添加擴增內標的PCR方法快速檢測食品中的阪崎克羅諾桿菌

張德福,趙禹宗,張 明,儀淑敏,趙文竹,湯軼偉,李 春,勵建榮,*

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.軍事醫學科學院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全國家重點實驗室,北京 100071;3.渤海大學數理學院,遼寧錦州 121013)

添加擴增內標的PCR方法快速檢測食品中的阪崎克羅諾桿菌

張德福1,2,趙禹宗1,張 明1,儀淑敏1,趙文竹1,湯軼偉1,李 春3,勵建榮1,*

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.軍事醫學科學院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全國家重點實驗室,北京 100071;3.渤海大學數理學院,遼寧錦州 121013)

為了解決常規PCR方法檢測阪崎克羅諾桿菌時因檢測過程中環境和食品理化因素的影響而導致的假陰性結果的產生,本研究以細菌16S rRNA基因為擴增內標對照,以阪崎克羅諾桿菌特異性基因grxB為靶基因設計了一對特異性引物,并通過優化PCR反應條件,最終建立了一種添加擴增內標的阪崎克羅諾桿菌PCR檢測方法,可以指示PCR過程中因存在DNA聚合酶抑制劑而導致的假陰性結果。通過對20種細菌進行PCR檢測顯示,該方法對阪崎克羅諾桿菌具有良好的特異性。靈敏度實驗結果表明,該檢測方法對阪崎克羅諾菌純DNA模板的檢測靈敏度為2.15×102fg/μL,對阪崎克羅諾桿菌純培養物的檢測靈敏度為9.4×103CFU/mL。對人工污染嬰幼兒奶粉的檢測結果顯示,阪崎克羅諾桿菌接種量為0.94 CFU/g的嬰幼兒奶粉樣品經過8 h增菌培養后,即可檢出。食品樣品檢測結果表明,不添加擴增內標的PCR檢測方法中出現的假陰性結果可被本方法檢出。該檢測方法特異性強、靈敏度較高,能消除阪崎克羅諾桿菌常規PCR檢測方法中可能出現的假陰性結果,適用于嬰幼兒配方乳粉、乳制品等食品中阪崎克羅諾桿菌的快速檢測。

阪崎克羅諾桿菌,擴增內標,假陰性,PCR檢測

阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)(舊稱阪崎腸桿菌)是嬰幼兒配方奶粉中發現的一種能夠引起嬰幼兒死亡的腸桿菌科條件致病菌[1-3]。目前研究發現,阪崎克羅諾桿菌廣泛存在于多種食品中[4-5],如奶制品[6]、肉制品[7]、蔬菜[8]、水果[9]、谷類[10]等。在某些情況下,由阪崎克羅諾桿菌引發疾病而導致的死亡率可達40%～80%[11-12]。因此,加強對阪崎克羅諾桿菌的檢測對保障食品安全非常重要。目前,阪崎克羅諾桿菌傳統的培養——生化鑒定法比較復雜、檢測周期長、靈敏度低,遠遠不能滿足現代對快速檢測的要求[13]。基于PCR方法的快速、靈敏度高、特異性強、適合高通量操作等優點,而成為快速檢測時的常用方法。研究表明,采用PCR檢測方法對食品樣品中的致病菌進行實際檢測時,會受到環境因素和食品理化性質的影響,其中食品基質復雜、培養基成分和DNA提取試劑殘留等原因都會影響檢測準確性,造成假陰性結果。研究表明,添加擴增內標對于食品樣品中致病菌PCR檢測方法體系中確保檢測結果的可靠性具有重要的作用,一個有效、適用的食源性致病菌快速檢測方法必須包含能夠指示假陰性結果的擴增內標(Internal Amplification Control,IAC)[14-15]。本實驗PCR反應體系中采用16S rRNA基因的通用引物27F和1492R作為擴增內標引物,若被檢測樣品中含有任意細菌DNA,即可在電泳結果中觀察到一條大小為1500 bp的電泳條帶,不需要添加擴增內標片段,就可以達到指示假陰性結果的目的。在反應體系中,若食品樣品未受到阪崎克羅諾桿菌污染,應有擴增內標片段的擴增產物。而當PCR反應沒有產生任何擴增產物時,說明反應可能受到了抑制,產生了假陰性,需重新處理待檢食品樣品。

谷氧還蛋白2(Glutaredoxin 2,GrxB)是腸桿菌體內一類對谷胱甘肽起氧化還原作用的蛋白質,研究人員通過將阪崎克羅諾桿菌與其他細菌grxB基因序列比對及特異性實驗發現,grxB基因對阪崎克羅諾桿菌具有很強的特異性[16-17]。因此,本研究以grxB作為檢測靶基因設計引物,以16S rRNA序列作為擴增內標,建立了一種添加擴增內標的阪崎克羅諾桿菌PCR檢測方法,并從特異性、純DNA和純培養物靈敏度、人工污染嬰幼兒奶粉樣品以及食品樣品實際檢測四個方面對該檢測方法進行了評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗用菌株阪崎克羅諾桿菌(ATCC 29004、ATCC 29544)、大腸桿菌O157∶H7(ATCC 43889)、腐敗希瓦氏菌(ATCC 8071)、銅綠假單胞菌(ATCC 9027)、副溶血弧菌(ATCC 33847)、粘質沙雷氏菌(ATCC 14041)和地衣芽孢桿菌(ATCC 14580) 購自美國模式菌種保藏中心；福氏志賀氏菌(CMCC(B)51572)、金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、沙門氏菌(CMCC(B)50041)及蠟樣芽胞桿菌(CMCC 63301) 均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心;單增李斯特菌(ATCC 19115) 由浙江大學動物科學學院方維煥教授贈送;魯氏耶爾森氏菌、哈維弧菌、河流弧菌、溫和氣單胞菌、創傷弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣假單胞菌和熒光假單胞菌 由本實驗室分離、鑒定、保存;人工污染及實際檢測用的新鮮肉、嬰幼兒奶粉、水產品、豆制品、雞蛋、乳制品等6類共51份樣品 均采購自本地商場；Taq-PCR Master Mix、細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker D2000 生工生物工程(上海)股份有限公司；LB等培養基 北京奧博星生物技術有限公司;瓊脂糖 Sigma公司。

DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠;LRH系列生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;Mastercycler pro梯度PCR儀、5424R冷凍離心機 德國Eppendorf公司;Cheimd Doc XRS型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;NanoDrop 2000超微量分光光度計 美國Thermo公司;DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺 東聯哈爾(北京)儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 阪崎克羅諾桿菌的培養及DNA的提取 將實驗室冷凍保存的阪崎克羅諾桿菌接種于LB平板上活化后,采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,經NanoDrop 2000超微量分光光度計測定濃度為2.15×102ng/μL,置于-20 ℃備用。

1.2.2 特異性引物的設計和篩選 選擇阪崎克羅諾桿菌特異性基因grxB(GenBank:FN543093.2)作為靶基因,利用軟件Primer 5.0設計引物,經PCR反應驗證篩選出一對特異性良好的阪崎克羅諾桿菌檢測引物:grxBF/grxBR。采用細菌16S rRNA擴增通用引物27F和1492R作為PCR反應內標對照引物。實驗所用引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.2.3 PCR檢測方法的建立 根據TaqPCR Master Mix說明書所建議的PCR反應體系對PCR反應體系的各組分含量以及擴增程序進行優化調整,最終確定PCR反應最佳條件為:總體系25 μL,其中TaqPCR Master Mix 12.5 μL,DNA模板2 μL,10 μmol/L的引物27F/1492R和grxBF/grxBR各1 μL,補充無菌水至25 μL。以無菌水作為空白對照。

PCR反應程序:94 ℃預變性4 min后進行35個循環,每個循環包括94 ℃變性30 s、61.6 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s,最后72 ℃延伸10 min。PCR產物使用1%的瓊脂糖凝膠進行核酸電泳,使用EB染色后置于凝膠成像儀下觀察結果。

1.2.4 特異性驗證 使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取表1中細菌的基因組DNA,并用建立的含擴增內標的PCR檢測方法對所有細菌的基因組DNA進行檢測,驗證該方法的特異性。

1.2.5 靈敏度評價

1.2.5.1 純DNA靈敏度評價 將提取的阪崎克羅諾桿菌基因組DNA用無菌去離子水進行10倍系列梯度稀釋,使用建立的PCR檢測方法對濃度為1～106fg/μL的DNA溶液進行PCR擴增。PCR產物電泳結果中能得到肉眼可見大小為333 bp條帶的最低濃度DNA溶液,視為該PCR檢測方法對阪崎克羅諾桿菌的純基因組DNA檢測靈敏度。

1.2.5.2 純培養物靈敏度評價 將活化的阪崎克羅諾桿菌于37 ℃振蕩培養10 h后,用無菌生理鹽水進行10倍系列梯度稀釋,取適當濃度的菌懸液傾倒平板計數,每個稀釋度再取1 mL置于1.5 mL離心管中,用試劑盒提取基因組DNA,作為模板進行PCR擴增,檢測該方法對阪崎克羅諾桿菌純培養物的靈敏度。

1.2.6 人工污染食品樣品實驗 無菌操作取10份嬰幼兒奶粉,每份10 g,接種適當稀釋濃度的阪崎克羅諾桿菌菌液1 mL,使奶粉中的菌液濃度分別為0～1、1～10、10～100 CFU/g,每組做3個平行,另取一份加入無菌生理鹽水做為空白對照。分別將人工污染的奶粉樣品加入到90 mL LB液體培養基中,混勻后37 ℃振蕩培養,每隔2 h取1 mL菌液置于1.5 mL離心管中,用試劑盒提取基因組DNA作為模板進行PCR檢測。

1.2.7 食品樣品檢測 新鮮肉、嬰幼兒奶粉、水產品、豆制品、雞蛋、乳制品等樣品每份取25 g或25 mL。鮮肉、水產品及豆制品樣品加入到盛有225 mL LB培養基的無菌袋中均質2 min,嬰幼兒奶粉、雞蛋及乳制品直接與225 mL LB培養基混勻,37 ℃振蕩培養10 h后提取基因組DNA,并用建立的添加擴增內標的PCR檢測方法進行檢測。所有樣品同時根據GB 478940-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 阪崎腸桿菌檢驗》的方法進行阪崎克羅諾桿菌的確認。

2 結果與分析

2.1 特異性驗證

PCR檢驗結果如圖1所示,只有阪崎克羅諾桿菌基因組DNA能全部擴增出大小為333 bp的檢測條帶和大小為1500 bp的擴增內標對照條帶,而其它細菌基因組DNA只能擴增出大小為1500 bp的擴增內標對照條帶。表明實驗所設計建立的PCR檢測方法特異性良好。

圖1 阪崎克羅諾桿菌特異性試驗Fig.1 Agarose(1%)gel electrophoresis of DNA productsamplified from Cronobacter sakazakii and non-Cronobacter species by PCR using the primers注：M：D2000 DNA marker；1：副溶血性弧菌；2：大腸桿菌O157∶H7；3：腸炎沙門氏菌；4：福氏志賀氏菌；5：單增李斯特菌；6：蠟樣芽孢桿菌；7：阪崎克羅諾桿菌；8：金黃色葡萄球菌；9：腐敗希瓦氏菌；10：銅綠假單胞菌；11：粘質沙雷氏菌；12：嗜水氣單胞菌；13：溫和氣單胞菌；14：熒光假單胞菌；15：地衣芽孢桿菌；16：魯氏耶爾森氏菌；17：哈維弧菌；18：溶藻弧菌；19：創傷弧菌；20：河流弧菌。

2.2 靈敏度評價

2.2.1 純DNA靈敏度實驗 如圖2所示,阪崎克羅諾桿菌基因組DNA經10倍梯度稀釋至2.15×102fg/μL時,PCR檢測結果仍有肉眼可見條帶,表明阪崎克羅諾桿菌基因組DNA的檢測靈敏度為2.15×102fg/μL。

圖2 阪崎克羅諾桿菌基因組DNA檢測靈敏度Fig.2 Agarose gel electrophoresis showing sensitivity of detection of the PCR amplified Cronobacter sakazakii genomic DNA from various concentrations注：M：D2000 DNA ladder marker；1～7：阪崎克羅諾桿菌基因組DNA濃度分別為2.15×106～2.15 fg/μL；8：陰性對照。

2.2.2 純培養物靈敏度實驗 對培養好的阪崎克羅諾桿菌菌液進行平板菌落計數,阪崎克羅諾桿菌液濃度為9.4×108CFU/mL。如圖3所示,阪崎克羅諾桿菌菌液稀釋到9.4×103CFU/mL時,PCR檢測結果仍有肉眼可見條帶,可視為阪崎克羅諾桿菌純培養物檢測限為9.4×103CFU/mL。

圖3 阪崎克羅諾桿菌純培養物檢測靈敏度Fig.3 Agarose gel electrophoresis showing sensitivity of detection of the PCR amplified Cronobacter sakazakii pure cultures注：M：D2000 DNA ladder marker；1～8：阪崎克羅諾桿菌濃度分別為9.4×106～9.4 CFU/mL；8：陰性對照。

2.3 人工污染食品樣品實驗

嬰幼兒奶粉樣品中接種的阪崎克羅諾桿菌的三個濃度分別為94、9.4、0.94 CFU/g。PCR檢測結果如表2所示,接菌量為94 CFU/g的奶粉樣品,在增菌培養4 h后即可檢出,接菌量為9.4 CFU/g的奶粉樣品,在增菌培養6 h后可以檢出,接種量為0.94 CFU/g的奶粉樣品需要增菌8 h才可以檢出。這表明,該PCR檢測方法最多經8 h增菌培養后,即可從染菌量為0.94 CFU/g的奶粉樣品中檢出阪崎克羅諾桿菌。

表2 人工污染食品樣品檢測結果Table 2 Detection for Cronobacter sakazakiiin artificially contaminated food samples

2.4 食品樣品檢測結果

從錦州菜市場隨機取51份食品檢測結果如表3所示,總計51份樣品中19份擴增出目的條帶和擴增內標條帶,其中5份是未添加擴增內標的PCR檢測方法中產生的假陰性,經本方法檢測出,表明食品樣品受阪崎克羅諾桿菌污染;32份樣品中只擴增出擴增內標條帶,無目的條帶,表明食品未受阪崎克羅諾桿菌污染。

表3 食品樣品檢測結果Table 3 Detection of food samples

3 結論

實驗結果表明,以細菌16S rRNA為擴增內標對照,以阪崎克羅諾桿菌的谷氧還蛋白2基因grxB為靶基因設計的引物具有良好的的特異性,引物grxBF/grxBR與引物27F/1492R之間沒有交叉反應。

本研究建立的含擴增內標的PCR檢測方法對阪崎克羅諾桿菌基因組純基因組DNA檢測靈敏度為2.15×102fg/μL,純培養物檢測靈敏度為9.4×103CFU/mL,與Dong[16]和Wang[18]建立的阪崎克羅諾桿菌檢測方法靈敏度103CFU/mL處于同一檢測水平。

人工污染實驗結果表明,阪崎克羅諾桿菌染菌量為0.94 CFU/g的奶粉樣品,經過8 h增菌培養后,可被本研究檢測方法檢出。污染阪崎克羅諾桿菌的食品樣品最多經過8 h增菌培養后即可被檢出,整個檢驗流程可在12 h內完成,檢測周期短,適用于阪崎克羅諾桿菌的快速檢測鑒定。食品樣品檢測結果表明,添加擴增內標的檢測方法能夠檢測出樣品中的阪崎克羅諾桿菌,并能夠避免假陰性對檢測結果造成的影響。

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Establishment of a PCR method with an internal amplication control for detection ofCronobactersakazakiiin foods

ZHANG De-fu1,2,ZHAO Yu-zong1,ZHANG Ming1,YI Shu-min1,ZHAO Wen-zhu1,TANG Yi-wei1,LI Chun3,LI Jian-rong1,*

(1.College of Food Science and Project Engineering,Bohai University,Food Safety Key Lab of Liaoning Province,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China;2.Institute of Microbiology and Epidemiology,Academy of Military Medical Sciences,State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity,Beijing 100071,China;3.College of Mathematics and Physics,Bohai University,Jinzhou 121013,China)

The traditional detection method ofCronobactersakazakiiwas time-consuming,operation-complicated,low sensitivity and was often influenced by the environmental factors,and the physical and chemical properties of food,which might lead to false negative results. In this study,we used 16S rRNA gene as an internal amplification control,designed primers targetinggrxB ofC.sakazakii,optimized the reaction conditions and finally,established a PCR method with an internal amplication control forC.sakazakiidetection. The results of detection of 20 strains includingCronobacterand non-Cronobacterby this method showed that these primers were specific forC.sakazakiidetection. The sensitivity of established detection assay forC.sakazakiipurified genomic DNA and pure cultures were 2.15×102fg/μL and 9.4×103CFU/mL,respectively. The detection for artificially contaminated infant milk powder showed thatC.sakazakiicould be detected after 8 h enrichment culture when theC.sakazakiiinoculation was 0.94 CFU/g. This detection method demonstrated a good specificity and sensitivity,and could eliminate false-negative results caused by inhibitor of DNA polymerase in the PCR reaction reagents,and suitable for rapid detection of foodborneC.sakazakii.

Cronobactersakazakii;internal amplification control;false-negative;PCR detection

2016-06-28

張德福(1983-)，男，博士，講師，研究方向：食品安全與質量控制，E-mail：zhangdf@bhu.edu.cn。

*通訊作者:勵建榮(1964-)，男，博士，教授，研究方向：水產品和果蔬貯藏加工，食品安全，E-mail：lijr6491@163.com。

遼寧省教育廳項目(LY2016001)；遼寧省重點實驗室開放課題(LNSAKF2013018)；遼寧省高等學校創新團隊項目(LT2014024)。

TS201.6

A

1002-0306(2017)02-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.001