藥用植物DNA標記輔助育種（一）：三七抗病品種選育研究

董林林+陳中堅+王勇+魏富剛++張連娟+徐江++尉廣飛+王瑞+楊娟+劉偉林++李西文+余育啟+陳士林

[摘要]藥用植物DNA標記輔助育種以DNA多態性為基礎，依據分子雜交、聚合酶鏈式反應、高通量測序等技術，篩選與高產、優質、抗逆等表型關聯的DNA片段作為標記，輔助新品種的選育。該研究采用DNA標記輔助育種結合系統選育的技術，選育首個三七抗病新品種“苗鄉抗七1號”。結果表明，基于RADSeq技術檢測出抗病品種包含12個特異SNP位點，經驗證record_519688位點與三七抗根腐病相關，包含此位點的基因片段可作為抗病品種的遺傳標記輔助三七系統選育；與常規栽培種相比，抗病品種種苗根腐病及銹腐病的發病率分別下降836%，718%；二年生及三年生三七根腐病的發病率分別下降436%，629%。此外，依據與抗病關聯的SNP篩選三七潛在的抗病群體，該模式擴大目標群體并提高選育效率。藥用植物DNA標記輔助育種將加快藥用植物新品種選育及推廣的進程，保障中藥材產業健康發展。

[關鍵詞]藥用植物； DNA標記輔助育種； 三七； 連作障礙； 抗病品種；簡化基因組測序技術； 單核苷酸多態性

藥用植物傳統育種主要依賴于植物的表型選擇，一個優良品種的培育往往需要花費幾年甚至十幾年的時間，如何提高育種效率，是育種的關鍵。基因型與環境間互作等多重因素會影響表型選擇效率，現代分子生物技術可加快藥用植物育種進程，而且縮短育種周期，其中藥用植物DNA標記輔助育種以DNA多態性為基礎，依據分子雜交、聚合酶鏈式反應、高通量測序等技術，篩選與高產、優質、抗逆等表型相聯的DNA片段作為標記，輔助新品種的選育，該技術可應用于遺傳圖譜構建、重要農藝性狀基因的標記定位、種質資源遺傳多樣性、分子標記輔助選擇等方面。隨著測序成本的降低，已經陸續在中草藥開展了轉錄組、全基因組測序，這些序列信息提供了大量的SSR和SNP等分子標記，有利于高密度遺傳圖譜和物理圖譜的構建，高密度圖譜加速了分子標記與優良性狀之間的連鎖研究，為發掘植物抗逆及參與有效成分合成途徑的新基因提供了許多線索和啟示，提高了選育的效率。陳士林等首次提出“Herbgenomics”的概念，該學科涉及中草藥結構基因組、功能基因組、基因組輔助育種、中草藥蛋白質組學、中草藥宏基因等內容，并闡明本草基因組學將加速藥用植物優良品種的選育并促進綠色中藥農業的科學化和規模化發展[12]。

本文以三七Panax notoginseng（Burk）FH Chen為例，介紹了藥用植物依據DNA多態性為基礎，利用高通量測序技術篩選與抗病相關聯的SNP標記，輔助三七抗病新品種的選育。三七是五加科人參屬植物，其性溫、味甘、微苦，具有散瘀止血、消腫定痛的功能，是片仔癀、云南白藥、復方三七口服液等常見中藥制劑的主要原料之一[3]。三七在心腦血管方面的獨特療效越來越被人們所認可，其需求量逐年增加。為滿足日益增長的需求，三七已經開展了系統的栽培技術研究，形成了較為規范的GAP技術體系[4]。然而三七為典型的生態脆弱型陰生植物，其分布區域較窄，連作障礙等問題嚴重[56]。三七的人工栽培過程中病蟲害比較嚴重，例如根結線蟲病害顯著抑制了三七塊根的生長，抑制率高達30%以上[7]；三七種植導致根際土壤微生物多樣性及組成的變化，隨著其種植年限增加根腐病致病菌Fusarum oxysporum的豐度顯著增加[8]。在病害防治過程中，高毒農藥的投入破壞了三七田間生態系統，并造成三七農殘及重金屬超標。而三七不同栽培品種的抗病性存在顯著性差異，選育抗病性品種可獲得性狀優良、抗逆性強的三七群體植株，有效的減少農藥的使用量[911]。抗病新品種的選育是保障三七產業可持續發展的策略之一。

系統選育是三七遺傳改良的方式之一，也是三七育種的重要手段。孫玉琴等對三七植株性狀差異進行比較，結果表明三七植株的莖、塊根、休眠芽、花序、葉、果實存在明顯變異，為三七育種工作提供了依據[12]。通過對三七不同變異類型中皂苷含量的比較分析，確定將紫根、復葉柄平展型、長形根、寬葉4種類型作為三七品種選育的目標[13]。然而系統選育育種周期長，受環境影響較大，在短時間內選擇優良性狀難度極大。采用DNA標記輔助三七新品種的選育，該方法不僅準確性高，而且縮短育種周期。本研究利用高通量測序技術檢測抗病群體中的SNP位點，結合PCR技術篩選與三七抗病關聯的DNA片段，以此基因片段作為標記輔助系統選育，并利用該關聯基因片段篩選潛在的抗病群體。該模式可加快新品種選育及推廣的進程，為中藥材可持續發展提供思路及策略。

1材料與方法

11三七DNA標記輔助新品種選育流程從文山周邊收集抗病單株并播種于云南文山三七科技示范園的試驗田，該試驗田為三七連作5年病圃。采集病圃中存活三七單株的種子，建立抗病群體；采用簡化基因組測序技術（restrictionsite associated dna sequencing，RADSeq） 結合PCR技術篩選抗病群體的關聯SNP位點，輔助三七新品種的系統選育；通過淘汰非目標性狀，分離和純化抗病群體，選育三七抗病新品種，三七DNA標記輔助選育流程見圖1。

12SNP位點分析采用高通量測序技術篩選抗病植株特異的SNP位點，闡述其特異性。分別采集30株抗病及感根腐病三七植株，采用HiSeq PE150測序，有效數據用于分析尋找SNP標記。測序流程為：利用多種限制性內切酶對該物種DNA分別進行酶切，根據酶切實驗的結果選擇合適的酶進行后續實驗；質檢合格的DNA樣品，采用RAD建庫方式構建長度范圍在300～500 bp的pairend文庫；Illumina HiSeq PE150測序，有效數據用于分析尋找海量SNP標記。

首先，對每個樣品中的RADtag進行比對歸類，按照每類tag的深度信息由大到小進行排序，得到每個個體的RADtag頻數表[14]。每個樣品的RADtag內部進行比對得到樣品內部的雜合位點信息。不同樣品之間的RADtag進行互相的比對，尋找個體之間單堿基差異信息[15]。綜合考慮每個個體RADtag的頻數表信息和比對信息，過濾掉可能來自重復區域的結果，從而得到高可信度的群體SNP標記基因分型結果[16]。其中性狀關聯的算法參照GLM（General Linear Model）模型[17]。

13SNP位點開發基于RADSeq技術獲得的SNP位點，設計引物篩選與三七抗病性關聯的SNP位點。在人工病圃中分別采集60株三七抗病株及感根腐病植株，采用植物基因組提取試劑盒（天根，中國）提取三七葉片總DNA，DNA濃度及質量經檢驗后，于-20 ℃備用。隨機挑選SNP位點進行開發，以record_519688位點設計抗病及對照群體的通用引物，引物序列為F1：5′TCATTATTATTATCCTC3′，R1：5′GAGCTTAACTAGCCCAG3′。針對上述SNP位點設計抗病群體的特異引物，為提高SNP分析的特異性，在特異引物的3′端區域加入1個人工錯配堿基，序列信息為Fk1：5′CATTATTATTATCCTCTTC3′，其中反向引物為R1。采用Pyrobest DNA Polymerase（貨號 DR005A，日本TaKaRa公司）對供試DNA進行PCR擴增，反應體系參照王瑞等[18]報道。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，產物送美吉公司進行測序。將產物的序列信息與RADSeq獲得的序列進行比對，確定與抗病相關聯的SNP位點。

14種苗等級分析將抗病群體的種子收集并播種后，分析種苗等級（n=186），其分類等級依據見表1，同時以常規栽培品種（n=186）為對照，分析抗病品種的種苗質量。表1三七種苗分級標準

Table 1The classification standard of notoginseng seedlings

分級單株重/g外觀形態一級≥25休眠芽肥壯，根系生長良好，無病蟲感染和機械損傷二級125～25休眠芽肥壯，根系生長良好，無病蟲感染和機械損傷三級075～125休眠芽生長一般，根系生長一般，無病蟲感染和機械損傷

15病害調查隨機取30株種苗，分析其病害類型及發病情況，以常規栽培種為對照，3次重復；調查二年生及三年生三七病害類型及發病率（n=60），并以常規栽培種為對照，3次重復。

16利用與抗病關聯的SNP位點篩選潛在抗病群體采用與抗病性關聯SNP位點（record_519688）的引物篩選留種基地的三七單株，保留含目標位點的植株栽種到人工病圃中進行系統選育，該模式擴大三七目標株系的繁育群體，提高育種效率并加快其新品種推廣的進程。

17數據分析采用SPSS 160軟件，在005水平進行顯著性方差分析。

2結果

21抗病植株的SNP位點開發結合SNP數據和表型數據，使用tassel v52進行性狀關聯分析，與感病群體相比，抗病群體具有12個差異的SNP位點（極顯著LOD>3）.

833%），而感病株無條帶，見圖2B。測序產物序列與RADSeq序列結果一致，感病株與抗病株的變異位點，見圖2C。結果表明，本試驗中該SNP位點與三七抗病性相關，可作為三七抗病品種的DNA標記。依據該位點對抗病群體后代進行選擇，目標株為667%，淘汰非目標株輔助系統選育。

A通用引物PCR產物；B特異引物PCR產物；C感病株與抗病株的PCR產物序列信息；1～10及a～k抗病品種；11～12感病品種；MDNA Marker；CK感病株；RC抗病株。

22三七抗病品種的種苗等級基于三七種苗質量及外部形態，制定了種苗的等級指標見圖3A。休眠芽肥壯，根系生長良好，無病蟲感染和機械損傷，單株質量大于等于25 g的種苗為一級，單株質量125～25 g的種苗為二級；休眠芽及根系生長一般，無病蟲感染和機械損傷，單株質量075～125 g的種苗為三級；單株質量小于075 g為級下種苗。常規栽培種與抗病品種的一級種苗分別為400%，389%；二級種苗分別為156%，267%，三級種苗分別為111%，167%，級下種苗分別為333%，178%見圖3B。常規栽培種及抗病品種的一級和二級種苗總量分別為556%，656%。

23三七抗病品種的病害類型及發病率調查發現，該試驗區內常規栽培種及抗病品種種苗的主要病害類型為根腐病及銹腐病，見圖4。常規栽培種及抗病品種種苗根腐病的發病率分別為67%，11%，而銹腐病發病率分別為156%，44%，抗病品種的根腐病及銹腐病發病率分別下降836%，718%。結果表明，抗病品種種苗對根腐病及銹腐病表現顯著的抗性。

調查結果表明，二年及三年生三七主要病害類型為根腐病，見圖5A，B。常規栽培種及抗病品種的

二年生三七根腐病發病率分別為34%，19%，三年生三七該病的發病率為114%，42%，見圖5C。與對照相比，二年及三年生三七抗病品種的根腐病發病率顯著下降了436%，629%。結果表明，二年及三年生三七抗病品種對根腐病表現出顯著的抗病性。

24利用與抗病關聯的SNP位點篩選潛在抗病群體在3個留種基地進行5 000份單株留種，利用抗病品種的SNP位點進行篩選，見圖6。留種基地分別為平遠鎮蓮花塘、硯山縣郊址村及文山縣平壩鎮。隨機抽取每個基地100份單株，采用通用引物（F1，R1）均檢測出清晰的目標條帶（n=300），特異引物（Fk1，R1）檢測該300份三七樣品的56份樣品包含清晰的目標條帶。結果表明，隨機檢測的自然群體中，包含目標位點的單株為187%。后續試驗中將目標株通過人工病圃進行系統選育，加快抗病品種的擴繁。

4討論

本研究利用DNA標記輔助系統選育技術獲得首個三七抗病新品種，選育純化后的抗病品種表現一致性、穩定性及特異性，作為新品種進行登記，該品種命名為“苗鄉抗七1號” （云林園植新登第2016060號），對根腐病具有顯著的抗性。本研究采用簡化基因組測序技術，快速檢測抗病品種的SNP位點，依據抗病表型結合PCR技術篩選并確定與抗病相關的SNP位點，利用該位點篩選目標株輔助系統選育，加快三七抗病新品種的選育。此外，利用該關聯位點輔助篩選留種基地潛在的抗病群體，之后將包含目標位點的株系在人工病圃中進行系統選育，進一步篩選并純化抗病群體，該模式擴大了目標株系的繁育群體，提高育種效率并加快中藥材的選育及推廣，研究結果將陸續發表。

利用DNA序列的遺傳多態性可建立物種的遺傳標記，加快藥用植物品種選育的進程。檢測DNA

水平上的遺傳變異最精確的方法是直接測定DNA序列，因此可利用高通量測序技術對測定的物種進行分析比較，揭示生物體在單個核苷酸水平上的遺傳多態性，輔助系統選育。RADSeq技術是在二代測序基礎上發展起來的一項基于全基因組酶切位點的簡化基因組測序技術，技術流程簡單，不受有無基因組的限制，即可獲得數以萬計的多態性標記，該方法快速鑒定高標準性的變異標記（SNP），已廣泛應用于分子育種，系統進化，種質資源鑒定等領域[19]。石璇等[20]以簡化基因組測序技術獲得40 765個有效單核苷酸多態（SNP），并用這些SNP位點分析了8個種質的群體結構和系統發生樹。簡化基因組測序能高效、低成本開發出大量可用于群體遺傳分析的SNP標記，為新品種的選育奠定基礎。本研究利用簡化基因組技術檢測SNP位點，為三七分子輔助育種提供有效的分子標記，并為無參考基因組中藥材分子輔助育種提供思路及策略。此外，前期工作中作者解析了三七塊莖的轉錄組，獲得30 852 單一序列，其中702% 的序列為注釋序列，篩選出11個參與三萜皂苷生物合成途徑的基因[21]；并依據轉錄組數據克隆了三萜皂苷合成途徑中編碼關鍵酶的基因（PnSE1，PnSE2）[2223]。因此可依據三七轉錄組及表達譜的研究，以參與或調控皂苷合成途徑的關鍵基因為目標基因，輔助選育高產優質的三七新品種，進而保障優質無公害的三七原料。

本研究首次對三七抗病品種進行系統選育，利用連作5年地塊作為三七抗病品種篩選的病圃，選種明確并加快了選育的進程。隨著栽培面積的不斷擴大，連作障礙造成三七的損失巨大，已成為制約該地區三七產業可持續發展的重要因素[2425]。三七栽培中根腐病及銹腐病是其主要病害類型，其中根腐病造成損失可達70%以上，甚至可導致毀園絕收[2627]。因此，抗根腐病三七新品種的選育是克服連作障礙的有效途徑之一。三七的單株根重、株高、莖粗等主要農藝性狀與種苗質量有明顯的相關性，表現出隨著種苗質量等次的提高而增加的趨勢；且三七產量也隨著種苗等級的提高而提高[28]。本研究中抗病品種的一級及二級種苗總量高于常規栽培品種，抗病品種的種苗對根腐病及銹腐病表現較強的抗性，兩年生及三年生三七對根腐病表現顯著的抗性，該三七抗病新品種的大面積推廣將有效減少農藥的使用量，減輕環境污染，降低農殘對人體健康的危害，促進并保障三七產業的可持續發展。本文以三七為例系統闡述了藥用植物DNA標記輔助育種，而抗病關聯DNA標記的進一步驗證及潛在抗病群體篩選的研究將在后續文章中發表。

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2017年1月 第42卷第1期Vol42， No 1Januar