拉曼光譜分析蕎麥多酚對米糠蛋白結構的影響

謝鳳英，馬 巖，王曉君，張秀玲,*，徐 速，陳少華

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.沈陽師范大學實驗教學中心，遼寧 沈陽 110034）

拉曼光譜分析蕎麥多酚對米糠蛋白結構的影響

謝鳳英1，馬 巖2，王曉君1，張秀玲1,*，徐 速1，陳少華1

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.沈陽師范大學實驗教學中心，遼寧 沈陽 110034）

利用拉曼光譜研究蕎麥多酚對米糠蛋白的影響。結果表明：隨著蕎麥多酚添加量增加，米糠蛋白結構變化規律為α-螺旋結構含量逐漸降低，β-折疊結構含量呈現先增加后降低的變化趨勢，β-轉角結構含量呈先降低后增加的變化趨勢，而無規則卷曲結構的含量逐漸增大；酪氨酸及色氨酸先趨于“暴露式”而后轉為“包埋態”，而蕎麥多酚的添加使米糠蛋白二硫鍵由gauche-gauche-trans構型和trans-gauche-trans構型逐漸轉變為gauche-gauche-gauche構型。因此，蕎麥多酚與米糠蛋白的交互作用可部分破壞米糠蛋白分子間二硫鍵，降低米糠蛋白分子間作用，增強米糠蛋白結構的穩定性。

拉曼光譜；蕎麥多酚；米糠蛋白；結構

蕎麥作為雜糧作物之一，不僅營養豐富，還含有抗氧化、降血糖、抗腫瘤等多種藥理作用的多酚類物質[1-3]。蕎麥中多酚類物質分布于整個籽粒之中，主要為蘆丁、山奈酸、槲皮素、槲皮素-3-蕓香糖葡萄糖苷等[4-5]。雜糧多酚提取物抗氧化活性的研究表明，雜糧作物的種子中既含有果蔬中非營養成分——多酚化合物，而且還可以對果蔬中這些成分的不足和缺陷進行補充[6]。因此，蕎麥作為功能性食品開發的重要谷物來源，其提取物抗氧化作用的研究越來越受到重視，并成為研究的熱點。

近年來，多酚與植物蛋白之間相互作用的研究發現，多酚可以通過氫鍵、疏水交互作用與氨基酸側鏈形成多酚和蛋白質復合物，致使蛋白空間結構及溶解度、乳化性等功能特性發生改變[7-9]。例如，茶多酚與酪蛋白形成復合物時，由于茶多酚的存在酪蛋白二級結構中的α-螺旋和β-折疊均會有所減少，進而改變了酪蛋白空間結構。β-乳球蛋白與表沒食子兒茶素共存時，由于范德華力、氫鍵等分子間作用力的存在，β-乳球蛋白天然構象會發生一定程度的扭轉變化[10-12]。

米糠蛋白因受米糠油氧化誘導作用，引起蛋白質部分結構折疊、功能性降低。本研究基于拉曼光譜無損、快速、所需樣品量少、無需制備試樣、無需消耗化學試劑的特點，探討蕎麥多酚對米糠蛋白結構影響規律，進而探明多酚對蛋白質功能性質的影響，實現谷物多酚提取物在食品體系中的穩態化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕎麥 黑龍江牡丹江市深森山珍食品有限公司；米糠蛋白 黑龍江東方糧油集團。兩種原材料粉碎后過60 目篩，低溫冰箱保存備用；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LabRAM XploRA Plus拉曼光譜儀 法國JY公司；FW 400A型高速萬能粉碎機 常州市偉嘉儀器制造有限公司；HWJB-2100AT型恒溫磁力攪拌器 河南中良科學儀器有限公司；SC-3614型離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；R-1005旋轉蒸發儀 鄭州長城科工貿有限公司；FA 2004型電子天平 上海衡平儀器儀表廠。

1.3 方法

1.3.1 蕎麥多酚提取物制備

準確稱取10.0 g蕎麥粉于燒杯中，溶于65%乙醇溶液中，其料液比為1∶12（m/V），在56 ℃條件下浸提6 h，離心，取上清液后濃縮定容至25 mL容量瓶中，即為蕎麥多酚提取液[13]。蕎麥多酚含量采用福林-酚法[14-15]進行測定，其值為0.48%。通過水溶液調配控制提取液中蕎麥多酚含量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%。

1.3.2 蕎麥多酚與米糠蛋白混合液的制備

取5 種不同含量蕎麥多酚提取液與5%的米糠蛋白溶液于燒杯中充分混勻，靜置30 min后待測。將添加有不同蕎麥多酚含量的米糠蛋白混合液分別命名為RBP-0%（空白樣）、RBP-0.1%、RBP-0.2%、RBP-0.3%、RBP-0.4%、RBP-0.48%。

1.3.3 拉曼光譜分析

蕎麥多酚-米糠蛋白樣品通過拉曼光譜儀進行測定。其光譜條件為：激發波長：785 nm；發射功率：300 mW；光譜測定范圍為600～1 800 cm－1。所測樣品的拉曼譜圖經信號累加計算均值后，繪圖輸出。其中，拉曼圖譜基線校正、各峰歸屬采用Labspec 4.0軟件處理；拉曼峰強度變化以苯丙氨酸的1 004 cm－1（內標）為依據進行歸一化處理；利用Origin 8.5軟件進行譜圖的擬合。1.4 數據處理

每組實驗都進行3 次平行實驗，并將實驗數據進行誤差分析。采用統計學軟件SPSS 18對實驗數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 蕎麥多酚對米糠蛋白結構影響的拉曼光譜分析結果

圖1 蕎麥多酚對米糠結構影響的拉曼光譜分析圖Fig.1 Raman analysis of the effect of buckwheat polyphenols on the structure of rice bran proteins

添加不同含量蕎麥多酚的米糠蛋白拉曼光譜圖如圖1所示，譜圖中對應的譜峰及譜峰指認見表1。在拉曼光譜測定中，譜線強度與散射中心（化學鍵和基團）數目為正比例關系[16-17]。因此，樣品譜線強度變化可作為化學鍵或基團改變程度判定的依據，譜線強度變小意味著對應的基團或化學鍵受到損傷，譜線若發生偏移意味著其所對應的化學鍵或基團在樣品處理中發生了改變。

表1 米糠蛋白拉曼光譜的特征峰指認表Table1 Raman band assignment of rice pran proteins

2.2 添加蕎麥多酚對米糠蛋白二級結構影響

米糠蛋白的構象主要由拉曼光譜中酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶的特征峰決定，酰胺Ⅰ是C＝O與C－N鍵的伸張，酰胺Ⅲ帶是C－N鍵的伸張和N－H在平面上的轉折。其特征峰在酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶中分別是：α-螺旋為1 645～1 660 cm－1和1 265～1 300 cm－1，β-折疊為1 665～1 680 cm－1和1 230～1 240 cm－1，β-轉角為1 640～1 645 cm－1和1 305 cm－1，無規則卷曲為1 660～1 670 cm－1和1 240～1 260 cm－1。

采用Labspec 4.0軟件對多酚-米糠蛋白樣品拉曼光譜的酰胺Ⅰ區進行分析，參考文獻[18-20]，米糠蛋白二級結構拉曼特征峰位置：α-螺旋結構為1 645～1 660 cm－1；β-折疊結構為1 665～1 680 cm－1；β-轉角結構為1 680～1 690 cm－1；無規則卷曲結構為1 660～1 670 cm－1，進一步分析得到相應結果如表2所示。

表2 利用酰胺Ⅰ帶擬合米糠蛋白二級結構組成結果Table2 Secondary structure composition of rice bran proteins determined by amideⅠband fi tting %

通過對米糠蛋白二級結構的解析可知，米糠蛋白中最主要的二級結構單元為β-折疊，β-轉角含量最少。現有研究亦證實了米糠蛋白中含有較多的β-折疊及較少的α-螺旋[21-23]。對比原始樣品，添加蕎麥多酚總體減少了α-螺旋含量，而增大了無規則卷曲含量。隨著蕎麥多酚添加量的提高，米糠蛋白的α-螺旋含量逐漸降低，無規則卷曲含量逐漸增大，β-折疊含量呈現先增大后降低的變化趨勢，而β-轉角含量呈先降低后增大的變化趨勢。多酚化合物對蛋白質二級結構產生的影響已被實驗所證實。例如，當蛋白質與茶多酚形成復合物時，全脂乳中蛋白質β-折疊和無規則卷曲含量有所降低，而α-螺旋及β-轉角含量有所增加[24-26]；Wu Xuli等[27]研究了兒茶素和β-乳球蛋白通過疏水作用結合時，發現二者的相互作用可增加β-乳球蛋白的α-螺旋結構含量。Kanakis等[28]研究發現茶多酚與β-乳球蛋白的交互作用可增加α-螺旋和β-折疊含量，有利于蛋白質結構的穩定。

2.3 添加蕎麥多酚對米糠蛋白側鏈結構影響

酪氨酸的費米共振會引起850 cm－1和830 cm－1左右處的特征峰隨側鏈微環境改變，當強度比I850/I830≥1時，該酪氨酸是“暴露的”；強度比I850/I830＜1時，該酪氨酸就是“埋藏的”。本研究中I850/I830比值均為0.50～1.25范圍內，兩種酪氨酸殘基的分子數（N）計算結果如表3所示。

表3 酪氨酸費米共振線I885500/I883300以及殘基暴露/包埋分子數Table3 Tyrosyl doublet stretching ring at 850/83300 ccmm--11and thhee number of exposed/buried residues

由表3可知，從酪氨酸殘基暴露/包埋分子數來看，酪氨酸殘基多暴露于蛋白分子的表面上，以氫鍵的供體或受體的形式與水相結合。但在蕎麥多酚添加量逐漸增大過程中，酪氨酸I850/I830和N暴/N包值均呈先增大后降低的變化趨勢，即酪氨酸先趨于“暴露式”而后轉為“包埋態”。

756 cm－1處附近的拉曼譜帶歸屬為色氨酸側鏈，由圖1可知，各組樣品的米糠蛋白譜線強度分別為0.96（RBP-0%）、0.94（RBP-0.1%）、0.90（RBP-0.2%）、0.93（RBP-0.3%）、0.95（RBP-0.4%）、0.99（RBP-0.48%）。已有研究表明，756 cm－1處附近的色氨酸拉曼歸屬譜帶強度越低，蛋白質的色氨酸趨于“暴露式”，反之則趨于“包埋態”[29-30]。通過比較可知，米糠蛋白的色氨酸譜帶強度隨著蕎麥多酚添加量的增加呈現先降低后增大的變化趨勢，表明隨著蕎麥多酚的添加量增大，米糠蛋白色氨酸更趨于“暴露式”，但蕎麥多酚添加量進一步增加卻使米糠蛋白色氨酸趨于“包埋態”。

通過比較蕎麥多酚添加后米糠蛋白色氨酸及酪氨酸疏水環境的變化規律可以推測，低劑量蕎麥多酚通過非共價結合誘導米糠蛋白質二級結構發生改變產生部分折疊，而高劑量的蕎麥多酚添加會由于蛋白質含量高于多酚而促使米糠蛋白部分聚集而沉淀。

2.4 二硫鍵分析

在拉曼光譜中，二硫鍵的特征譜帶為500～550 cm－1。在該區間中拉曼位移與振動模式對應關系為：500～510 cm－1處為gauche-gauche-gauche（g-g-g）模式，515～525 cm－1處為gauche-gauche-trans（g-g-t）模式，535～545 cm－1處為trans-gauche-trans（t-g-t）模式。

為了確定蕎麥多酚對米糠蛋白二硫鍵的影響，運用Peak Analyzer軟件進行多峰值Guassina擬合，擬合譜線與實驗數據合成的譜線比較接近，驗證了擬合結果的準確性。由圖2可知，米糠蛋白的二硫鍵構型主要為t-g-t模式，各組樣品的二硫鍵構型組成含量如表4所示。

圖2 蕎麥多酚對米糠蛋白二硫鍵構型的影響Fig.2 Effect of buckwheat polyphenols on the conformation of S-S bonds in rice bran proteins

表4 實驗樣品中二硫鍵構型組成含量Table4 Con fi gurational compositions of disul fi de bonds in test samples %

通過比較可知，隨著蕎麥多酚添加量的增加，米糠蛋白二硫鍵g-g-t構型及t-g-t構型含量逐漸降低，而g-g-g構型含量有所增加，即蕎麥多酚的添加使米糠蛋白二硫鍵由g-g-t構型和t-g-t構型逐漸轉變為g-g-g構型。t-g-t構型是典型的分子間二硫鍵構型，而g-g-g構型是主要的分子內二硫鍵構型，故通過上述分析可知，蕎麥多酚可部分破壞米糠蛋白分子間二硫鍵，降低米糠蛋白分子間作用。

3 結 論

通過蕎麥多酚和米糠蛋白混合物拉曼光譜分析發現米糠蛋白中最主要的二級結構單元為β-折疊，β-轉角含量最少。蕎麥多酚添加減少了米糠蛋白α-螺旋含量，而增大其無規則卷曲含量。但米糠蛋白隨著蕎麥多酚添加量的增加結構的變化為α-螺旋含量逐漸降低，無規則卷曲含量逐漸增大，β-折疊含量呈現先增大后降低的變化趨勢，而β-轉角含量呈先降低后增大的變化趨勢。米糠蛋白的酪氨酸殘基隨著蕎麥多酚添加量的增大由“暴露式”轉為“包埋態”。米糠蛋白色氨酸譜帶強度隨著蕎麥多酚添加量增加呈先降低后增大的變化趨勢，表明隨著蕎麥多酚的添加量增大，米糠蛋白色氨酸更趨于“暴露式”，但當蕎麥多酚添加量進一步增加時卻會使米糠蛋白色氨酸趨于“包埋態”。米糠蛋白的二硫鍵構型主要為t-g-t模式，在蕎麥多酚的添加量逐漸增加時米糠蛋白二硫鍵由g-g-t構型和t-g-t構型逐漸轉變為g-g-g構型。上述結論對于系統地探討蕎麥多酚抗氧化作用及其在米糠蛋白貯藏中應用提供了一定理論支持。

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Effect of Buckwheat Polyphenols on the Structure of Rice Bran Proteins Analyzed by Raman Spectroscopy

XIE Fengying1, MA Yan2, WANG Xiaojun1, ZHANG Xiuling1,*, XU Su1, CHEN Shaohua1
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Center of Experiment Teaching, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

The effect of buckwheat polyphenols on the structure of rice bran proteins was studied by Raman spectroscopy in this research. Our results demonstrated that with increasing addition of buckwheat polyphenols, the secondary structures of rice bran proteins revealed a gradual decrease in α-helix content, an initial increase followed by a decrease in β-sheet content, an initial decrease and then an increase in β-turn content, and a gradual increase in random coil content. Furthermore, both tyrosine and tryptophan residues tended to be exposed at fi rst and then transformed to a buried state. The addition of buckwheat polyphenols could lead to a configurational transformation of the disulfide bonds from gauche-gauche-trans and trans-gauche-trans to gauche-gauche-gauche. Therefore, the interaction between buckwheat polyphenols and rice bran proteins could partially damage the disulf i de bonds in rice bran proteins and thereby enhance the structural stability of rice bran proteins.

Raman spectroscopy; buckwheat polyphenols; rice bran proteins; structure

10.7506/spkx1002-6630-201703006

TS201.1

A

1002-6630（2017）03-0032-05

謝鳳英, 馬巖, 王曉君, 等. 拉曼光譜分析蕎麥多酚對米糠蛋白結構的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(3)： 32-36. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703006. http：//www.spkx.net.cn

XIE Fengying, MA Yan, WANG Xiaojun, et al. Effect of buckwheat polyphenols on the structure of rice bran proteins analyzed by Raman spectroscopy[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 32-36. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201703006. http：//www.spkx.net.cn

2016-04-12

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD22B01）；黑龍江省科技攻關項目（Gc13B409）

謝鳳英（1975—），女，講師，博士，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白質工程。E-mail：spxfy@163.com *通信作者：張秀玲（1968—），女，教授，博士，研究方向為農產品貯藏與加工。E-mail：zhangxiuling1118@sina.com