茉莉酸甲酯對明黨參植株和懸浮細胞中呋喃香豆素積累的影響

蔡靜+馬赟++陳建偉+李祥+周萍

[摘要]佛手酚、佛手柑內酯和花椒毒素為明黨參中天然呋喃香豆素成分，具多重藥理作用。以明黨參栽培品和懸浮培養細胞為材料，研究茉莉酸甲酯處理后呋喃香豆素積累狀況和一系列生理生化指標變化。結果顯示，茉莉酸甲酯不同程度地促進明黨參中各呋喃香豆素合成，柄懸浮細胞中產量高于葉懸浮細胞。于培養周期第10天加入100 μmol·L-1茉莉酸甲酯對明黨參懸浮細胞作用效果最明顯，最適收獲時間為處理4 d后，此時柄懸浮細胞中佛手酚，花椒毒素和佛手柑內酯產量分別是未誘導細胞的736，19，427倍。茉莉酸甲酯誘導呋喃香豆素增長的同時抑制細胞活力和生物量積累，激發細胞防御反應。該研究初次系統地探索了茉莉酸甲酯對明黨參中呋喃香豆素的誘導效果，并為大量生產3種活性成分和探明茉莉酸甲酯誘導機制奠定基礎。

[關鍵詞]明黨參； 呋喃香豆素； 茉莉酸甲酯； 誘導

明黨參Changium smyrnioides Wollf為我國特有的傘形科植物，收錄于《中國植物紅皮書》，屬易危級[12]。其根作為藥材明黨參載于現版藥典，具潤肺化痰，養陰和胃，解毒之功效[3]，亦作為重要藥材行銷東南亞各地。明黨參活性成分的前期研究著重于多糖、脂肪酸和揮發油等方面，呋喃香豆素是近年來研究較多的特征性成分[4]，廣泛存在于明黨參全株及組織培養材料中[57]，是明黨參滋補強壯功效的物質基礎之一，現代藥理研究認為其具有抗氧化、抗腫瘤、抗HIV、抗驚厥等多重藥理活性[811]，極具開發利用價值。

組織培養技術可用于生產藥用植物有效成分，結合誘導子可獲取大量目標產物，明黨參在此方面的研究較少且前期僅以多糖為指標，鮮有以呋喃香豆素為目標的培養研究[1215]。茉莉酸甲酯（MeJA）作為植物信號分子和常用的化學誘導子[1617]，對多種植物器官或組織培養材料中香豆素類成分表現出明顯的誘導作用[1821]。本實驗首次系統地探索MeJA對明黨參原植株和懸浮細胞生長的影響和其中3種呋喃香豆素的誘導效果，以期獲得最高產量，為進一步用于擴大化生產這3種天然產物奠定基礎，也為呋喃香豆素資源的開發和珍稀藥用植物明黨參的可持續利用提供新途徑。另一方面，本實驗探討了誘導過程中一系列植物生理生化指標的變化，為研究MeJA對明黨參的誘導機制提供依據。

1材料

11樣品植物材料栽培于南京中醫藥大學仙林校區藥苑，經南京中醫藥大學中藥資源教研室陳建偉教授鑒定為傘形科明黨參Ch smyrnioides。取幼嫩葉與葉柄誘導愈傷組織，采用MS培養基，激素配比分別為NAA 15 mg·L-1+2，4D 05 mg·L-1+KT 02 mg·L-1+6BA 05 mg·L-1和NAA 15 mg·L-1+2，4D 15 mg·L-1+KT 02 mg·L-1+6BA 05 mg·L1[12，22]。初代愈傷組織繼代3次后，用鑷子捏碎接種于對應的pH為58，含蔗糖30 g·L-1的MS液體培養基中，于25 ℃，光照強度1 500 lx，轉速120 r·min-1的搖床中培養。選取生長力強且含呋喃香豆素較多的葉和葉柄初代懸浮細胞系經50目鎳網濾過，作為細胞母液繼代備用，繼代起始濃度為干重20 mg·L-1。

12儀器與試劑DHZDA冷凍恒溫振蕩器（太倉實驗設備廠）；SPX300BG光照培養箱（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；FD1A50真空冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；Waters e2695高效液相色譜儀（美國沃特世公司，Waters 2998 PDA檢測器）；KH500DB數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）。對照品花椒毒素（批號JN01KEJR，東京化成工業株式會社）；對照品佛手柑內酯和佛手酚為本實驗室自明黨參根皮分離而得，經HPLC歸一化測定，純度均大于98%。色譜級甲醇（江蘇漢邦科技有限公司），其余試劑為分析純。

2方法

21MeJA對明黨參植株呋喃香豆素積累的影響于4月上旬明黨參生長旺盛時期向其地上部分均勻噴施200 μmol·L-1MeJA，對照組噴以蒸餾水，處理后第0，1，2，3，4，5天采收并分揀葉與葉柄，測定呋喃香豆素含量。

22MeJA濃度對明黨參懸浮細胞呋喃香豆素積累的影響取同批繼代的懸浮細胞，在生長周期第8天向培養體系中分別加入0，50，100，200 μmol·L-1MeJA，繼續培養5 d后收獲樣品，測定細胞生物量、活力和3種呋喃香豆素含量。

23MeJA加入時間點對明黨參懸浮細胞呋喃香豆素積累的影響取同批繼代的懸浮細胞，分別在生長周期第0，5，8，10，12 天加入100 μmol·L-1MeJA，繼續培養至第15 天收獲樣品，測定細胞生物量、活力和3種呋喃香豆素含量。

24MeJA處理后明黨參懸浮細胞呋喃香豆素動態積累取同批繼代的懸浮細胞，在生長周期第10天加入100 μmol·L-1MeJA，處理后第0 天起每天收獲樣品直至第5天，測定細胞生物量、活力、3種呋喃香豆素含量和相關生理生化指標。

25細胞生物量及活力測定量得懸浮細胞培養物總體積，抽濾后稱重，其與培養物總體積比值為細胞鮮重，細胞經冷凍干燥后再次稱量，其與培養物總體積比值為干重。采用TTC法測定活力[2324]，精密稱取02 g新鮮收獲的細胞于離心管中，加04% TTC溶液和01 mol·L-1 pH 70 PBS溶液各25 mL，混勻，25 ℃避光反應20 h。離心，棄上清，加5 mL無水乙醇，混勻，于60 ℃水浴并振蕩30 min，冷卻，離心，取上清，測定485 nm處吸光度，其與樣品質量比值即為細胞活力值。

26呋喃香豆素含量測定分別測定細胞與培養液中呋喃香豆素含量，兩者之和為懸浮細胞體系中總量。取明黨參細胞凍干粉末（過4號篩）05 g，精密稱定，加甲醇50 mL，于60 kHz超聲提取60 min，過濾，濾液揮發溶劑，用甲醇定容至5 mL，過045 μm濾膜，即得細胞供試品溶液。量得濾后培養液總體積，取50 mL，于40 ℃減壓干燥，加甲醇溶解，收集濾液，揮發溶劑，用甲醇定容到2 mL，過045 μm濾膜，即得培養液供試品溶液。采用高效液相色譜法測定3種香豆素含量，參照周萍等[13]方法，AgilentC18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，檢測波長為314 nm，進樣量為10 μL，流速為10 mL·min-1，水（A）甲醇（B）梯度洗脫程序為0～5 min，80%～70% A；5～25 min，70%～60% A；25～35 min，60%～40% A；35～50 min，40%～30% A；50～60 min，30%～0% A；60～70 min，0%～80% A。原植物葉、葉柄處理和測定方法與明黨參細胞相同。

27生理生化指標測定可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法，脯氨酸和丙二醛含量、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性均參照蔡慶生[25]的方法測定。

28數據處理利用Excel和SPSS 220軟件進行數據處理，處理間差異采用新復極差法（Duncan′s）比較，顯著水平為005，結果以±s表示。

3結果與分析

31MeJA對明黨參植株呋喃香豆素積累的影響處理后，花椒毒素和佛手柑內酯含量均明顯增長，兩者在葉中的含量最高達到對照的149，171倍，在柄中的含量最高達到對照的144，162倍，表明MeJA可有效誘導明黨參植株中2種呋喃香豆素合成。花椒毒素和佛手柑內酯受誘導后變化趨勢一致，但葉柄對MeJA誘導的反應進程更快（圖1）。MeJA可模擬類似昆蟲取食、機械損傷效果從而誘發防御行為，呋喃香豆素是明黨參產生的一類化學防御物質，研究表明由于植物生長和防御都需使用有限的資源，因而植物在權衡兩者的前提下做出直接防御、間接防御、不防御、負防御4類不同反應[2627]，就明黨參而言，先在更靠近地表的葉柄部位重點合成防御物質，以抵抗昆蟲取食等機械傷害，后重點轉向主要承擔光合作用、對生長更重要的葉部分。這可能是柄對誘導的應答更早而葉中呋喃香豆素積累作用更持久的原因。

32MeJA濃度對明黨參懸浮細胞呋喃香豆素積累的影響隨著MeJA濃度的增加，細胞生物量和活力與0 μmol·L-1處理相比均持續下降，3種呋喃香豆素含量與產量先升后降。其中花椒毒素主要積累于細胞內，佛手酚主要釋放于培養液，佛手柑內酯在細胞內外均有分布但以培養液中更多。濃度為100 μmol·L-1時三者含量和產量達到峰值，故該濃度是誘導明黨參懸浮細胞產生呋喃香豆素的最佳濃度（圖2）。

33MeJA加入時間點對明黨參懸浮細胞呋喃香豆素積累的影響隨MeJA加入時間點的推后，所得細胞生物量和活力總體上升，說明MeJA對明黨參細胞生長有抑制作用，細胞生長到一定時期（8 d及以后），積累一定生物量可緩解此抑制作用（圖3）。8，10 d處理所得3種呋喃香豆素含量與產量明顯高于其他組，含量上10 d處理略高于8 d處理或與之持平，但產量上均為10 d處理最高，故在細胞培養周期第10 天加入MeJA最佳。一般認為細胞生長指數后期或穩定前期是進行誘導處理的最佳時

A葉懸浮細胞；B葉柄懸浮細胞；n=4。

機[28]，本實驗中10 d即為指數后期，而穩定前期（12 d）的明黨參懸浮細胞對MeJA的反應顯著弱于10 d，說明此階段細胞對誘導敏感性已大大降低。一定的細胞密度有利于細胞間信號傳遞，故初期加入MeJA誘導所得呋喃香豆素含量也較低。

34MeJA處理后明黨參懸浮細胞呋喃香豆素動態積累處理后生物量緩慢增加后趨于穩定，活力在1 d明顯下降后變化減緩。呋喃香豆素積累趨勢大體相同，含量快速上升至3 d左右進入平穩期，產量多于4 d達到峰值，故誘導后4 d為適宜收獲時期。柄源細胞中花椒毒素與佛手柑內酯含量變化優先于葉源細胞，這與處理原植物所得結果一致，說明懸浮細胞雖經脫分化但仍保有原外植體器官的一定特性（圖4）。

與0 d相比生理生化指標總體先升后降，脯氨酸無顯著變化，可溶性蛋白和丙二醛變化較緩，表明MeJA對明黨參細胞膜系統造成一定程度氧化損傷但滲透脅迫較弱。各指標峰值出現于2 d左右，5 d多降回原水平，說明MeJA引起細胞防御反應，抗氧化酶活性的快速上升正是防御行為的體現，這與李陽等[29]研究結果一致。抗氧化酶緩解氧化損傷，故未造成后續明顯滲透脅迫，PAL為呋喃香豆素生物合成上游的關鍵酶，MeJA激發其活性短期升高，繼而呋喃香豆素大量積累。POD與PAL在柄細胞中的變化優先于葉細胞，這使得柄細胞活力受MeJA抑制后恢復更快且呋喃香豆素積累也更早。

與未加誘導的懸浮細胞相比，在培養周期第10天加入100 μmol·L-1MeJA誘導4 d的懸浮細胞中呋喃香豆素含量和產量有大幅提升（表1），花椒毒素和佛手柑內酯提升幅度葉細胞大于柄細胞，但3種呋喃香豆素含量和產量均為柄懸浮細胞更大。與原植物葉柄相比誘導后柄懸浮細胞花椒毒素含量仍較低，但其增添了葉柄中原本沒有的佛手酚且佛手柑內酯含量為原葉柄的39倍，故MeJA誘導的柄懸浮細胞可作為佛手酚和佛手柑內酯的生產資源。

4討論

不加誘導子的明黨參懸浮細胞中呋喃香豆素含量很低，但經MeJA誘導后增加十分顯著，說明明黨參懸浮細胞本身具有很大的生產呋喃香豆素潛力，而MeJA直接或間接地激活了合成途徑一系列酶。Chen等[19]對高氏柴胡不定根的誘導研究也發現MeJA可上調苯丙素類物質相關基因表達，從而進一步合成香豆素等下游物質。

原植株中佛手柑內酯和花椒毒素含量明顯高于懸浮細胞，但原植物葉和葉柄中均未檢出佛手酚。這與細胞狀態有關，分化與脫分化細胞中酶種類及酶活力存在差異。呋喃香豆素的生物合成途徑中，補骨脂素在花椒毒酚合酶和佛手酚合酶的作用下分別轉化成花椒毒酚和佛手酚，繼而再分別合成花椒毒素和佛手柑內酯[3031]。脫分化的懸浮培養細胞中各酶可能處于抑制狀態，因而呋喃香豆素含量較低，而分化的原植株細胞中佛手酚O甲基轉移酶活性可能較高，從佛手酚到佛手柑內酯的步驟進行的較為徹底，因此未檢出佛手酚。另一方面，原植物器官和懸浮細胞對MeJA處理的不同反應可能也出于兩者細胞狀態的不同，懸浮細胞雖分別源于葉和葉柄，但都已處于脫分化的均一狀態，所以接受誘導后變化趨勢基本一致，而葉和葉柄作為完全分化的器官，根據各自功能的不同作出不同的反應。

無論在原植物還是懸浮細胞中，經MeJA誘導的花椒毒素含量上升幅度都不及佛手酚和佛手柑內酯，說明MeJA雖對多種植物次生代謝產物有效[17]，但也具一定選擇性。本實驗中3種呋喃香豆素結構相似，合成途徑相近，MeJA對三者誘導效果的差異還需從其誘導機制的細節上尋找原因，同時可繼續探尋對花椒毒素作用更明顯的誘導子。

MeJA濃度是影響誘導效果的重要因素，不同植物及培養體系所需最佳濃度有較大差異，主要從5 μmol·L-1至500 μmol·L-1不等，但以100 μmol·

本實驗所用MeJA和已報道對誘導明黨參懸浮細胞呋喃香豆素有效的水楊酸[13]均為植物信號分子類物質，與防御相關的信號分子還包括寡聚糖、脫落酸、乙烯等[27]，可重點考察此類物質以進一步尋找有效的誘導子。研究中誘導物質多為一次性加入，可嘗試多次加入，研究可否產生疊加增效。誘導子間可產生互作，從而達到比單一使用更佳的效果[23]，可在尋得有效誘導子的基礎上，探索明黨參懸浮細胞中誘導子互作效應，以期獲取更高產量的有效成分。

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