高壓脈沖電場對抗氧化肽熒光特性的影響

王 瑩，劉靜波，邢 杰，李幸芳，殷涌光,*

（1.吉林大學生物與農業工程學院，吉林 長春 130025；2.吉林大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130062）

高壓脈沖電場對抗氧化肽熒光特性的影響

王 瑩1，劉靜波2，邢 杰2，李幸芳2，殷涌光1,*

（1.吉林大學生物與農業工程學院，吉林 長春 130025；2.吉林大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130062）

以前期研究所得的Gln-Trp-Phe-Met（QWFM，652.78）和Lys-Trp-Phe-Met（KWFM，610.78）抗氧化四肽為研究對象，探究高壓脈沖電場技術（pulsed electric field，PEF）對抗氧化肽熒光特性的改變。研究表明，在PEF作用下QWFM和KWFM的熒光強度發生了不同程度的改變，由于兩條結構相似的抗氧化四肽中色氨酸前端所連接的氨基酸不同，在相同的PEF處理條件下，QWFM的熒光強度變化更為顯著，在電場頻率為1 800 Hz和電場強度為15 kV/cm時，其熒光強度變化最顯著。通過監測經PEF處理后2 h抗氧化四肽熒光強度的變化，發現抗氧化四肽熒光強度的變化隨著時間的延長而逐漸減弱。通過圓二色譜分析和核磁共振波譜技術分析發現維持QWFM中β-折疊的氫鍵含量有所改變從而導致了β-折疊結構的含量有所減少。這些變化表明PEF技術可能通過改變抗氧化肽的化學結構而改變其熒光特性，為PEF技術應用于抗氧化肽的研究提供了理論基礎。

高壓脈沖電場；抗氧化肽；熒光強度；化學結構

高壓脈沖電場（pulsed electric fi eld，PEF）是高電壓工程和脈沖功率技術在食品工程和生物學領域的應用。相對于傳統的熱處理技術，PEF能夠避免或者極大地降低食品在處理過程中的感官品質和物理特性的變化，因此可以很大程度地保持食品的原有品質[1]。目前，關于PEF應用在牛奶和果汁滅菌方面的研究非常多，相對而言，在酶活鈍化和酶構象上的研究比較少[2-6]。

趙偉[7]以蛋清蛋白和卵白蛋白為研究對象，研究了對蛋白質起泡性、乳化性能和結構特性的影響，采用熒光光譜等技術發現PEF使溶菌酶熒光強度增加。鐘葵等[8]在研究PEF對辣根過氧化物酶的活性及酶構象的影響效果中，通過熒光光譜分析表明脈沖電場處理后辣根過氧化物酶蛋白的熒光強度都有所下降，但下降的幅度隨電場強度的增大而減小。李順子等[9]在研究蜂毒肽及其類似物的抗菌活性、溶血活性及與磷脂膜的作用時，通過分析蜂毒肽及合成的類似物的熒光特性表明蜂毒肽在磷脂脂質體誘導下，其二級結構發生了變化。然而目前PEF對蛋白類物質結構的作用研究大多停留在描述性的層面，缺乏對其作用機制更深層次的闡述[10]。故本研究以實驗室前期工作中用紅松籽經過酶解、超濾、純化、解譜等步驟，并通過試劑公司進行合成所得QWFM和KWFM抗氧化四肽為對象，探究了PEF對抗氧化肽熒光強度的影響，并借助圓二色譜（circular dichroism，CD），核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等技術力求在原子水平上初步揭示PEF對抗氧化肽熒光強度的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

QWFM抗氧化四肽、KWFM抗氧化四肽（純度均≥98%）（圖1） 合肥賽曼諾生物科技有限公司；乙醇、氫氧化鈉、D2O誘導劑和溴化鉀等試劑（分析純）北京化工廠。

圖1 QWFM、KWFM質譜圖Fig.1 Mass spectra of QWFM and KWFM

1.2 儀器與設備

PEF裝置，吉林大學殷涌光教授設計；PH-070A干燥箱/培養箱 上海一恒科學儀有限公司；BT25S電子分析天平（精度0.01 mg） 瑞士梅特勒-托利多公司；MOS-500圓二色譜儀 法國Bio-Logic公司；ZG-2真空冷凍干燥機 杭州創意真空冷凍干燥設備廠；RF-5301熒光分光光度計 日本島津公司；500 MHz超導液體核磁共振波譜儀 美國Bruke公司。

1.3 方法

1.3.1 PEF處理技術

PEF處理裝置[11]包含料泵、示波器、加熱裝置以及其他PEF處理裝置。加入樣品前，按照去離子水→乙醇→去離子水的順序對PEF裝置的物料回流管進行循環清洗，重復2～3 次[12]。隨后，將兩條抗氧化四肽溶解于去離子水中配制成質量濃度為8 mg/mL的溶液，并以3.2 mL/min的流速通入電場中。分別調節電場強度以及電場頻率以獲得不同PEF處理條件下的抗氧化肽液，收集以備下一步實驗。

1.3.2 PEF單因素試驗設計

據前期研究基礎，選取電場強度和電場頻率為試驗因素。考察不同電場強度以及電場頻率條件下PEF對兩條抗氧化四肽的影響。電場頻率為1 800、2 400 Hz；電場強度為5、10、15、20 kV/cm。

1.3.3 抗氧化肽熒光光譜分析

將PEF處理后的樣品分別用去離子水配制成0.2 mg/mL的抗氧化肽液置于4 ℃冰箱中備用，用熒光分光光度計測定抗氧化肽液的熒光特性，熒光分光度計的激發波長設置為300 nm，發射波長為310 nm，終止波長為900 nm，步長為1 nm，之后用去離子水清洗比色皿2～3 次，并用待測樣品潤洗2～3 次。將裝有待測樣品的比色皿置于熒光分光光度計的樣品槽中，進行測量[13]。

1.3.4 抗氧化肽二級結構的測定

抗氧化四肽溶液中二級結構的變化通過CD儀進行測定。參照文獻[14]中所描述的方法。起始波長設定為190 nm，終止波長設定為270 nm，步長1 nm，比色杯的光程長為0.1 cm，狹縫寬度2 nm，采集時間設定為1 nm/s。先后用去離子水和待測樣品對比色池進行潤洗，隨后加入250 μL質量濃度為1 mg/mL的待測樣品進行測定。

1.3.5 抗氧化肽H質子的測定

抗氧化肽所含H質子的變化通過NMR技術分析。參照Sharma等[15]的方法，將待測樣品放入5 mm核磁管中，按一定的比例加入D2O誘導劑，設置參數為5 mm核磁共振儀探頭，500 MHz共振頻率，13 μs脈沖寬度，采樣延遲時間為6 s，采樣次數為32 次。在此條件測定不同PEF條件處理下的抗氧化四肽1H-NMR譜圖。

1.3.6 數據處理與統計

數據采用SPSS 17.0統計軟件進行單因素方差分析、相關性分析。用獨立樣品的t檢驗差異顯著性檢驗，結果用±s表示，P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 PEF處理對抗氧化四肽熒光特性的影響

圖2 QWFM的熒光圖譜及對比分析Fig.2 Fluorescence spectra of QWFM with and without PEF treatment

圖3 KWFM的熒光圖譜及對比分析Fig.3 Fluorescence spectra of KWFM with and without PEF treatment

根據蛋白質分子的熒光特性，熒光吸收峰的熒光強度可以反應出蛋白質分子結構以及鍵能的變化等[16]。由圖2a、b可以看出，QWFM分別在343 nm，601 nm出現了吸收峰。可能是由于水在300 nm激發波長時出現了散射而引起了在601 nm處出現水的吸收峰。不同PEF處理條件下，抗氧化四肽的熒光強度不同。如圖2c所示，電場頻率設置為1 800 Hz時，可以看出在343 nm波長處，電場強度為10 kV/cm時，熒光強度最高，當電場強度增加到15 kV/cm時，熒光強度最低。電場強度為15 kV/cm時，QWFM熒光強度的變化最顯著。當電場頻率設置為2 400 Hz時，隨著電場強度的增加，在343 nm波長處，QWFM熒光強度的改變并不十分顯著，在10 kV/cm時，熒光強度降低較為顯著。

KWFM在350 nm波長處出現第一個熒光吸收峰（圖3a、b）。將電場頻率設置為1 800 Hz時，KWFM的熒光強度達到960以上。當電場強度增加到20 kV/cm時，熒光強度提高較為顯著。而當電場頻率設置為2 400 Hz時，隨著電場強度的增加，抗氧化四肽的熒光強度呈先上升后下降的趨勢，并在10 kV/cm處達到最大值。表明蛋白質構象發生了比較顯著的變化。這可能是由于蛋白分子在PEF的作用下，由于電子的轉移導致內部能量發生轉移進一步引發了熒光猝滅。由于電子的轉移而引發了能量轉移，即為內源發色基團發生熒光猝滅的現象[17]。當一個分子的發射光譜和另一分子的吸收光譜相重疊時，通過分子間偶極-偶極的共振偶合可使能量從給體轉移到受體，從而使熒光強度降低[18]。

蛋白質分子在PEF處理下，可能產生了給電子取代基[19]，可以加強熒光，如—OH、—OR、—CN、—NH2、—NHR、—NR2、—OCH3。由于取代基上的n電子的電子云幾乎與芳環上的π軌道平行，因而共享了共軛π電子結構，產生了p-π共軛效應，擴大了共軛雙鍵體系，所以引起了熒光強度的增加[20]。

2.2 不同氨基酸引起的抗氧化四肽熒光特性的變化

通過觀察QWFM和KWFM抗氧化四肽，可以看出兩條結構相似的肽其峰位略有不同，這可能是有于色氨酸前端連接的氨基酸基團不同引起的。由圖4可知，谷氨酰胺分子式中含有兩個C＝O雙鍵，賴氨酸分子式中只有一個C＝O雙鍵。由于C＝O雙鍵的存在，導致了整個分子的不飽和度增加，熒光強度較低。對于QWFM，當PEF處理條件發生改變，熒光強度變化較為顯著，這可能是由于兩個C＝O雙鍵的存在，使整個蛋白質分子處于一個比較不穩定的狀態[21]。相對于KWFM，當電場頻率設置在1 800 Hz，電場強度從5 kV/cm增加到15 kV/cm，熒光強度改變并不十分顯著。這可能是由于熒光基團色氨酸所連接的賴氨酸分之中只有一個C＝O雙鍵，不飽和程度相對較低，所以熒光強度的改變較QWFM相對較小。

圖4 QWFM（a）和KWFM（b）的化學結構Fig.4 Chemical structures of QWFM (a) and KWFM (b)

2.3 PEF處理后保留時間對抗氧化四肽熒光特性的影響

圖5 QWFM熒光圖譜及對比分析Fig.5 Fluorescence spectra of QWFM with and without PEF treatment

圖6 KWFM熒光圖譜及對比分析Fig.6 Fluorescence spectra of KWFM with and without PEF treatment

將電場頻率設置為1 800 Hz，對比圖2和圖5可以看出PEF處理后0 h和2 h QWFM熒光強度的變化，由圖5a、b可以看出貯藏2 h后熒光吸收峰峰位發生了左右位移的現象，這可能是由于PEF處理過后，隨著時間的延長，熒光強度的變化有下降的趨勢[22]，也可能是由于PEF處理效果發生了回彈，色氨酸的側鏈顯色基團對于這種變化比較敏感，在這種情況下，隨著電場強度從5 kV/cm增加到15 kV/cm，峰位在325～350 nm之間發生了變化，熒光強度變化也比較顯著。

將電場頻率設置為1 800 Hz和2 400 Hz，監測PEF處理后0 h和2 h QWFM熒光強度的變化，由圖5c可以看出隨著電場強度的增加，熒光強度的變化較小，表明PEF處理效果減小，這可能是由于PEF處理效果發生了回彈，導致了熒光強度的變化趨于平穩。對比圖3和圖6可以看出，PEF處理后0 h和2 h KWFM熒光強度的變化，在PEF處理后2 h，隨著電場強度的增加，熒光強度的變化很小，這說明電場處理效果發生了回彈，而導致了PEF處理后的KWFM的熒光強度基本趨向于未處理的抗氧化四肽熒光強度。

2.4 PEF對抗氧化四肽二級結構的影響

通過熒光圖譜分析發現QWFM在電場頻率為1 800 Hz和電場強度為15 kV/cm的處理條件下，其熒光強度變化最顯著，因此我們選取經該條件處理后與未經PEF處理的QWFM進行CD圖譜測定（圖7），探究在PEF作用下QWFM二級結構的改變。根據蛋白質的圓二色性，特征吸收峰處的吸收強度可以反映出體系中特征結構含量的變化[23]，采用β-折疊特征峰195 nm波長處的吸收值代表QWFM的折疊程度[24]并對比PEF處理后β-折疊的變化情況。通過對比可以得知未經過PEF處理和經過PEF處理的QWFM均在195 nm波長處有一個明顯且存在數值差異的正吸收峰，表明二者在溶液中主要以β-折疊的結構存在，且PEF處理在一定程度上改變了β-折疊的含量但并未完全的破壞β-折疊結構，從而引起了抗氧化肽熒光強度的降低。

圖7 QWFM圓二色譜圖Fig.7 Circular dichroism spectra of QWFM with and without PEF treatment

2.5 QWFM的1H-NMR分析

圖8 QWFFMM的1H-NNMMRR譜圖Fig.8 1H-NMR spectra of QWFM with and without PEF treatment

通過熒光圖譜分析發現QWFM在電場頻率為1 800 Hz和電場強度為15 kV/cm的處理條件下，其熒光強度變化最顯著，因此我們選取經該條件處理后與未經PEF處理的QWFM進行1H-NMR分析（圖8），探究其所含的H質子在PEF作用下的變化情況。通過對比經過電場頻率為1 800 Hz和電場強度為15 kV/cm處理后的樣品與未處理的樣品，發現H的化學位移基本相同，表明經過PEF處理后并未有處于新的化學環境的1H產生；但是在相同化學位移處，其吸收峰的面積卻有著較為顯著的改變，表明經過PEF處理后該1H所處的化學環境轉變為另一種已經存在的化學環境[25-30]。因此，推斷PEF處理可能破壞色氨酸的氫鍵從而降低QWFM的熒光強度。

3 結 論

綜上所述，本身具有熒光性的QWFM和KWFM抗氧化四肽在經過PEF處理后，其熒光特性會發生變化，并且隨著處理后貯藏時間的增加，熒光強度的改變減少。QWFM對微環境的變化比較敏感，當改變高壓脈沖電場處理條件時，QWFM的熒光強度變化較為顯著，在電場頻率為1 800Hz和電場強度為15 kV/cm的處理條件下，其熒光強度變化最顯著。相對于QWFM而言，KWFM由于結構較為穩定，改變PEF處理條件，其熒光特性的變化并不顯著。通過CD的分析和1H-NMR技術分析發現QWFM的β-折疊結構含量有所減少，維持β-折疊的氫鍵也有所變化。對于蛋白而言，PEF處理可以使蛋白質分子二級結構和三級結構發生變化，從而引起食品的抗氧化活性等一系列變化。通過PEF作用于抗氧化肽熒光特性的探究，我們能夠更加合理的對抗氧化肽進行改造，不僅為進一步研究抗氧化肽提供新的思路，也為PEF能夠更廣泛地應用打下基礎。

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Effect of Pulsed Electric Field (PEF) on Fluorescence Characteristics of Antioxidant Peptides

WANG Ying1, LIU Jingbo2, XING Jie2, LI Xingfang2, Yin Yongguang1,*
(1. College of Biological and Agricultural Engineering, Jilin University, Changchun 130025, China; 2. College of Food Science and Engineering, Jilin University, Changchun 130062, China)

Two antioxidant peptides obtained in our previous work, Gln-Trp-Phe-Met (QWFM, 652.78) and Lys-Trp-Phe-Met (KWFM, 610.78), were used to explore the effect of pulsed electric fi eld (PEF) on their fl uorescence intensity. The results showed that the fl uorescence intensity of both antioxidant peptides, which differed by N-terminal amino acid residues, especially QWFM, was changed after PEF treatment. The most signif i cant change in fl uorescence intensity of QWFM was observed at electric pulse frequency of 1 800 Hz and fi eld intensity of 15 kV/cm. The fl uorescence intensity of antioxidant peptides decreased as time elapsed after PEF treatment. The circular dichroism (CD) and nuclear magnetic resonance (NMR) spectra showed changed hydrogen bonds maintaining the β-sheet in QWFM and thus reduced β-sheet content. These results suggested that the chemical structure of antioxidant peptides and consequently their properties could be changed by PEF, which will provide a theoretical foundation for further exploitation and utilization of antioxidant peptides.

pulsed electric fi eld (PEF); antioxidant peptide; fl uorescence intensity; chemical structure

10.7506/spkx1002-6630-201703009

TS201.4

A

1002-6630（2017）03-0053-06

王瑩, 劉靜波, 邢杰, 等. 基于高壓脈沖電場技術對抗氧化肽熒光特性的研究[J]. 食品科學, 2017, 38(3)： 53-58. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703009. http：//www.spkx.net.cn

WANG Ying, LIU Jingbo, XING Jie, et al. Effect of pulsed electric fi eld (PEF) on fl uorescence characteristics of antioxidant peptides[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 53-58. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703009. http：//www.spkx.net.cn

2016-05-09

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2013AA102206-5）

王瑩（1984—），女，博士研究生，研究方向為食源性抗氧化活性肽。E-mail：jinkuang8499@163.com

*通信作者：殷涌光（1949—），男，教授，博士，研究方向為農產品精深加工。E-mail：biofood@jlu.edu.cn