固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法測定植物源食品中嗪氨靈的殘留量

王 敬,馬育松,*,趙中輝,代漢慧,張海超

(1.河北出入境檢驗檢疫局,河北石家莊 050051;2.中國出入境檢驗檢疫協會,北京 100029;3.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100123)

固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法測定植物源食品中嗪氨靈的殘留量

王 敬1,馬育松1,*,趙中輝2,代漢慧3,張海超1

(1.河北出入境檢驗檢疫局,河北石家莊 050051;2.中國出入境檢驗檢疫協會,北京 100029;3.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100123)

建立了固相萃取-液相色譜-串聯質譜測定植物源食品(大米、大豆、菠菜、番茄、辣椒、蘑菇等)中嗪氨靈殘留量的檢測方法。試樣用乙腈均質提取,采用石墨化碳黑/氨基柱(ENVI-Carb/NH2)凈化后,用多反應監測(MRM)正離子掃描方式進行檢測,外標法定量。結果表明,嗪氨靈在2～1000 ng/mL范圍內呈線性關系良好,方法的檢出限(S/N=3)為0.5～1.5 μg/kg,定量限(S/N=10)為1.6～4.9 μg/kg,加標平均回收率范圍為68.4%～109.0%,相對標準偏差(RSD)為4.38%～13.5%。方法的選擇性好,抗干擾能力強,能滿足國內外法規的要求,可以為植物源食品中嗪氨靈殘留的檢測提供技術支持。

高效液相色譜-串聯質譜,嗪氨靈,固相萃取,植物源食品

嗪氨靈是一種酰胺類內吸殺菌劑,廣泛用于對糧谷、果樹和蔬菜中白粉病、銹病和黑星病的防治。由于它能夠破壞動物體內的血紅細胞,許多國家對它的最高殘留限量都有嚴格規定[1]:歐盟已嚴格制定了505種食品中嗪氨靈的最大殘留量,且最為嚴苛,范圍為0.01～0.05 mg/kg;日本規定了193種食品中嗪氨靈的最大殘留量;我國GB 2763-2014《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》則僅僅規定了17種食品中嗪氨靈的限量要求,無論是涉及的樣品種類,還是殘留指標數都遠低于發達國家和國際組織,使我國的食品安全問題存在隱患。隨著各國貿易技術措施的不斷加嚴,檢測基質種類的大大增加,目前的檢測方法已無法滿足近70%的歐盟最高限量要求。

目前,國內外研究集中在大米、黃瓜、西瓜[2-5]較為簡單的基質,對蔬菜、豆類、食用菌樣品的研究未見報道。檢測方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜法等。采用氣相色譜法的前處理較為繁瑣,需要對樣品進行衍生化處理,耗時長且易出現假陽性結果;高效液相色譜法和液相色譜-質譜法靈敏度低,選擇性和特異性較差,已無法滿足檢測工作需要[2]。本文參考國內外文獻方法,對樣品的提取及凈化進行了優化,根據國內外對嗪氨靈殘留量的要求,選擇了幾種有代表性的基質如糧谷、豆類、水果、蔬菜和食用菌等作為檢測對象,采用液相色譜-串聯質譜法作為分析手段,建立了植物源食品中嗪氨靈殘留量的檢測方法,方法簡單快速、靈敏度高,能夠滿足國際上日益嚴格的農藥殘留量的檢測要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗪氨靈(分子式為C10H14Cl6N4O2,CAS No. 26644-46-2,純度≥99%) 德國Dr. Ehrenstorfer公司;乙腈、甲酸、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷 色譜純，美國Sigma公司;甲苯、無水硫酸鈉和氯化鈉 分析純，北京化學試劑公司;PSA固相萃取柱(1000 mg,6 mL)、石墨化炭黑/氨基固相萃取柱(500 mg/500 mg,6 mL)、石墨化碳黑固相萃取柱(1000 mg,6 mL) 美國Supelco公司;C18固相萃取柱(1000 mg,6 mL)、QuEChERS提取管(內含1.5 g無水硫酸鈉和6 g無水硫酸鎂)、QuEChERS凈化管(內含150 mg無水硫酸鈉鎂,50 mg PSA,50 mg C18) 美國Waters公司;J2 Scientific MPS GPC(裝有22 g S-X3 Bio-Beads填料,粒徑38～75 μm) 美國J2 Scientific公司;實驗用水 超純水。

Thermo TSQ Quantum Ultra液相色譜-串聯質譜儀(配電噴霧離子源) 美國Thermo Fisher公司;旋轉蒸發器 德國Heidolph公司;PT 3100型均質器 瑞士Kinematica公司;Turbo Vap LV型氮吹濃縮儀 美國Zymark公司;ML 204/02分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;CR22GIII型高速冷凍離心機 日本HITACHI公司;固相萃取柱裝置 美國Waters公司;Milli-Q純化系統 美國Millipore公司。

1.2 標準溶液的配制

1.2.1 標準儲備液 精密稱取嗪氨靈標準品10 mg置于10 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容,配制成質量濃度為1000 mg/L的標準儲備液,置于棕色試劑瓶中,4 ℃避光保存。

1.2.2 標準工作溶液 準確吸取適量標準儲備液,用乙腈配制成系列標準工作溶液,現用現配。

1.2.3 辣椒和蘑菇基質空白標準工作溶液 準確吸取適量標準儲備液,用辣椒和蘑菇樣品空白提取液(由1.3步驟所得)配制成系列基質空白標準溶液,現用現配。

1.3 樣品前處理方法

1.3.1 提取 蘋果、葡萄、菠菜、番茄、甘藍、黃瓜和蘑菇:稱取試樣約4 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管中,加入5 g氯化鈉(既可以促使有機相與水相分層,降低待測物在水相中的溶解度,又可在均質過程中起到研磨的作用,提高提取效率),20 mL乙腈,15000 r/min均質提取2 min,4000 r/min離心10 min,將上清液經裝有10 g無水硫酸鈉的漏斗過濾至120 mL雞心瓶中。再用20 mL乙腈重復提取1次,合并提取液于同一雞心瓶中,于45 ℃水浴濃縮至近干,待凈化。

大米、玉米、小麥、大豆和辣椒:稱取試樣約4 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管中,加10 mL水潤濕樣品,混勻2 min,靜置30 min后處理方法與蘋果、葡萄等樣品相同[6]。

1.3.2 凈化 用2 mL乙腈-甲苯(7+3,V/V)溶解上述步驟中所獲得的濃縮液,過石墨化炭黑/氨基固相萃取柱(使用前用10 mL乙腈-甲苯(7+3,V/V)預淋洗),再用3 mL乙腈-甲苯(7+3,V/V)溶液分3次洗脫,控制流速為0.5 mL/min,收集全部流出液,于45 ℃氮氣吹干。用1.0 mL乙腈溶解,過0.22 μm有機相微孔濾膜后,待測。

1.4 儀器條件

色譜柱:Thermo Hyperisil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,5 μm);進樣量:10 μL;柱溫:30 ℃;流動相:A相為0.2%甲酸水溶液,B相為乙腈;流速:300 μL/min;梯度洗脫程序如下:0～4.0 min,15% B～85% B;4.0～7.0 min,85% B;7.0～7.01 min,85% B～15% B;7.01～10.0 min,15% B。

電離方式:電噴霧正離子源(ESI+);檢測模式:MRM;毛細管電壓:3.5 kV;離子源溫度:150 ℃;去溶劑溫度:350 ℃;鞘氣(N2)壓力:241.3 kPa;輔助氣(N2)壓力:55.1 kPa;定量離子對435.0>389.8(碰撞能量:22 V),定性離子對435.0>214.9(碰撞能量:25 V)。

2 結果與討論

2.1 提取溶液的優化

分別以丙酮、乙腈、乙酸乙酯、乙腈-乙酸乙酯和二氯甲烷作為提取溶劑進行篩選。結果發現,用丙酮和乙酸乙酯提取時,溶出的樣品雜質、油脂較多;而用二氯甲烷提取時,提取液在下層,不便于操作,且提取過程中容易乳化;用乙腈提取不僅能沉淀蛋白質而且脂肪提出物和溶出雜質很少,有利于后續的鹽析和凈化,另外操作過程相對簡單,提取效率高。實驗選取乙腈作為提取溶劑對添加嗪氨靈的樣品進行提取后,回收率可達98%以上。由于嗪氨靈水溶性強,糧谷、辣椒等較干的樣品直接用乙腈提取,回收率受很大的影響。實驗發現,大米、玉米、小麥、大豆和辣椒等樣品在采用有機溶劑提取前加入少量水浸泡30 min,提取效率能夠提高12%～20%。

2.2 固相萃取柱的選擇

實驗選取了PSA、C18、石墨化碳黑、凝膠滲透色譜(GPC)、中性氧化鋁-活性炭組合柱、QuEChERS和ENVI-Carb/氨基柱等進行了比較。結果發現:PSA、C18和石墨化碳黑柱的凈化效果有限,仍會有大量干擾存在,基質效應明顯,嗪氨靈的平均回收率均小于60%;QuEChERS法是直接把填料加入提取液中進行吸附凈化,去除干擾物質的能力較差,平均回收率為65%;凝膠滲透色譜(GPC)雖然自動化程度高,但對于單組分研究目標物收集時間較長,溶劑使用量較大;中性氧化鋁-活性炭組合柱需要經過大量實驗進行調整、裝填、測試及再調整,需要消耗大量的時間,且溶劑使用量較大;ENVI-Carb/氨基柱對含部分脂肪和脂溶性雜質的樣品凈化較好,ENVI-Carb能很好地吸附天然產物中的色素及固醇類等系列化合物,對于各種極性的分析物,具有更廣泛的保留范圍并容易洗脫,可以改善多種殘留分析結果;氨基柱是弱的陰離子吸附柱,能出色地分離結構異構體,并且對于樣品中的一些強極性雜質、有機酸、色素和金屬離子(與金屬離子產生配合作用)等具有良好的凈化效果[7-8],通過固相萃取柱后,嗪氨靈的平均回收率在90%以上,從而起到凈化的效果。

實驗首先比較了兩種常用的洗脫溶劑甲醇-二氯甲烷(1∶99,V/V)和乙腈-甲苯(7∶3,V/V)的凈化效果,發現后者洗脫體積小、回收率高且干擾較小,因此選用乙腈-甲苯進行洗脫。在此基礎上,選用乙腈作為洗脫劑,討論了不同體積甲苯(0、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%和40%)調節洗脫強度,確定洗脫液中甲苯最佳比例,結果列于表1。

表1 不同洗脫液比較Table 1 Comparison of different elution solutions

結果發現,在洗脫劑體積不變的條件下,隨著甲苯濃度的增加,使用30%甲苯-乙腈溶液進行洗脫時,洗脫效果最佳,回收率最高且峰面積響應值最好。因此,選用乙腈-甲苯(7∶3,V/V)作為洗脫劑。

在洗脫體積的選擇上,分別用1、2、5、8、10 mL混合液進行洗脫并收集,得到相應的洗脫體積對回收率的影響如圖1所示。

圖1 洗脫體積對回收率的影響Fig.1 Effects of eluent volume on the recovery

結果發現,回收率隨著洗脫劑的體積增加而增加,當體積達到5 mL后,繼續增加洗脫液對回收率的影響不大。

2.3 儀器條件的優化

采用電噴霧離子源,以1 μg/mL的嗪氨靈標準溶液用蠕動泵以流動注射的方式對比正負離子模式。結果表明,嗪氨靈在正離子模式下形成[M+H]+的準分子離子峰,相應較高。選擇準分子離子435作為母離子,施加碰撞能對母離子打碎得到二級質譜圖,選擇豐度較高的兩個碎片離子m/z 389.8和214.9作為子離子,其中響應較高的碎片m/z 389.8作為定量離子。對碰撞能力進行優化使各子離子響應最高,二者的碰撞能量分別為22 eV和25 eV。在色譜條件和化合物質譜參數確定的情況下,不接色譜柱對離子源溫度、去溶劑氣溫度及流量、錐孔氣流量、射頻透鏡電壓、碰撞氣能量等參數進行了優化,使嗪氨靈的響應最高,最佳參數見1.4。嗪氨靈的碎片離子質譜圖和多反應監測(MRM)色譜圖見圖2。

圖2 嗪氨靈的碎片離子質譜圖和多反應監測(MRM)色譜圖Fig.2 Product ion mass spectrum and MRMchromatograms of triforine standard注：a：嗪氨靈的碎片離子質譜圖;b：嗪氨靈的多反應監測(MRM)色譜圖。

2.4 基質效應

基質效應(Matrix effects,ME)是指色譜分離時共洗脫的物質改變了待測成分的離子化效應,所引起的信號抑制或提高?；|效應影響大時,會降低方法的靈敏度和影響方法的準確性,給測定帶來誤差。因此,液相色譜-質譜方法開發和確證過程中需要對基質效應做出評價。本文通過配制標準工作曲線和基質匹配校正曲線,以峰面積為縱坐標,質量濃度為橫坐標作圖,以基質匹配校正曲線和標準曲線斜率的比值來考察化合物的基質效應。一般認為,基質匹配校正曲線斜率與標準曲線斜率的比值在85%～115%之間不存在基質效應[9-12]。

圖3表明,對于大米和玉米等10種樣品,基質匹配校正曲線斜率為標準曲線斜率的85.9%～114.7%,不存在基質效應;而對于蘑菇、辣椒樣品,基質匹配校正曲線斜率分別為標準曲線斜率的44.2%和37.6%,存在明顯的基質抑制作用,可能是由于基質中某些干擾組分的存在會使生成的待測組分信號響應值有差異。因此,辣椒和蘑菇樣品測定時采用基質匹配溶液進行校正,其它樣品采用溶劑標準工作曲線進行校正。

表2 嗪氨靈平均回收率范圍及精密度(n=10)Table 2 Average recovery ranges and RSDs(n=10)of triforine

圖3 不同樣品中嗪氨靈的基質效應Fig.3 Matrix effect of triforine in different matrices

2.5 方法的線性范圍、檢出限和定量限

對于蘑菇和辣椒樣品,分別在空白提取液中準確添加適量的標準溶液,配制成一系列不同濃度2、5、20、50、100、200、500、1000 ng/mL的基質標準溶液,大米、蘋果等其它10種基質配制成一系列不同濃度2、5、20、50、100、200、500、1000 ng/mL的溶劑標準溶液,按照相應的儀器工作條件測定。以峰面積(Y)對質量濃度(X)作校正曲線,得到線性范圍、線性回歸方程及相關系數。結果表明:溶劑校準的線性回歸方程為Y=9.7×104X+5.0×105,線性相關系數為0.9997;蘑菇和辣椒基質溶液校準的線性回歸方程分別為Y=4.3×104X+1.3×105和Y=1.3×104X+2.3×105,線性相關系數分別為0.9993和0.9991。以3倍信噪比為檢出限,10倍信噪比為定量限,分別計算出嗪氨靈的檢出限和定量限,其中蘑菇和辣椒基質中嗪氨靈的檢出限分別為1.3 μg/kg和1.5 μg/kg,定量限分別為4.2 μg/kg和4.9 μg/kg;其它基質類型中嗪氨靈的檢出限和定量限分別為0.5 μg/kg和1.6 μg/kg。

實驗以不含嗪氨靈農藥的大米、玉米、小麥、大豆、蘋果、葡萄、黃瓜、番茄、甘藍、菠菜、蘑菇和辣椒為空白樣品基質,在不同添加水平上進行加標回收率實驗,其結果見表2。

從表2可看出,每個水平重復做10次,測得方法的回收率范圍為68.4%～109.0%,相對標準偏差(RSD)為4.38%～13.5%,符合規定的要求。

2.6 實際樣品的測定

應用本文建立的方法對市售的40份蔬菜、40份水果和10份糧谷樣品進行測定,并對實際樣品進行了加標回收測定。結果在1批次菠菜中檢出5.6 μg/kg的嗪氨靈,2批次甘藍和1批次蘑菇中檢出嗪氨靈,濃度在6.2～16.7 μg/kg之間,均低于GB 2763-2014《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》的要求。

3 結論

實驗建立了固相萃取-液相色譜-串聯質譜測定植物源食品中嗪氨靈殘留量的方法。樣品采用乙腈提取,氯化鈉鹽析,石墨化碳黑/氨基固相萃取法進行凈化,同時利用質譜的高選擇性,實現了對糧谷、豆類、水果、蔬菜和食用菌等12種植物源食品中的嗪氨靈的定性定量分析,加標回收率范圍為68.4%～109.0%,相對標準偏差為4.38%～13.5%,方法的檢出限為0.5～1.5 μg/kg,定量限為1.6～4.9 μg/kg,均低于目前文獻所報道的方法(潘建偉等[1]測得水果蔬菜中嗪氨靈為0.02 mg/kg;陳武瑛等[3]測得西瓜中嗪氨靈為20 μg/kg;SN 0695-1997[13]測得大米中嗪氨靈為0.02 mg/kg)。該方法分析時間短、靈敏度高、準確度好等優點,可用于植物源食品中嗪氨靈殘留的日常檢測。

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Determination of triforine residues in plant-derived food by solid phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

WANG Jing1,MA Yu-song1,*,ZHAO Zhong-hui2,DAI Han-hui3,ZHANG Hai-chao1

(1.Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shijiazhuang 050051,China;2.China Entry-Exit Inspection and Quarantine Association,Beijing 100029,China;3.Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100123,China)

A method was developed for the simultaneous determination of triforine residue in various plant-derived foods(such as rice,soybean,spinach,tomato,pepper,and mushroom)by solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The samples were extracted by acetonitrile,cleaned-up with an ENVI-Carb/NH2solid-phase extractor,and determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)using external standard method with positive polarity mode under multi-reaction monitoring(MRM)scan type. The method showed good linearity in the range from 2 to 1000 ng/mL. The limits of detection(LODs,S/N=3)varies over the range of 0.5 to 1.5 μg/kg,and limits of quantification(LOQs,S/N=10)ranged from 1.6 to 4.9 μg/kg. The average recoveries in different matrices were in the range of 68.4%～109.0%,with relative standard deviations(RSDs)of 4.38%～13.5%. This method was selective without interference and reliable for meeting the requirements of the domestic and international legislation. The method was suitable for triforine determination in plant-derived food.

HPLC-MS/MS;triforine;solid-phase extraction;plant-derived food

2016-05-27

王敬(1983-)，女，碩士研究生，工程師，研究方向：食品安全監測技術，E-mail：wangjingld@126.com。

*通訊作者:馬育松(1975-)，男，碩士研究生，高級工程師，研究方向：食品安全檢測技術，E-mail：mys1974@126.com。

國家認監委制標項目(2013B393r)；河北檢驗檢疫局科研項目(HE2014K018)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)02-0084-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.008