重癥監護病房分離金黃色葡萄球菌的分子流行特征

楊玉琪，徐修禮，馬越云，史皆然，周 珊，周 磊，郝曉柯

(第四軍醫大學西京醫院，陜西 西安 710032)

·論著·

重癥監護病房分離金黃色葡萄球菌的分子流行特征

楊玉琪，徐修禮，馬越云，史皆然，周 珊，周 磊，郝曉柯

(第四軍醫大學西京醫院，陜西 西安 710032)

目的 了解某三甲醫院重癥監護病房(ICU)患者分離金黃色葡萄球菌的分子流行特點及其同源性，為有效控制醫院感染的發生提供實驗室依據。方法 收集該院2013年3—8月ICU患者各類感染標本分離的62株金黃色葡萄球菌，采用PCR方法擴增7個管家基因并進行測序分析，采用多位點序列分型(MLST)技術獲得菌株ST分型，對ST分型進行親緣關系分析。結果 62株金黃色葡萄球菌均可以擴增出7個管家基因的特異性產物；共分為10個ST基因型，其中2個基因型為新發現的ST型(STn1和STn2)，1個為國內新發現的ST型(ST675)。ST239是ICU患者分離的金黃色葡萄球菌主要ST型別，占74.20%，分布于6個ICU，分布范圍最廣；其次為ST5，分布于3個ICU。62株菌株在系統進化樹上形成7個主要分支，檢出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)55株，占88.71%。結論 醫院ICU分離的金黃色葡萄球菌具有一定的同源性，并且少數型別表現出集中分布趨勢。

重癥監護病房； 金黃色葡萄球菌； 多位點序列分型； 基因； 同源性

[Chin J Infect Control，2017，16(2)：99-103]

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為革蘭染色陽性球菌，是一種重要的病原菌，也是近年來引起醫院感染的主要病原菌之一[1]。金黃色葡萄球菌由于傳播途徑廣、致病性強、抵抗力較強，在醫院內的傳播較為廣泛，已經成為醫院感染預防和控制的棘手問題[2]。金黃色葡萄球菌尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococusaureus，MRSA)，已經引起臨床醫務人員越來越多的重視，而且金黃色葡萄球菌醫院內傳播也成為醫院感染控制的重點問題。因此，分析臨床分離的金黃色葡萄球菌分子流行病學特點，并對其進行基因同源性分析，有助于及時判斷醫院感染的傳染源，明確傳播途徑，對預防和控制醫院感染具有重要意義。本研究對重癥監護病房(ICU)分離收集的62株金黃色葡萄球菌進行菌株鑒定及藥敏試驗，同時應用多位點序列分型技術(MLST)進行分子流行病學研究，采用eBURST軟件分析其基因同源性，了解金黃色葡萄球菌在醫院ICU的傳播及流行狀況，為臨床合理使用抗菌藥物及有效控制醫院感染提供實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集某醫院2013年3—8月ICU住院患者各種感染標本分離的62株金黃色葡萄球菌，并排除同一患者的重復菌株。

1.1.2 儀器與試劑 全自動細菌鑒定分析儀Phonenix 100(美國BD公司)，Mueller-Hinton瓊脂培養基(北京奧博星生物技術有限公司)，溶葡萄球菌酶(BBI生命科學有限公司)，QIAamp DNA純化試劑盒(德國凱杰公司)， DU800核酸蛋白分析儀(美國Beckman公司)，聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀(美國ABI公司)，DNA凝膠電泳系統(美國Bio-Rad公司)，凝膠電泳成像系統(上海復日科技有限公司)，PCR反應所用試劑(上海生工生物工程股份有限公司)，藥敏紙片(英國Oxoid公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離、鑒定 采用常規培養分離方法，操作方法依據《全國臨床檢驗操作規程》，應用Phonenix 100 全自動細菌鑒定分析儀鑒定細菌。

1.2.2 藥敏試驗 藥敏試驗采用K-B法和頭孢西丁紙片法，按美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2014年[3]規定的標準判定耐藥(R)、中介(I)、和敏感(S)。

1.2.3 細菌DNA的提取 使用QIAamp DNA純化試劑盒提取細菌DNA，首先對分離純化得到的對數生長期的單菌落進行細菌DNA的提取，然后用Beckman DU800核酸蛋白分析儀檢測提取的DNA純度和濃度，確保提取的DNA質量。

1.2.4 引物的設計與合成 參照金黃色葡萄球菌MLST數據庫(http://saureus.mlst.net/)推薦的7個獨立的管家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqil)設計引物[4]，引物由上海生工生物工程股份有限公司提供，合成引物序列見表1。

表1 金黃色葡萄球菌MLST各管家基因引物序列及片段長度

Table 1 Primer sequence and fragment length of housekeeping genes ofS.aureusMLST

管家基因引物(5’-3’)片段長度(bp)arcCF:TTGATTCACCAGCGCGTATTGTC456R:AGGTATCTGCTTCAATCAGCGaroEF:ATCGGAAATCCTATTTCACATTC456R:GGTGTTGTATTAATAACGATATCglpFF:CTAGGAACTGCAATCTTAATCC465R:TGGTAAAATCGCATGTCCAATTCgmkF:ATCGTTTTATCGGGACCATC429R:TCATTAACTACAACGTAATCGTAptaF:GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG474R:GACCCTTTTGTTGAAAAGCTTAAtpiF:TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAA402R:TTTGCACCTTCTAACAATTGTACyqilF:CAGCATACAGGACACCTATTGGC516R:CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC

1.2.5 PCR反應體系與擴增條件 PCR反應體系25 μL，其中Premix Taq 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板 2 μL，加無菌蒸餾水至25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共30個循環；最后72 ℃延伸5 min。

1.2.6 擴增產物的驗證、測序與比對分析 首先通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，然后將PCR產物送北京柏林羅核酸技術有限公司進行雙向測序，并利用BioEdit軟件對測序結果進行校正、拼接。

1.2.7 MLST型別 拼接后的結果與金黃色葡萄球菌MLST數據庫的數據進行比對分析，獲得對應的7個管家基因的等位基因，然后根據7個等位基因型進一步獲得該菌株的ST型別。

1.2.8 同源性分析 使用eBURST V3軟件(訪問地址：http://eburst.mlst.net)對62株金黃色葡萄球菌的ST基因型進行親緣關系分析，借助BURST算法繪制類似于網絡結構的輻射狀圖。本實驗參考菌株為中國臨床菌株，使用eBURST軟件按照嚴格標準[4]繪制菌株ST親緣關系分布圖。

2 結果

2.1 菌株分布 62株金黃色葡萄球菌分離自神經外科ICU(26株)、神經內科ICU(16株)、消化科ICU(6株)、呼吸內科ICU(6株)、麻醉科ICU(4株)、心臟外科ICU(2株)、燒傷科ICU(1株)和兒科ICU(1株)，其中痰標本56株、咽拭子2株、分泌物、引流液、組織和糞便標本各1株?；颊吣挲g0～94歲，平均48歲，男女性別比為1.95︰1(41/21)。

2.2 PCR擴增產物的鑒定結果 62株金黃色葡萄球菌均可以擴增出7個管家基因的特異性產物，擴增產物的大小為402 ～516 bp，擴增產物的電泳結果見圖1。

圖1 金黃色葡萄球菌管家基因PCR擴增電泳圖

Figure 1 PCR amplification electrophoresis map of house-keeping genes ofS.aureus

2.3 MLST分型結果 62株金黃色葡萄球菌共分為10個ST基因型，其中2個基因型為新發現的ST型(STn1和STn2)，1個為國內新發現的ST型(ST675)。ST239是金黃色葡萄球菌主要的ST型別，占74.20%，且分布于6個ICU，分布范圍最廣。其次為ST5，分布于3個ICU。ST630與ST239相比較，僅管家基因arcC的等位基因不同。ST675和STn2與ST5相比較，分別表現為管家基因aroE和glpF不同。62株金黃色葡萄球菌MLST分型結果及其在各科室的分布情況詳見表2。

表2 62株金黃色葡萄球菌科室分布及ST型別

Table 2 Department distribution and ST genotypes of 62S.aureusstrains

ST基因型等位基因譜(arcC-aroE-glpF-gmk-pta-tpi-yqil)科室分布株數構成比(%)ST2392-3-1-1-4-4-3神經外科ICU、神經內科ICU、燒傷科ICU、麻醉科ICU、呼吸內科ICU、消化科ICU4674.20ST51-4-1-4-12-1-10神經外科ICU、神經內科ICU、消化科ICU812.91ST204-9-1-8-1-10-8呼吸內科ICU11.61ST5919-23-15-2-19-20-15兒科ICU11.61ST1883-1-1-8-1-1-1神經內科ICU11.61ST63012-3-1-1-4-4-3心臟外科ICU11.61ST6751-36-1-4-12-1-10神經外科ICU11.61ST94418-18-6-59-13-15-18心臟外科ICU11.61STn11-4-1-23-12-240-10麻醉科ICU11.61STn21-4-327-4-12-1-10神經內科ICU11.61

2.4 藥敏結果 62株金黃色葡萄球菌對頭孢西丁耐藥的MRSA共55株，占88.71%。所有菌株對11種常見抗菌藥物的藥敏結果見表3，只有敏感及耐藥菌株，無中介菌株。46株ST239型金黃色葡萄球菌均為MRSA，表現出較強的耐藥性；而ST20型、ST188型、ST944型和STn1型金黃色葡萄球菌對11種常見抗菌藥物的敏感性相對較高。

表3 62株金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的藥敏結果

Table 3 Antimicrobial susceptibility testing results of 62S.aureusstrains

抗菌藥物檢測株數耐藥株數耐藥率(%)敏感株數敏感率(%)頭孢唑林625588.71711.29頭孢西丁625588.71711.29阿米卡星444090.9149.09替考拉寧5900.0059100.00萬古霉素6200.0062100.00利奈唑胺6100.0061100.00紅霉素625588.71711.29克林霉素624572.581727.42左氧氟沙星625385.48914.52呋喃妥因6200.0062100.00利福平443681.82818.18

2.5 eBURST分析結果 eBURST分析結果顯示，62株金黃色葡萄球菌10個ST型分布于中國臨床菌株分群的6個克隆群和1個散點(新型別STn1)。見圖2。在每個獨立的克隆群中，不同的ST型別用長度不等的直線相連，直線的長度表示不同ST型別之間親緣關系的遠近。6個克隆群中，最大的克隆群為ST239克隆復合群，ST239為此克隆復合群中其他各ST型別共同的祖先(Founder)，ST630是ST239的一個亞群。第二大的克隆群為ST1克隆復合群，存在1個一級亞群(ST188)和1個二級亞群(ST2201)。在ST5克隆復合群中，本研究中的ST675、STn2均為中國臨床參考菌株中第一次出現的新的ST型別。新發現的STn1因為不屬于任何1個克隆復合群，在分析中以散點的形式分布。

*紅色數字代表本研究和數據庫均有的ST型；綠色數字代表僅在本研究中發現的ST型；黑色數字代表僅數據庫中有的ST型

3 討論

金黃色葡萄球菌是我國引起醫院感染的重要病原菌之一，在該院也位居醫院感染分離病原菌的前三位[5]。近年來，金黃色葡萄球菌的耐藥率呈逐年升高趨勢[6]，尤其是MRSA在醫院感染中的比例大幅上升，導致臨床抗感染治療過程中可供選擇的藥物日益減少，使臨床抗感染治療變得更加棘手。研究[7]發現，2005年我國醫院MRSA的平均分離率在50%左右，而上海的醫院MRSA分離率可達78.4%。對金黃色葡萄球菌不同菌株間的親緣關系進行分子生物學分析，可以幫助我們了解臨床分離的金黃色葡萄球菌的傳播特點和趨勢，及時發現傳染源和尋找傳播途徑，為有效預防和控制金黃色葡萄球菌醫院感染暴發流行提供實驗室依據。

本研究采用國際公認的MLST方法，對醫院感染金黃色葡萄球菌進行基因分型[8]，該方法通過直接擴增金黃色葡萄球菌的多個管家基因，并將管家基因測序分析與數據庫比對，從而確定菌株的基因型，獲得的基因型可與國內外其他醫院或實驗室進行數據共享。MLST分型結果顯示，62株金黃色葡萄球菌10個ST型共分布于6個克隆群和1個散點，其中ST239克隆復合群為流行優勢菌群，占74.20%；其次為ST5克隆復合群，占總菌株的12.91%。該結果與Xiao等[9]的研究結果相符，該研究對中國大陸2011年27個省45個城市69家醫院分離的1 141株MRSA菌株進行MLST分型，結果表明ST239克隆群為流行優勢菌群(整體流行率為75.37%)，其次為ST5克隆群(整體流行率為12.62%)。Liu等[10]的研究報道，我國大部分地區MRSA流行株為ST239型菌株，說明該院金黃色葡萄球菌MLST分型結果與全國大部分醫院的結果一致，以ST239克隆復合群和ST5克隆復合群為主，且菌株分布具有集中趨勢。

金黃色葡萄球菌ST型別與科室分布關系顯示，ST239為ICU患者感染的主要ST型別，分布于6個ICU，包括神經外科ICU、神經內科ICU、燒傷ICU、呼吸內科ICU、消化科ICU和麻醉科ICU，分布范圍最廣；而ST5的流行范圍僅次于ST239，分布于3個ICU，包括神經外科ICU、神經內科ICU和消化科ICU。 62株金黃色葡萄球菌，主要分布于神經外科ICU (26株，41.94%)和神經內科ICU(16株，25.81%)；菌株來源主要為痰標本(56株，90.32%)，可能與大多數神經外科ICU和神經內科ICU的住院患者本身疾病有關，患者通常無正常吞咽和咳嗽的能力，痰難以咳出，細菌容易在痰中滋生和繁殖，從而容易發生墜積性肺炎[11]；同時，一部分患者由于接受了吸痰、氣管插管和呼吸機輔助呼吸等具有侵入性的操作[12]，導致呼吸道的正常防御屏障遭到損害，從而導致肺部感染。

藥敏試驗和MLST分型結果顯示，62株金黃色葡萄球菌中MRSA 55株(88.71%)，且MLST型別均屬于ST239克隆復合體和ST5克隆復合體；而ST20、ST188、ST944和STn1型別菌株的藥物敏感性卻表現為對11種抗菌藥物均敏感，由此推測菌株的藥物敏感性與其遺傳背景具有一定的相關性。對55株MRSA進行分析，發現其具有相似的耐藥譜，進一步證明菌株間的遺傳背景與藥物敏感性相關。我們已將新發現的兩株ST基因型菌株信息及其雙向測序的峰圖文件提交至MLST數據庫，等待數據庫最終命名。

綜上所述，該院ICU感染的金黃色葡萄球菌以ST239基因型為主，且分布范圍較廣；菌株親緣關系分析結果顯示，62株金黃色葡萄球菌具有集中分布趨勢，以ST239和ST5克隆復合群為主，兩種克隆復合群具有相似的耐藥譜；說明該院ICU金黃色葡萄球菌的感染存在醫院內播散的趨勢，該結果與之前的研究結果[13]相符。因此，我們應加強對臨床醫護人員的醫院感染預防控制的教育，嚴格按照醫療器械污染后導致感染的風險高低選擇相應的滅菌或消毒方法，及時采取有效的預防和控制措施，防止醫院感染的暴發流行[14]。

本研究采用MLST方法進行細菌分子流行病學方面的研究，該方法由于具有操作簡單、用時較少且便于比較等優點，現已被廣泛應用于微生物的分型研究[15-16]。但由于本實驗收集菌株數量相對較少，研究時間跨度相對較短，所以本研究結果在不同科室內是否存在主要ST型別尚未得出結論，需要完善實驗設計，擴大樣本量，開啟多中心、多地區相關流行病學研究進一步驗證。

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(本文編輯：孟秀娟)

Molecular epidemiological characteristics ofStaphylococcusaureusisolated in intensive care units

YANGYu-qi,XUXiu-li,MAYue-yun,SHIJie-ran,ZHOUShan,ZHOULei,HAOXiao-ke

(XijingHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

Objective To investigate the molecular epidemiological characteristics and homology ofStaphylococcusaureus(S.aureus) isolated from patients in intensive care units (ICUs) of a hospital, so as to provide laboratory basis for the effective control of healthcare-associated infection(HAI). Methods 62S.aureusstrains isolated from various specimens from ICU patients with infection in March-August 2013 were collected, 7 housekeeping genes were amplified with polymerase chain reaction (PCR), the amplified products were sequenced, ST typing of strains was performed by multilocus sequence typing (MLST)， phylogenetic analysis of ST typing was conducted. Results 62S.aureusstrains were amplified specific product of 7 housekeeping genes; there were 10 ST genotypes, in which 2 ST genotypes(STn1and STn2) were first discovered，1 ST genotype(ST675) was first discovered domestically. ST239 was the main ST type ofS.aureusfrom ICU patients in this hospital, accounting for 74.20%，which distributed in 6 ICUs， ST5 distributed in 3 ICUs. 62 strains formed 7 main branches in the phylogenetic tree, 55 (88.71%) MRSA strains were detected. ConclusionS.aureusisolated from hospital ICUs has some homology, and the small number of types showed the trend of concentrated distribution.

intensive care unit；Staphylococcusaureus； multilocus sequence typing； gene; homology

2016-04-28

陜西省自然科學基金資助項目(2014JM4188)；國家儀器重大專項(2012YQ03026107)

楊玉琪(1987-)，女(漢族)，陜西省西安市人，技師，主要從事臨床微生物檢驗及病原菌分子流行病學研究。

郝曉柯 E-mail: haoxkg@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.02.001

R181.3+2 R378.1+1

A

1671-9638(2017)02-0099-05