基于非酒精性脂肪性肝病機制及治療的動物模型研究進展

陳艷珍， 陳成良， 田 興， 焦 健

(吉林大學中日聯誼醫院 消化內科， 長春 130033)

基于非酒精性脂肪性肝病機制及治療的動物模型研究進展

陳艷珍， 陳成良， 田 興， 焦 健

(吉林大學中日聯誼醫院 消化內科， 長春 130033)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是以過量脂質在肝細胞內堆積為特征的連續疾病譜，可由單純的肝脂肪變性發展為非酒精性脂肪性肝炎，并可進一步進展為肝纖維化、肝硬化、甚至肝細胞癌。動物模型可模擬不同病因以及NAFLD每個階段的組織病理學和病理生理學改變，為了解NAFLD發病機制和治療措施提供關鍵性的指導。目前尚缺乏能完整模仿疾病譜的理想動物模型，介紹了NAFLD及相關肝癌的最常用和最新的動物模型，并結合動物模型中NAFLD的實驗性發病機制總結了可能的治療靶點，希望能為進一步探討NAFLD發病機制和治療提供依據。

非酒精性脂肪性肝病； 模型， 動物； 綜述

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代謝綜合征在肝臟的表現形式，與肥胖[1]、胰島素抵抗(IR)[2]、空腹高血糖癥、血脂異常、脂肪因子變異等機體代謝異常明顯相關[2]，是目前慢性肝病最常見的病因[3]。NAFLD是以過量的脂質在肝細胞內堆積為特征的連續疾病譜，可由單純的肝脂肪性變性發展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，嚴重時可發展為肝纖維化和肝硬化[4]，NASH一旦合并肝纖維化或肝硬化則可進一步增加肝細胞癌(HCC)的發生風險[5]。

到目前為止，NAFLD的確切發病機制尚不清楚，也缺乏特異性的治療措施，因此針對發病機制和潛在治療藥物的研究是目前該領域的熱點。動物模型可通過模擬不同的病因以及NAFLD每個階段的組織病理學和病理生理學改變，為了解NAFLD發病機制和進展提供關鍵性的指導。本文分別針對NAFLD不同的發展階段綜述了最常用的三類動物模型，即單純肝脂肪變性動物模型、NASH動物模型、NASH相關HCC動物模型，希望為NAFLD動物模型深入研究提供方向。

1 單純肝脂肪變性動物模型

1.1 高脂飲食(high fatdiet,HFD)動物模型 肝脂肪變性是NAFLD的最主要特征，是脂肪滴以甘油三酯的形式在肝細胞內堆積。NAFLD患者肝內甘油三酯來源于甘油和游離脂肪酸的酯化作用[4]，當肝細胞合成或攝入游離脂肪酸的比例超過輸出或分解時，甘油三酯將在肝細胞內堆積[6]。另外，肥胖患者TNFα的過多表達可激活IκB(NF-κB抑制蛋白)激酶β，IκB激酶β通過抑制胰島素受體底物(IRS-1/IRS-2)的磷酸化而促進IR的發展，并促進肝游離脂肪酸的堆積，進而通過酯化作用促進肝甘油三酯堆積、肝脂肪變[7]。

鑒于NAFLD與肥胖相關，HFD可誘導NAFLD模型。Lieber等[8]發現通過高脂飲食(45%～75%的食物總熱量攝入來源于脂肪)可構建脂肪肝動物模型，3周后即可出現肝脂肪變和脂質聚集，并表現為IR，可測到血漿中胰島素水平升高，但小鼠體質量無明顯改變。Eccleston等[9]也報道，以HFD喂養C57BL/6鼠16周，可出現動物體質量增加，并表現出肝細胞脂肪變、氣球樣變、肝內甘油三酯水平增加等病理改變。同時，空腹血糖升高、脂聯素的減少提示并發高血糖癥及IR。Lau等[10]采用高脂飲食(45%脂肪、35%碳水化合物、20%蛋白質)喂養C57BL/6鼠12周即可出現肝細胞脂肪變性和脂質沉積。食物中能量來源配比也可影響肝脂肪變的程度：FaKhoury-Saycgh等[11]以等量(15 g·鼠-1· d-1)但不同成分(包括高脂組、中等量脂組、高蔗糖組、高果糖組)喂養Wistar鼠16周發現，高脂組鼠有最高的體質量、肝重量及最高比例的肝脂肪變(40%)。

HFD動物模型從組織病理學及發病機制兩個方面模擬了與NAFLD患者類似的臨床特征，包括肥胖及IR，為相應的減重、低脂飲食及改善IR治療NAFLD提供了依據，但肝脂肪變的程度似乎還取決于其他多種因素，包括嚙齒動物的種類等，這也提示不同人群對NAFLD具有不同的易感性。

基于HFD動物模型，有研究[12]發現細胞周期蛋白D3/周期蛋白依賴的激酶4是NAFLD進展過程中的一個關鍵因素，可能為NAFLD的治療提供靶點。另一研究[13]發現Myricetin可減輕HFD誘導型肝脂肪變，減少肝細胞脂質堆積，增加抗氧化酶活性，可被用來治療HFD誘導的肝脂肪變。由此可見，這種動物模型為未來NAFLD的治療提供了方向。

1.2 db/db鼠和ob/ob鼠 瘦素可逆轉IR和改善嚴重肝脂肪變性，降低血清甘油三酯水平，降低肝臟和肌肉組織內甘油三酯的比例，提高機體對胰島素的敏感性。瘦素受體自身變異引起瘦素抵抗，形成高瘦素水平，又可誘發IR。由瘦素或其受體變異引起的高瘦素水平通過IR和高胰島素血癥，產生與胰島素相關的肝內脂肪蓄積，又可通過改變胰島素信號傳導，提高肝細胞內脂肪酸的濃度，使甘油三酯的合成增加，形成脂肪肝。同時瘦素作為肝纖維化的啟動因子之一，可激發肝纖維化，并促進其向肝硬化發展。

db/db鼠是糖尿病常染色體隱性基因的純合子表型，db基因編碼瘦素受體的一個突變位點，可導致瘦素信號傳導缺陷[14]，因此db/db鼠體內瘦素的水平正常或升高，但作用卻減弱，屬于相對瘦素缺乏。瘦素的作用機制是通過促進飽感調節飲食行為，因此這些鼠出現持續的攝食過量，從而發生肥胖并伴發糖尿病[15]，繼而出現嚴重的高血糖血癥、高胰島素血癥和高瘦素水平，并發展成大泡型肝脂肪變[6，16]。在控制正常飲食情況下，db/db鼠不會自發地發展為肝炎，但長期進食過多(>1個月)將使肝臟炎癥輕微加重[14]。然而，以正常量飲食喂養的db/db鼠極少表現出NASH的特征，因此db/db鼠本身只是NAFLD較好的模型，而不是NASH的有效模型，但如果用蛋氨酸-膽堿缺乏飲食(methionine and choline deficient diet,MCD)和反式脂肪給予db/db鼠“二次沖擊”則能誘發NASH。

ob/ob鼠攜帶瘦素基因中的一個常染色體隱性突變基因，不同于db/db鼠，ob/ob鼠具有功能性瘦素受體，但缺乏瘦素，屬于絕對瘦素缺乏。同樣，這些鼠極其超重、食欲過盛，并且有高胰素血癥、高血糖血癥，且對胰島素產生抵抗，能自發地發展為肝脂肪變[14]。如果進一步在MCD、HFD、小劑量的脂多糖內毒素[17]、酒精、肝局部缺血再灌注[6]的打擊下也可發生脂肪性肝炎。然而，因為瘦素是肝纖維化的啟動因子，所以不同于db/db鼠，ob/ob鼠不會發展為肝纖維化。

db/db、ob/ob鼠模型的優點是其能夠呈現人類代謝綜合征的特點。如沒有額外打擊的因素(比如MCD飲食)喂養時，它們是很好的單純肝脂肪變模型。以MCD飲食二次沖擊，db/db鼠仍能用來研究脂肪變性到NASH的進展過程。但由于基因突變引起的先天瘦素缺陷和瘦素抵抗在肥胖人群中極為少見[17]，因此，在反映人類肥胖、IR和肝脂肪變方面，db/db鼠模型和ob/ob鼠模型有一定的缺陷。盡管這類鼠模型有一定的缺陷，但在db/db鼠中，羧酸酯酶2證實為新型的與甘油三酯的穩態和NAFLD相關的甘油三酯水解酶[18]，因此這類鼠模型仍為研究治療措施提供了有利條件。

2 NASH動物模型

大約三分之一單純脂肪變的NAFLD患者會發生NASH[19]。小葉性炎癥(常在腺泡3區)和肝門區炎癥是NASH的主要病理改變[20]。NASH的其他組織學損害包括肝細胞氣球樣變、肝纖維化、凋落小體、正膠原蛋白形成、Mallory小體、巨線粒體、糖原核、鐵沉積等[21]。

目前，對脂肪變性到NASH轉變過程的最好的解釋是“二次打擊”[22]和“多重打擊”[23]假說。IR和代謝改變作為第一次打擊，導致肝脂肪變性，繼而在氧化應激、炎癥因子、異常的肝內膽固醇沉積、高胰島素血癥、高瘦素血癥、低脂聯素血癥等多重打擊的作用下導致肝臟炎癥[23]，同時基因易感性也有一定作用[24]。所有因素中，氧化應激和炎癥因子被認為是關鍵的兩種機制。

2.1 蛋氨酸和MCD模型 以MCD作為“二次打擊”信號喂養小鼠可建立NASH營養模型。這種飲食包含40%能量的蔗糖和10%能量的脂肪，但是不含有蛋氨酸和膽堿。動物飲食中缺乏膽堿將損害肝內極低密度脂蛋白的分泌，導致肝脂肪變、氧化應激損傷、肝細胞死亡等[25]，一般僅導致輕微肝炎和肝纖維化。然而，以MCD飲食喂養小鼠，卻會在最初的2周內導致嚴重的肝炎，6周后出現嚴重的肝纖維化[6,26]。MCD模型比其他飲食模型更能模仿人類嚴重的NASH的病理學改變。其模型中炎癥、纖維化、肝細胞凋亡發展比以HFD模型或其他飲食喂養的鼠模型更快、更嚴重。MCD模型中的內質網應激、氧化應激、自我吞噬應激都比其他模型表現的更活躍[27]，因此這種飲食模型鼠能更好地模仿人類NASH發病相關的機制，所以通常被優先選擇去探討NASH的組織學進展及NASH患者炎癥和纖維化的機制及治療。Yamamoto等[28]在以MCD喂養的db/db鼠模型中，發現唾液素4改善了MCD誘導的脂肪性肝炎的生成，并減少了甘油三酯和游離脂肪酸的含量，提出唾液素4可能被用來治療非肥胖型NASH患者。

但MCD模型也有一定的局限性，因為它與NASH患者的實際代謝狀況完全不同，MCD小鼠不表現體質量過重，反而出現嚴重的體質量下降、惡病質、無IR,以及低血清胰島素、空腹血糖、瘦素和甘油三酯水平[29]。因此，以MCD喂養db/db鼠、ob/ob鼠才能更好反映NASH患者實際狀況，MCD飲食的db/db鼠表現出典型的肝炎和肝纖維化[16]。另外，MCD飲食對不同種族小鼠的影響能力不同，表現為ALT升高水平不同。用缺乏蛋氨酸的飲食長期喂養小鼠，DAB/2J鼠比C57BL/6鼠出現更嚴重的肝損傷，甚至可出現肝癌，但C57BL/6鼠并非如此。不同小鼠ALT水平從高到低的排列是：A/J>C57BL/6 >C3H/HeH=Balb/c=DAB/2J[30]，這在一定程度上反映了個體易感性的差異。

2.2 高膽固醇飲食(high cholesterol diet,HCD)動物模型 有研究提出膳食膽固醇是動物模型[31]和人類[32]中脂肪性肝炎和炎癥進展的一個重要因素。單獨以HCD(1%)喂養小鼠表現出血胰島素水平顯著增加，而肝重量、血中ALT、甘油三酯和游離脂肪酸水平僅輕度增加[32]。但以高膽固醇混合高脂或高膽鹽飲食喂養小鼠時，NASH的特征是顯著的。以高脂(15%)和高膽固醇(1%)混合成的飲食喂養小鼠時，小鼠表現出更高的體質量增加、更多的肝脂質堆積、更明顯的ALT水平升高和脂聯素減少，脂肪組織炎癥(高TNFα表達)和纖維化程度也更重。以上所有特征，混合飲食組比HCD組和HFD組更顯著[32]。同樣地，以高膽固醇(1.25%)和高膽鹽(0.5%)混合飲食喂養小鼠也顯示出更重的脂肪變、炎癥、肝氣球樣變、纖維化[21]。此類研究[31-32]表明控制膽固醇飲食可減少極低密度脂蛋白合成和脂肪酸β-氧化，并減少細胞凋亡和肝臟氧化應激。

2.3 高果糖飲食模型 富含果糖的食物也與肥胖和NASH的進展相關[33]。以HFD飲食或高脂肪和高果糖混合飲食(high-fat high-fructose diet,HFHF)喂養C57BL/6鼠模型結果發現，消耗果糖是肝脂肪沉積到肝纖維化生成過程中必需的環節，因為盡管體質量增加、身體肥胖、IR、肝脂肪變程度在兩組相似，但HFHF組鼠表現出更強的肝氧化應激以及肝CD11b+F4/80+Gr1+巨噬細胞數和膠原沉積增加[33]。一項最新研究[34]發現，以同樣的HFHF飲食分別喂養CXCR-3基因敲除鼠和C57BL/6野生鼠，CXCR-3基因敲除鼠表現出較輕的肝組織學改變和較低水平的壞死性炎癥，脂質過氧化反應也明顯減低，這表明在HFHF鼠模型中CXCR-3基因在NASH進展過程中的起重要作用。

2.4 foz/foz鼠 foz/foz鼠有一個突變的Alms1基因，其在細胞內轉運和食欲調節中起作用[35]。foz/foz鼠表現為病態的肥胖和食欲過盛，出現IR、脂聯素水平極大減少、膽固醇增加及肝臟脂肪變。HFD通過加重代謝并發癥來促進纖維化的發生，導致脂聯素水平降低、膽固醇水平升高。然而，飲食誘導的NASH嚴重性取決于小鼠的種族。以HFD喂養的foz/fozC57BL/6J鼠和foz/fozBALB/c鼠體質量增加是相同的，但是NAFLD在foz/fozBALB/c鼠中比foz/fozC57BL/6J鼠更嚴重。IR、高胰島素血癥、肥胖以及顯著的NAFLD相關肝纖維化可在foz/fozBALB/c鼠中被發現，而在foz/fozC57BL/6J鼠中未曾發現。這些研究結果，盡管肥胖的程度相同，但NASH的特征卻和種族相關[36]。

2.5 增加鐵負荷的db/db鼠模型 最新研究[37]表明db/db鼠體內超負荷的鐵可促進NAFLD到NASH和纖維化的進程。與正常飲食組喂養db/db鼠不同，高鐵飲食喂養的db/db鼠表現出肝細胞氣球樣變、纖維化形成、肝氧化應激增加、肝炎性免疫細胞活躍及肝線粒體脂肪酸β-氧化受損的改變，表明鐵負荷過重可能與NASH相關。

3 NAFLD誘導的HCC模型

非肝硬化NASH發生HCC的幾率是極低的[38]，脂肪攝入過多、肝脂肪變、NASH均是HCC的風險因素[5]。目前NAFLD和NASH鼠模型不能反映從脂肪肝、NASH、肝纖維化到HCC的組織學進展過程。雖然目前有很多實驗性HCC小鼠模型，但只有少量能反映NAFLD誘導的HCC特點[39]，因此建立新型的NASH相關HCC的動物模型是面臨的挑戰。

3.1 膳食NAFLD誘導的HCC模型 單純以一種飲食喂養的動物模型均有不同的局限性，以HFD喂養的C57BL/6鼠不能顯現NASH相似的病理學改變，而以MCD或膽堿缺乏喂養的小鼠卻可以，但MCD或膽堿缺乏飲食的鼠卻不能誘導代謝綜合征和肥胖的特征。因此Wolf等[40]提出一個混合飲食模型，即膽堿缺乏和HFD混合飲食(CD-HFD)。肝脂肪變、肝損傷、ALT、AST水平上升等改變，可同時存在于這種新型模型中。HFD鼠腫瘤發生率只有2.5%，而CD-HFD鼠腫瘤發生率可提高到25%。

在另一種聯合飲食模型中，以膽堿缺乏L-氨基酸的飲食(choline-deficient L-amino acid-defined diet,CDAA)喂養的小鼠可發展為肝損傷，其能反映NASH特征，并導致HCC。以CDAA喂養小鼠可誘導小鼠IR和肝脂肪變增加，糖類和脂質代謝酶的改變，并可誘導肝損傷和纖維化，甚至喂養9個月后可發展為HCC[41]。

Asgharpour等[42]最近報道一個NAFLD的飲食誘導HCC動物模型，是由C57BL/6J鼠和129S1/SvlmK鼠產生的同基因品系(isogenic strain,B6/129)，其可以具備NASH相關HCC患者的關鍵特征。以高脂肪和高糖混合飲食喂養的B6/129鼠可循序在4～8周發展為脂肪變，16～24周發展為NASH，52周后發展為HCC，這種模型是NASH相關HCC的一種理想的臨床前動物模型。

以CDAA飲食喂養并給予腹膜內注射CCl4的C57BL/6鼠具有更顯著的NASH和HCC特征，此類鼠比單一CDAA喂養的鼠有更嚴重的脂肪變、肝小葉炎癥和纖維化形成。此外，僅35%的CDAA C57BL/6鼠發展為HCC，但所有CDAA聯合CCl4的小鼠均發展為HCC，并且腫瘤的平均直徑更大[41]。

另外一種聯合動物模型，是以HFD飲食喂養并進一步給予鏈脲霉素(streptozotocin,STZ)治療的C57BL/6鼠，STZ是一種氨基葡萄糖亞硝基脲合成物，對胰腺β細胞有毒性作用，可在小鼠中誘導低胰島素血癥、高血糖血癥和糖尿病。以HFD刺激STZ小鼠可誘導肝臟組織學改變，包括脂肪變、小葉炎癥、纖維化，并在20周時出現腫瘤性突出物。其他與人類NASH類似的特征包括體質量增加、空腹血糖上升和ALT升高。雄性STZ HFD小鼠在16周時出現肝細胞大量增殖，并且最終發展為HCC。這種模型為觀察代謝紊亂、NASH以及HCC的相關機制提供了方式[43]。

3.2 先天性NAFLD誘導型HCC模型 磷酸酶及張力蛋白同族體(phosphatase and tensin homolog，PTEN)是一種腫瘤抑制基因，其缺乏將導致細胞過度增殖、凋亡減少、腫瘤形成。肝臟特異性PTEN缺乏鼠可進展成與人類相似的NASH和NASH相關的HCC。66%雄性和30%雌性PTEN缺乏鼠可在40～44周后在肝內出現腫瘤，83%雄性和50%雌性鼠可在74～78周后出現HCC[44]。因此，這種模型有助于理解NASH發病機制，也有助于了解NASH到HCC的發展進程。

3.3 聯合基因和化學物質誘導的NAFLD相關HCC模型 先天性肥胖是db/db鼠NASH相關性HCC進展的直接促發因素。以致癌物質二乙基亞硝胺處理的小鼠在13～15 d齡時出現體重增加、肝重量增加、肝脂肪變，同時也出現更高的HCC發生率以及更多更大的腫瘤結節[45]。這也為肥胖和NASH增加HCC的易感性相關研究提供了依據。

4 結論

上述動物模型用于模擬完整的NAFLD疾病譜都有自身的限制，有些能反映NAFLD的組織病理學，但不能反映其生理性，另一些則反映其生理性，但不能反映組織病理學。盡管它們各有不足，但目前在研究NAFLD的發病機制和疾病發展過程是很好的工具，并有助于揭示潛在的治療靶點，進一步探索更理想的、能模仿疾病譜的動物模型仍是今后研究的方向。

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Researchadvancesinanimalmodelsbasedonthepathogenesisandtreatmentofnonalcoholicfattyliverdisease

CHENYanzhen,CHENChengliang,TIANXing,etal.

(DepartmentofGastroenterology,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a continuous disease spectrum characterized by the accumulation of excessive lipid in hepatocytes. Simple hepatic steatosis may progress to NAFLD and even liver fibrosis, liver cirrhosis, and finally hepatocellular carcinoma. Animal models can simulate different causes and histopathological and pathophysiological changes in each stage of NAFLD and thus provide critical guidance for understanding the pathogenesis of NAFLD and selecting therapeutic measures. At present, there are still no ideal animal models that can simulate the whole disease spectrum. This article introduces the most frequently used and recently developed animal models for NAFLD and NAFLD-induced liver cancer and summarizes possible therapeutic targets with reference to the experimental pathogenesis of NAFLD in animal models, in order to provide a basis for further research on the pathogenesis and treatment of NAFLD.

nonalcoholic fatty liver disease; model animal; review

R575.5

A

1001-5256(2017)12-2457-05

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.12.046

2017-08-08；修回日期：2017-08-29。 作者簡介：陳艷珍(1991-)，女，主要研究肝膽及胃腸疾病。 通信作者：焦健，電子信箱：zrjiaojian@163.com。

引證本文：CHEN YZ, CHEN CL, TIAN X, et al. Research advances in animal models based on the pathogenesis and treatment of nonalcoholic fatty liver disease[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(12): 2457-2461. (in Chinese)

陳艷珍， 陳成良， 田興， 等. 基于非酒精性脂肪性肝病機制及治療的動物模型研究進展[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(12): 2457-2461.

(本文編輯：林 姣)