TSB-YE培養基試管中,置于37 ℃培養12 h后,用劃線法接種于無菌的TSA-YE平板上,置于37 ℃過夜培養,挑取典型的單菌落接種于TSB-YE中,37 ℃下培養至菌液濃度達到108CFU/mL備用。

1.2.2 菌種接種量的選擇 將活化的菌液做10倍梯度稀釋,然后分別以105、104、103CFU/mL接種至TSB-YE液體培養基中,37 ℃恒溫培養12 h,每2 h測定其OD600值繪制生長曲線。

1.2.3 培養基的選擇 將活化的菌種以105CFU/mL分別接種于TSB-YE、MRS、TGE、LB四種液體培養基中,37 ℃恒溫培養12 h,每2 h測定其OD600值繪制生長曲線。

1.2.4 培養溫度的選擇 將活化的菌種以104CFU/mL接種于TSB-YE液體培養基中,分別在25、30、35、37、40、45 ℃恒溫培養12 h,每2 h測定其OD600值繪制生長曲線。

1.2.5 NaCl濃度的選擇 將活化的菌種以104CFU/mL分別接種到0.5%～6% NaCl濃度的TSB-YE液體培養基中,置于37 ℃恒溫箱中培養12 h,每2 h測定其OD600值繪制生長曲線。

1.2.6 pH的選擇 將活化的菌種以104CFU/mL分別接種到pH4～10的TSB-YE液體培養基中,置于37 ℃恒溫箱中培養12 h,每2 h測定其OD600值繪制生長曲線。

1.2.7 搖床轉速(r)的選擇 將活化的菌種以104CFU/mL接種于TSB-YE液體培養基中,分別于靜置、100和200 r/min的轉速在37 ℃搖床培養12 h,每2 h測定其OD600值繪制生長曲線。

1.2.8 冷藏牛奶中LM生長曲線的測定 將活化的菌種分別以102、103CFU/mL接種于全脂牛奶中,4 ℃靜置培養15 d,每隔2 d取出試樣,用平板計數法測定其菌落總數。

1.2.9 預測模型的建立 采用Gompertz方程、Logistic方程和Hill方程[13],建立相應的模型。其中上述三種方程的具體公式為:

Gompertz方程:N(t)=N0+a·exp[-exp(b-c·t)]

其中,t為時間,d;N(t)為t時的菌數,lg CFU/mL;N0為初始菌數,lg CFU/mL;a、b和c為待定系數。

Logistic方程:N(t)=N0+a/[1+exp(b-c·t)]

式中,t為時間,d;N(t)為t時的菌數,lg CFU/mL;N0為初始菌數,lg CFU/mL;a、b和c為待定系數。

Hill方程:N(t)=N0+a/[1+(t/b)c]

式中,t為時間,d;N(t)為t 時的菌數,lg CFU/mL;N0為初始菌數,lg CFU/mL;a、b和c為待定系數。

1.3 數據處理

實驗數據采用SPSS進行處理和分析,通過MATLAB軟件對上述三種模型進行擬合。

2 結果與分析

2.1 接種量的影響

如圖1所示,105和104CFU/mL接種量在6 h后菌體數量達到穩定,而103CFU/mL接種量的菌液OD值在8 h后達到最大值。接種量的不同導致菌體生長速度的快慢,因此在食品加工或保藏中應注意控制初始帶菌率。有關接種量對LM生長情況影響的研究有限,周小紅等[14]研究也表明接種水平降低使菌種生長所需的延滯時間增加。

圖1 LM在不同接種量下的生長曲線Fig.1 Growth curves of L. monocytogenes in different inoculation amounts

2.2 培養基對LM生長的影響

由圖2可知，LB與TGE培養基中菌體的生長相對緩慢,達到穩定期后的OD值分別在0.6和1.0左右。而LM在TSB-YE與MRS培養基中的生長變化明顯,到達穩定期的時間為6 h。說明LM的生長需要營養物質,這也和其易污染營養豐富的食品基質相吻合。考慮到配制簡便性,研究中可選擇TSB-YE培養基作為LM的基本培養基。

圖2 LM在不同培養基中的生長曲線Fig.2 Growth curves of L. monocytogenes in different cultures

圖3 LM在不同溫度下的生長曲線Fig.3 Growth curves of L. monocytogenes at different temperatures

2.3 培養溫度對LM生長的影響

為了抵抗外界熱激作用,LM具有熱休克應答機制,由細胞膜結構及胞內大分子參與,不同來源LM對溫度適應性有所不同[15]。25 ℃時,菌液的OD600值變化很小;在30～40 ℃范圍內,隨著溫度升高,菌體繁殖速度逐漸加快,在37 ℃時增至最大值;而隨著溫度的繼續升高,菌體生長速度開始下降,至45 ℃時菌體生長處于延滯期。研究表明生長溫度還依賴于pH,低pH的條件下,生長溫度會上升[16]。根據LM對熱的抵抗力較差,食品加工中提高處理溫度或將加工時間控制在延滯期內能夠有效預防污染。

2.4 NaCl濃度對LM生長的影響

LM對NaCl濃度具有一定耐受性,但在高鹽濃度范圍(3%～5%)生長會受到較大的抑制[17]。田霞等人[18]也發現LM對3%～6%的NaCl濃度特別敏感,7%濃度時開始緩慢死亡。當LM受到滲透壓刺激時,引起細胞膨脹,膨脹壓力會施加于細胞壁,引起細胞伸展及分裂,同時維持這種壓力[15]。圖4中,菌體的生長速度隨著NaCl濃度的增加呈逐漸減緩的趨勢。在0.5%～3%的NaCl濃度范圍內,LM菌液在8 h內到達最大值,說明菌株能夠耐受3%以下的鹽濃度。但在4%～5%濃度范圍內,LM菌液的OD600值達到極值所需時間在12 h左右,說明LM的生長受到一定程度抑制。而當NaCl濃度達到6%時,菌體數量增長明顯放緩,說明高濃度的NaCl對LM抑制效果明顯。一般食品加工中不控制NaCl濃度,給LM的生長提供了條件。

圖4 LM在不同NaCl濃度下的生長曲線Fig.4 Growth curves of L. monocytogenes in different NaCl concentrations

2.5 pH對LM生長的影響

據報道,李斯特菌耐受的最低pH培養條件為4.3[19]。圖5反映了最適生長pH在8左右,酸性環境較堿性環境更有利于控制菌體數量。劉潔等[20]就曾指出保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的發酵液在酸性條件下表現出對LM更好的抑菌效果。根據此特性,食品工業可采用有機酸或乳酸菌細菌素等作為該菌易污染食品的防腐劑。例如段效輝等[21]將乳酸應用于水產品中對LM起到了明顯的抑制作用。陳晨等[22]將Nisin與檸檬酸復配用于控制鮮切黃瓜中LM的污染。對LM基因功能的研究表明,在pH=5的低酸性條件下,σB因子對其生長發揮重要的調控作用,與LM處于亞致死狀態有關[23]。而加酸的處理方式導致LM亞致死損傷率很高[24]。本研究同樣證實pH=5為LM的亞致死臨界pH,當pH低于5時菌株生長趨于停止。

圖5 LM在不同pH下的生長曲線Fig.5 Growth curves of L. monocytogenes at different pH values

2.6 搖床轉速(r)對LM生長的影響

在不同的搖床轉速下,LM菌株的生長延滯期幾乎相同,轉速對LM的生長影響不大,其對氧氣的需求量沒有嚴格的要求(圖6)。而氣調包裝對LM生長影響的研究結果不同[25],表明氧氣是作為一種非限定性因素與其他條件共同作用于菌體的生長。

圖6 LM在不同搖床轉速下的生長曲線Fig.6 Growth curves of L. monocytogenes at different rotation rates

表1 LM在冷藏牛奶中的生長預測模型參數Table 1 Parameters of predicting growth models for L. monocytogenes in refrigerated milk

2.7 LM在冷藏牛奶中的生長情況

李斯特菌耐低溫,在4 ℃的環境中仍可生長繁殖,極易污染食品而引起食物中毒和李斯特菌病暴發[26],且危險性隨著食品冷藏時間的延長而增大[27]。乳制品不但營養豐富,水分含量高,且pH接近中性,利于微生物生長繁殖。趙金海等人[8]通過建立預測模型證實低溫儲存的原料乳的總菌數與嗜冷菌相關。但預測微生物學在原料乳中的研究主要集中在金黃色葡萄球菌,其他病原微生物的研究較少[28]。因此本研究將LM接種于全脂牛奶中,觀察其在4 ℃的生長并考察三種模型的擬合情況。由圖7可知,以102CFU/mL比例接種的LM在經過5 d左右的延滯期后,達到穩定期的菌落對數值為4.51 lg CFU/mL。當接種量為103CFU/mL時,延滯期也為5 d左右,達到穩定后菌落對數值為5.64 lg CFU/mL。丁甜等[29]選用Gompertz模型對LM在營養肉湯中的生長情況進行擬合,在初始150 h內幾乎無菌體生長,與本結果相近。即使是在冷藏環境,LM的菌數在營養豐富的乳制品中增長數量約2 lg CFU/mL。因此冷藏食品中LM污染的風險很高,為保證食用安全應盡量縮短儲藏時間或加熱處理后食用。通過擬合得到的Gompertz模型和Logistic模型的相關系數R2>0.99,而Hill方程未獲得擬合曲線(表1)。因此,Gompertz模型和Logistic模型可用于預測LM在乳制品中的生長情況。邱紅玲等人[30]就曾采用修正的Gompertz模型建立了復原乳中LM的生長動力學模型。

圖7 LM在冷藏牛奶中的生長曲線Fig.7 Growth curves of L. monocytogenes in refrigerated milk 注:a的初始接種量為102 CFU/mL,b的初始接種量為103 CFU/mL。

3 結論

系統分析了LM在不同條件下的生長情況,LM適宜生長在TSB-YE和MRS培養基中;生長延滯期隨接種量的減少而增加,可在30～40 ℃的范圍內生長,最適生長溫度為37 ℃;對NaCl有一定的耐受性,能夠在0.5%～3%的NaCl濃度范圍內生長;LM菌株的最適生長pH在8左右,酸性環境有利于控制菌體數量;對氧氣的需求量不明顯。LM可在4 ℃儲藏的全脂牛奶中緩慢生長,并在13 d左右菌數增加2 lg CFU/mL,利用Gompertz模型和Logistic模型能夠模擬其生長情況。LM生長特性的作用機制及不同因素間協同作用的影響仍需進一步研究與探索,為防治其在食品中的污染提供思路。

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Growth properties ofListeriamonocytogenesand predicting models in refrigerated milk

LIU Shan-na1,2,ZHAO Sen1,SUN Tao1,FAN Zhi-hua1,2,ZHANG Chen-yun1,2

(1.College of Food Science and Bioengineering,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China;2.Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing,Tianjin 300384,China)

Listeriamonocytogenesgrowth was evaluated by determining OD600value and analyzing growth curves of strain in different conditions including culture ingredients,temperatures,pH values,NaCl concentrations,inoculation amounts and rotation rates. The Gompertz,Logistic and Hill models were used to establish the growth models ofL.monocytogenesin refrigerated milk. Results showed that the strain was grown well in TSB-YE and MRS medium and tolerant with 0.5%～3% NaCl concentrations. The optimal temperature was 37 ℃ and the optimal pH value was about 8 for growth. The oxygen demanding was not obvious for this strain. Cells were grown slowly in whole-fat milk at 4 ℃ with 2 lg CFU/mL increasing after attaining stationary phase,which Gompertz and Logistic models could be used in prediction ofL.monocytogenesgrowth.

Listeriamonocytogenes;milk;prediction;growth curve

2016-06-28

劉珊娜(1984-),女，博士，講師，研究方向：食品微生物，E-mail:lsn_nxy@aliyun.com。

國家自然科學基金青年項目(31501583)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)02-0187-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.027