阿魏酸拮抗PM2.5對A549細胞線粒體的損傷作用

勞文艷，畢婷婷，周艷麗，陳世杰，趙曉紅,?，刁 屹

（1.北京聯合大學功能食品科學技術研究院，北京 100191；2. 北京聯合大學 生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191）

阿魏酸拮抗PM2.5對A549細胞線粒體的損傷作用

勞文艷1,2，畢婷婷1，周艷麗1，陳世杰1，趙曉紅1,2,?，刁 屹1

（1.北京聯合大學功能食品科學技術研究院，北京 100191；2. 北京聯合大學 生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191）

研究阿魏酸是否具有拮抗PM2.5致線粒體損傷作用及拮抗機制。實驗分為空白對照組、PM2.5（240 μg/mL（損傷組和阿魏酸（80 mmol/L）保護組。通過MitoSOX Red特異性探針和流式細胞儀測定細胞線粒體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的含量；Annexin-V/PI雙染色法流式細胞儀檢測細胞凋亡率；JC-1染色法流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位的變化；活體細胞線粒體膜通道孔熒光檢測試劑盒檢測細胞線粒體膜通道孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）的開放情況；Western blot法檢測caspase-3、caspase-9、含錳金屬輔基的超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）和過氧化物酶增殖體激活受體γ共激活因子-1α（subunit of peroxisome proliferators-activated receptor-γ-coactivator-1α，PGC-1α）相關蛋白表達量。結果顯示，與空白對照組比較，PM2.5損傷組的細胞ROS含量、caspase-3和caspase-9表達量及細胞凋亡率升高，線粒體膜電位和mPTP活性及PGC-1α、MnSOD的表達量降低；阿魏酸預處理后，顯著降低了PM2.5造成的A549細胞ROS的含量、細胞凋亡率及caspase-3和caspase-9表達量的升高，顯著升高了PM2.5致A549細胞線粒體的膜電位、mPTP的活性及PGC-1α和MnSOD表達量的降低。阿魏酸對PM2.5致A549細胞線粒體損傷具有明顯的保護作用。

阿魏酸；PM2.5；A549細胞；線粒體；損傷；保護作用

PM2.5引起心血管和呼吸系統疾病與其細胞毒性相關[1-2]。PM2.5能夠引起細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）等自由基大量生成、DNA損傷繼而擾亂細胞周期，激活核轉錄因子-κB （nuclear factor-kappa B，NF-κB）等炎性信號通路引起炎癥因子大量生成，最終導致細胞凋亡或者壞死[3]。已有研究證實，細胞凋亡與線粒體損傷有關[4]。PM2.5對心腦系統損傷過程中也發現有線粒體異常的現象[5]。由于線粒體特殊的結構和功能，使其成為外界毒物刺激的敏感靶點。當受到有害物質的刺激后，線粒體結構易發生損傷與功能障礙，進而可能會導致相關疾病的發生[5-6]，因而成為細胞毒性研究的熱點之一。研究發現，人參皂苷Rg1與PM2.5共同作用于臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）48 h，可以拮抗PM2.5誘導的血管內皮細胞活性的下降[7]。Zhang Zhiguo等[8]分析了細顆粒物對人支氣管上皮細胞（human bronchial epithelial cells，HBEC）的毒性，并對已知的姜黃素在人體內的作用目標蛋白進行分析，建立兩個蛋白質-蛋白質相互作用網絡，利用IPA（ingenuity pathways analysis）軟件進行分析，預測結果顯示，姜黃素對細顆粒物引起的健康危害具有潛在的拮抗作用。本實驗室前期細胞實驗結果顯示，PM2.5能夠造成中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞、人肺腺癌細胞株A549的氧化損傷、炎性損傷和DNA鏈斷裂[9-11]，而植物活性物質阿魏酸可通過抗氧化、抗炎、抗DNA損傷作用發揮拮抗PM2.5對CHO細胞的保護作用[9,12]。但有關對A549細胞線粒體損傷作用的研究還少有報道，因此，本實驗將從氧化應激、線粒體內途徑凋亡以及線粒體結構和功能影響方面來研究阿魏酸拮抗PM2.5線粒體損傷作用及其機制，為生物活性物質拮抗PM2.5致健康影響的研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺腺癌細胞株A549 北京協和醫學院基礎學院細胞中心；阿魏酸標準品 美國Sigma公司；DMEM/F-12培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美國GIBCO公司；10×胰蛋白酶（蛋白酶含量為2.5%）、線粒體超氧化物紅色熒光探針（MitoSOX red mitochondrial superoxide indicator ，MitoSOX Red） 美國Invitrogen公司；辣根過氧化物酶標記二抗 北京鼎國昌盛生物研究所；聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）蛋白濃度測定試劑盒 江蘇碧云天生物技術研究所；細胞增殖與活性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）日本DOJINDO公司；細胞凋亡檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒 美國Genview公司；活體細胞線粒體膜通道孔熒光檢測試劑盒 美國Genmed公司；caspase-3及caspase-9多克隆抗體 美國CST公司；含錳金屬輔基的超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）、過氧化物酶增殖體激活受體γ共激活因子-1α（subunit of peroxisome proliferators- activated receptor-γ-coactivator-1α，PGC-1α）多克隆抗體 美國Abcam公司；β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體 美國Santa公司；彩色預染Marker 美國Fermentas公司。

1.2 儀器與設備

大氣流量采樣器TH1000C型 中國武漢天虹儀表有限公司；瑞典Munktell超純石英纖維濾膜 北京賽福萊博科技有限公司；LYOVAC GT2-3真空冷凍干燥機 德國SRK公司；TE2000-M倒置顯微鏡 日本Nikon公司；多功能酶標儀 美國Thermo公司；流式細胞儀 美國BD公司；微板分光光度計MQX200 美國Bio-Tek公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀、蛋白電泳轉移裝置 美國Bio-Rad公司；ImageQuant RT ECL凝膠成像系統 美國GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 PM2.5采集與處理

采樣地點位于北京城區西四環內的交通主干道旁的北京聯合大學應用文理學院教學樓6層頂，采用PM2.5大流量采樣器連續采樣22 h，采樣流量為1.05 m3/min，停機2 h為1 個采樣循環。采樣后的濾膜稱質量后，放入潔凈的自封袋中，4 ℃避光保存。

將采樣后的濾膜剪成1 cm×1 cm大小，浸泡在去離子水中，用超聲振蕩器振蕩3 次，每次30 min，洗脫顆粒物。洗提液用6層紗布過濾，將濾液真空冷凍干燥使其成為干粉，－20 ℃冰箱中避光保存。使用時紫外照射30 min后，用滅菌的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）配成5 mg/mL的PM2.5懸液，為保證懸液均勻，用前經超聲振蕩10 min。

將繼續盤問制度界定為行政強制措施的觀點，最大的問題即是相對人有可能涉嫌的是犯罪行為，對于犯罪行為應當采取的是刑事強制措施，這是其無法包含在內的情形。將繼續盤問制度界定為刑事強制措施也不符合法理，刑事強制措施必須要有法理明確的規定，在《刑事訴訟法》中并沒有規定繼續盤問。因此，無論是將繼續盤問制度界定為行政強制措施還是刑事強制措施都是不全面的。

1.3.2 分組及細胞處理

實驗分為空白對照組、PM2.5損傷組和阿魏酸保護組。用CCK-8法測定細胞增殖實驗的結果，選取PM2.5對細胞存活率大于80%的劑量（240 μg/mL）作為損傷劑量、阿魏酸具有促進細胞增殖的80 μmol/L作為拮抗損傷的實驗劑量。取生長良好的A549細胞用0.25%的胰蛋白酶消化成均勻的細胞懸液，調整細胞密度至5×104個/ mL，接種于6 孔培養板中，1 500 μL/孔，在37 ℃、5% CO2的培養箱內培養24 h。阿魏酸保護組加入80 μmol/L的阿魏酸預保護6 h，棄上清液，加入240 μg/mL PM2.5繼續作用20 h；PM2.5損傷組只加入240 μg/mL；空白對照組只加入等量的PBS。

1.3.3 ROS含量測定

細胞中加入2.5 μmol/L MitoSOX Red工作液1 mL，37 ℃避光孵育15 min，用37 ℃預熱的PBS洗去胞外的熒光探針，經胰蛋白酶消化、PBS清洗、離心，用PBS重懸制成0.5 mL單細胞懸液，用200 目的篩網過濾，轉移到流式細胞管內，通過流式細胞儀檢測細胞線粒體ROS含量。

1.3.4 細胞凋亡檢測

用不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的0.25%的胰蛋白酶消化細胞，PBS清洗離心后用500 μL的結合緩沖液（binding buffer）重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，用200 目濾網過濾，并轉移到流式管中，置冰上，然后加入5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI），混勻。室溫避光孵育15 min，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。根據流式圖計算出凋亡細胞占檢測細胞總數的百分率，即為細胞凋亡率。

1.3.5 細胞線粒體膜電位檢測

1.3.6 線粒體膜通道孔開放活性檢測

根據試劑盒說明書加載熒光探針，通過熒光分光光度計（激發波長488 nm，散發波長505 nm）的熒光變化，檢測細胞線線粒體膜通道孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）開放活性的變化情況。

1.3.7 Western blot法檢測蛋白表達

細胞用裂解液在冰上裂解30 min；刮下底部細胞轉移到1.5 mL的離心管中，4 ℃條件下13 000 r/min離心15 min。收集上清液，部分上清液用5×上樣緩沖液按體積比4∶1的比例混合均勻，100 ℃煮5 min，置于－80 ℃冰箱內保存。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各樣品的蛋白質濃度，根據測得的質量濃度計算各樣品的上樣體積，并做好記錄。蛋白轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，按試劑盒提供的方法進行一抗、二抗孵育。加上顯色液，利用Image Quant RTECL凝膠成像系統，獲取目標蛋白條帶的圖像；用Quantity One軟件分析得到蛋白條帶灰度值進行統計分析。結果計算時，蛋白相對表達量按照目標蛋白條帶灰度值與內參蛋白β-肌動蛋白條帶灰度值的比值表示。

1.4 數據處理分析

2 結果與分析

2.1 阿魏酸對PM2.5引起A549細胞氧化應激的保護作用

表1 阿魏酸對PM2.5引起A549細胞氧化應激的保護作用（n=3）Table1 Protective effect of FA on PM2.5-induced oxidative stress in A549 cellllss (n=3) %

由表1可見，PM2.5作用A549細胞后能引起線粒體ROS的含量明顯增高，與空白對照組比較具有極顯著差異（P＜0.01）；而阿魏酸可明顯拮抗PM2.5造成的A549細胞線粒體ROS含量的上升，與PM2.5損傷組比較具有極顯著差異（P＜0.01）；與空白對照組相比，PM2.5可顯著降低PGC-1α的表達量（P＜0.05），阿魏酸可拮抗PM2.5造成的A549細胞PGC-1α表達量的降低，與PM2.5損傷組比較具有顯著差異（P＜0.05）；與空白對照組相比，PM2.5作用可顯著降低MnSOD的表達量（P＜0.05），阿魏酸可拮抗PM2.5造成的A549細胞MnSOD表達量的降低，與PM2.5損傷組比較具有統計學差異（P＜0.05）。以上結果說明，阿魏酸可以對PM2.5引起的細胞線粒體氧化損傷具有明顯的保護作用，ROS水平的降低與細胞PGC-1α通路活性的降低及線粒體抗氧化蛋白MnSOD表達的增加有關。

2.2 阿魏酸抑制PM2.5誘導A549 細胞凋亡的保護作用

表2 阿魏酸拮抗PM2.5引起A549細胞的凋亡（n=3）Table2 Protective effect of FA on PM2.5-induced apoptosis and related protein expression in A549 cells (n=3)%

由表2可見，PM2.5處理A549細胞后，細胞凋亡率明顯升高，與空白對照組比較具有極顯著差異（P＜0.01）；阿魏酸可拮抗PM2.5誘導的A549細胞凋亡，與PM2.5損傷組比較細胞凋亡率降低，具有極顯著差異（P＜0.01）；與空白對照組相比，PM2.5處理的A549細胞caspase-3和caspase-9的表達量極顯著增加（P＜0.01），而阿魏酸可拮抗PM2.5造成的A549細胞caspase-3和caspase-9的表達量增加，與PM2.5損傷組比較具有極顯著的降低作用（P＜0.01）。

以上結果說明，阿魏酸可以抑制PM2.5誘導的A549細胞凋亡率增加，其作用機制與線粒體介導的細胞凋亡途徑有關。

2.3 阿魏酸對PM2.5引起A549細胞線粒體結構功能改變的保護作用

表3 阿魏酸對PM2.5引起A549細胞線粒體膜電位和mPTP開放活性改變的保護作用（n==33）Table3 Protective effect of FA on PM2.5-induced changes in mitochondrial membrane potential and mPTP activity in A549 celllss ((n == 33))

由表3結果顯示，PM2.5處理可明顯降低A549細胞線粒體mPTP活性和線粒體膜電位，與空白對照組比較均具有極顯著性差異（P＜0.01）；而阿魏酸可拮抗PM2.5造成的mPTP開放活性和由此引起的線粒體膜電位下降，與PM2.5損傷組比較具有顯著（P＜0.05）和極顯著差異（P＜0.01）。

以上結果說明，阿魏酸可以抑制PM2.5引起的mPTP開放，從而抑制線粒體膜電位下降，具有明顯的細胞保護作用。

3 討 論

3.1 PM2.5對線粒體的損傷作用

細胞暴露于PM2.5后，ROS的含量顯著增加、丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde，MDA）的濃度升高，呈現劑量-效應關系[13]。PM2.5在刺激ROS、NO含量增加的同時，還抑制機體抗氧化反應體系，抑制細胞內SOD、MnSOD、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶的活性，降低細胞清除ROS的能力，從而使細胞處于氧化應激狀態[13-14]。ROS 可激活受體PGC-1α通路，繼而誘導MnSOD等線粒體抗氧化蛋白的表達，保護細胞與線粒體免于氧化損傷[15]。PGC-1α是外界因素對線粒體損傷作用的重要的保護機制，是一個輔助轉錄因子，控制能量代謝相關基因[16]。當細胞受到外界因素的刺激，細胞線粒體能量代謝穩態失衡時，激活PGC-1α的表達抵抗外界因素對細胞的損傷，當刺激達到一定程度時就會抑制PGC-1α的表達，對細胞和線粒體造成損傷[17]。本研究的結果也顯示PM2.5處理的A549細胞ROS含量明顯增加，進一步抑制了PGC-1α和MnSOD的表達。

研究表明，人類呼吸道上皮細胞暴露于顆粒物后，可以激活一系列磷酸化，誘導白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）等相關炎性因子基因的表達和轉錄[18]。炎性因子TNF-α與線粒體膜電位變化有明顯的相關性，且可以激活caspase家族，引起細胞凋亡[19]，本此研究實驗結果與此相一致。馮哲偉[20]研究發現，在細胞凋亡的早期，烹調油煙可誘導線粒體通透性轉換，激活caspase-9和caspase-3，最終引起細胞線粒體介導的細胞凋亡。本研究經PM2.5處理的A549細胞中caspase-3和caspase-9的表達量顯著升高。

已有研究發現，線粒體外膜上的電位依賴性陰離子通道（potential dependent anion channel，VDAC），在細胞凋亡和細胞死亡過程中扮演重要角色[21-22]。Ca2＋通過VDAC表面存在Ca2＋結合位點調控mPTP的開放[23]。PM2.5可以升高細胞內Ca2＋濃度[24]。線粒體內高水平的Ca2＋和過度氧化應激是導致mPTP大量開放的主要因素[25-26]，mPTP開放會導致線粒體膜電位迅速降低，引起鈉、鉀、鈣等離子平衡失調，線粒體腫脹功能紊亂及結構破壞，最終導致細胞死亡[27-29]。本研究以A549細胞為研究對象，得到了相似結果：經PM2.5處理的細胞，ROS的生成量顯著增加，使mPTP開放，導致膜電位下降，最終導致細胞凋亡。

3.2 阿魏酸拮抗PM2.5的損傷作用

有關植物活性物質拮抗PM2.5的損傷作用的研究報道相對較少。研究發現，VE對由PM2.5引起的大鼠肺組織細胞的氧化性損傷具有一定的拮抗作用，大鼠口服VE后肺泡灌洗液中的氧化性指標乳酸脫氫酶、MDA、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶水平有所下降[30]。N-乙酰半胱氨酸對PM2.5造成的大鼠肺損傷也具有保護作用，通過抑制由PM2.5激活的NF-κB信號通路，提高了大鼠的抗氧化能力，同時降低了血清和肺組織中炎性因子的表達[31]。本實驗室前期通過對人肺成纖維細胞用單細胞凝膠電泳方法研究發現番茄紅素具有很好的拮抗PM2.5 DNA損傷的作用[32]；通過對CHO細胞凋亡相關通路以及遺傳毒性相關通路的研究發現阿魏酸、綠原酸、葒草素具有拮抗PM2.5凋亡和遺傳毒性的保護作用，其中以阿魏酸的保護作用最強[9-10]。

在針對PM2.5對A549細胞的線粒體損傷作用及損傷機理研究的基礎上，本實驗進一步研究了天然植物活性物質阿魏酸拮抗PM2.5線粒體損傷的保護作用。研究結果表明，阿魏酸能夠顯著的保護PM2.5引起的細胞增殖毒性作用，保護機制與清除自由基、抗氧化有關[9]。由本研究結果可以看出80 μmol/L的阿魏酸能有效地拮抗PM2.5對A549細胞的增殖毒性作用，在機制研究中發現，阿魏酸不僅可以減少線粒體內ROS的含量、激活被抑制的PGC-1α通路、促進MnSOD的表達，還能有效地抑制mPTP的開放和線粒體膜電位的下降，以及通過抑制caspase-9介導的線粒體內途徑引起的細胞凋亡。

目前對PM2.5的研究多集中于在細胞毒性水平上的研究，而針對早期線粒體毒性的研究及植物活性物質拮抗作用的研究相對較少。本研究證實植物活性單體物質具有較好的拮抗PM2.5線粒體毒性的作用，其保護機理與抗氧化、保護mPTP以及抑制線粒體內途徑介導的凋亡相關，而線粒體損傷機制中關于線粒體分裂融合的研究比較少，因此在以后的研究中應該繼續在對PM2.5對線粒體分裂融合方面進行深入研究。并且，除了對PM2.5的損傷機理研究外，更應該集中于如何治理PM2.5污染和尋找有效的拮抗物質來預防和保護人類健康等領域。

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Protective Effect of Ferulic Acid on PM2.5-Induced Mitochondrial Damage in A549 Cells

LAO Wenyan1,2, BI Tingting1, ZHOU Yanli1, CHEN Shijie1, ZHAO Xiaohong1,2,?, DIAO Yi1
(1. Research Institute for Science and Technology of Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China; 2. Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

In this study, we examined whether ferulic acid (FA) could protect against PM2.5-induced mitochondrial damage in A549 cells and explored the underlying mechanism. The cells were treated with PM2.5 (240 μg/mL) with and without the addition of 80 mmol/L FA. The contents of reactive oxygen species (ROS) were determined by fl ow cytometry using MitoSOX Red specific probe. Apoptosis was detected by flow cytometry with Annexin-V/PI method. Mitochondrial membrane potential was detected by fl ow cytometry with JC-1 staining. The activity of mitochondrial membrane channel pore was tested by mitochondrial permeability transition pore (mPTP) kit. The expression of caspase-3, caspase-9, manganese superoxide dismutase (MnSOD), and peroxisome proliferators-activated receptor-γ-coactivator-1α (FGC-1α) were detected by Western blotting. The results showed that, compared with the blank control group, the level of ROS and the expression of caspase-3 and caspase-9 in mitochondria, as well as the apoptosis rate of A549 cells induced by PM2.5 were increased. The membrane potential and the activity of mPTP in mitochondria of A549 cells induced by PM2.5 were decreased as well as the expression of PGC-1α and MnSOD. The pre-treatment of FA could prevent the increased mitochondrial ROS, apoptosis rate and expression of caspase-3 and caspase-9, and the decreased mitochondrial membrane potential, mPTP activity, and expression of PGC-1α and MnSOD caused by PM2.5. Therefore, FA had a signif i cant protective effect on PM2.5-induced mitochondrial damage in A549 cells.

ferulic acid; PM2.5; A549 cells; mitochondria; damage; protective effect

10.7506/spkx1002-6630-201703032

R994.6

A

1002-6630（2017）03-0195-06

2016-06-29

中國營養學會營養科研基金-帝斯曼專項科研基金項目（2015-030（CNS-DSM））；北京聯合大學生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室開放課題（Zk70201501）

勞文艷（1970—），女，高級實驗師，碩士，主要從事功能食品研究。E-mail：laowenyan@buu.edu.cn

?通信作者：趙曉紅（1961—），女，研究員，博士，主要從事環境與食品毒理學研究。E-mail：xiaohong@buu.edu.cn

勞文艷, 畢婷婷, 周艷麗, 等. 阿魏酸拮抗PM2.5對A549細胞線粒體的損傷作用[J]. 食品科學, 2017, 38(3)： 195-200. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703032. http：//www.spkx.net.cn

LAO Wenyan, BI Tingting, ZHOU Yanli, et al. Protective effect of ferulic acid on PM2.5-induced mitochondrial damage in A549 cells[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 195-200. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703032. http：// www.spkx.net.cn