甘肅不同產(chǎn)地黃管秦艽藥材質(zhì)量灰色關(guān)聯(lián)分析評價

汪潔，朱順娟，樊秦，楊麗，夏鵬飛，王引權(quán)，趙磊，，5

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；4.西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000；5.甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室培育基地，甘肅 蘭州 730000

甘肅不同產(chǎn)地黃管秦艽藥材質(zhì)量灰色關(guān)聯(lián)分析評價

汪潔1，朱順娟1，樊秦2，楊麗1，夏鵬飛3，王引權(quán)4，趙磊1，2，5

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；4.西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000；5.甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室培育基地，甘肅 蘭州 730000

目的建立甘肅不同產(chǎn)地黃管秦艽藥材的灰色關(guān)聯(lián)度模型，并進(jìn)行質(zhì)量評價。方法以甘肅10個產(chǎn)地黃管秦艽為研究對象，測定龍膽苦苷、總環(huán)烯醚萜苷類、醇浸出物、總灰分、酸不溶性灰分含量，采用灰色關(guān)聯(lián)度法構(gòu)建黃管秦艽質(zhì)量的灰色關(guān)聯(lián)度評價模型。結(jié)果10個不同產(chǎn)地黃管秦艽樣品的相對關(guān)聯(lián)度在0.394～0.652之間。其中相對關(guān)聯(lián)度＞0.50的樣品有6個產(chǎn)地，其樣品質(zhì)量評價較高，其余產(chǎn)地藥材質(zhì)量評價較低（相對關(guān)聯(lián)度＜0.50）。卓尼縣柳林鄉(xiāng)觀景臺產(chǎn)地黃管秦艽的指標(biāo)相對關(guān)聯(lián)度最大（0.652），質(zhì)量評價最優(yōu)；漳縣三岔鎮(zhèn)狼王溝產(chǎn)地黃管秦艽的指標(biāo)相對關(guān)聯(lián)度最?。?.394），質(zhì)量評價最差。結(jié)論灰色關(guān)聯(lián)度分析法及模型可應(yīng)用于黃管秦艽藥材的質(zhì)量評價，本研究結(jié)果可為黃管秦艽的開發(fā)利用提供一定的試驗基礎(chǔ)。

黃管秦艽；灰色關(guān)聯(lián)度法；質(zhì)量評價

2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，秦艽為龍膽科龍膽屬多年生草本植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.、麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.、粗莖秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.和小秦艽Gentiana dahurica Fisch.的干燥根[1]。秦艽始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“主寒熱邪氣，寒濕風(fēng)痹，肢節(jié)痛、下水、利小便。”其味辛、苦，性平，歸胃、肝、膽經(jīng)，可祛風(fēng)濕、舒筋絡(luò)、退虛熱、清肝膽濕熱而退黃，用于風(fēng)濕痹痛、骨蒸潮熱、骨節(jié)酸痛、筋脈拘攣、濕熱黃疸等癥[2]。甘肅為秦艽的道地產(chǎn)區(qū)，早在1987年秦艽被國家列為瀕危三級保護(hù)物種[3]。非藥典品種黃管秦艽其藥材性狀、根部橫切面、顯微特征結(jié)構(gòu)均與秦艽相似，黃管秦艽與秦艽在ITS水平上為一類，同源性達(dá)99.5%[4]。黃管秦艽在甘肅分布廣泛，易栽易活，種植規(guī)模較大，其龍膽苦苷含量高達(dá)8.05%[5]，明顯高于藥典品種。因此，開發(fā)和利用黃管秦艽對保護(hù)秦艽資源具有重要的應(yīng)用價值和理論意義?？偔h(huán)烯醚萜苷是龍膽科植物特有的主要有效成分與苦味成分，龍膽苦苷是單萜類化合物，是秦艽的主要有效成分，藥效學(xué)研究表明，龍膽苦苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、保肝利膽、健胃、抗腫瘤、抗氧化及降低血壓等藥理作用[6]?；曳?、浸出物含量也可在一定程度上反映藥材的質(zhì)量。

灰色系統(tǒng)既包括已知信息又包括未知信息，意圖透過一定的方法去尋求系統(tǒng)中各子系統(tǒng)（或因素）之間的數(shù)值關(guān)系[7]?；疑P(guān)聯(lián)度分析是灰色系統(tǒng)理論的基本內(nèi)容，為一個系統(tǒng)的發(fā)展變化態(tài)勢提供了量化的度量，基于“中藥成分與中藥質(zhì)量是一種灰色關(guān)系”的認(rèn)識，因此可運用灰色關(guān)聯(lián)度分析法來評價藥材質(zhì)量[8]。為客觀有效地評價甘肅不同產(chǎn)地黃管秦艽的質(zhì)量，本研究以甘肅10個產(chǎn)地的黃管秦艽為研究對象，對藥材中龍膽苦苷、總環(huán)烯醚萜苷類、醇浸出物、總灰分、酸不溶性灰分進(jìn)行測定，構(gòu)建不同產(chǎn)地黃管秦艽質(zhì)量的灰色關(guān)聯(lián)度分析，為該藥材的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100系列高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；C18柱（Thermo scientific）；BS110S型電子天平（萬分之一，德國賽多利斯集團(tuán)）；Sartorius BT 125D型電子天平（十萬分之一，德國賽多利斯集團(tuán)）；KH-500DE型超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；YK-400B型粉碎機（山東省青州市益康中藥機械有限公司）；HH-601型水浴鍋（金壇市恒豐儀器廠）；C型氣流烘干器（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）；三號篩（上海東方藥品科技實業(yè)有限公司）；濾紙（杭州特種紙業(yè)有限公司）；甲醇為色譜純；鹽酸、氯化銀、乙醇為分析純。

10批黃管秦艽采自甘肅不同產(chǎn)地，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)晉玲教授鑒定為Gentiana officinalis H.Smith.的干燥根，樣品來源見表1。

表1 甘肅10個不同產(chǎn)地黃管秦艽樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)性成分含量測定

2.1.1 醇浸出物 按2015年版《中華人民共和國藥典》醇溶性浸出物測定法（附錄Ⅹ A）項下熱浸法測定。

2.1.2 總灰分和酸不溶性灰分 按2015年版《中華人民共和國藥典》附錄Ⅸ K規(guī)定進(jìn)行測定。

2.1.3 龍膽苦苷

2.1.3.1 色譜條件 Thermo C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（25∶75），流速1.0 mL/min，檢測波長274 nm。色譜圖見圖1、圖2。

圖2 甘肅10個不同產(chǎn)地黃管秦艽樣品HPLC圖

2.1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱定20.43 mg龍膽苦苷對照品，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，搖勻，即得每1 mL含2.043 mg龍膽苦苷的對照品溶液。

2.1.3.3 供試品溶液的制備 精密稱定0.5 g黃管秦艽粉末，置于具塞錐形瓶中，精密加入100 mL甲醇，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取上述對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，分別吸取上述各溶液10 μL進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以進(jìn)樣濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得回歸方程Y＝11 338X＋31.71（r＝0.999 9），結(jié)果表明龍膽苦苷在0.20～1.02 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3.5 樣品含量測定 取不同產(chǎn)地黃管秦艽樣品，按“2.1.3.3”項下方法制備，在“2.1.3.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見表2。

表2 甘肅10個產(chǎn)地黃管秦艽中龍膽苦苷含量測定結(jié)果（n＝3）

2.1.4 環(huán)烯醚萜苷

2.1.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取龍膽苦苷對照品0.010 5 g，用80%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，搖勻，即得。

2.1.4.2 供試品溶液的制備 精密稱定黃管秦艽藥材粉末5.0 g于圓底燒瓶中，精密加入100 mL蒸餾水，回流提取1 h，抽濾，濾液定容至100 mL，作為上樣液。精密量取上樣液35 mL，過大孔吸附樹脂柱，反復(fù)上樣至水提液無色。30%乙醇洗脫，至洗脫液無色。洗脫液用30%乙醇溶液定容至250 mL。精密量取洗脫液1 mL，用30%乙醇定容至10 mL容量瓶中，即得。

2.1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取上述對照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于10 mL容量瓶中，加80%乙醇定容至刻度，采用一階導(dǎo)數(shù)于266.00 nm處測定吸光度（見圖3、圖4），以濃度對吸光度作回歸曲線，計算得回歸方程Y＝0.284 2X＋0.000 3，r＝0.998 9，結(jié)果表明龍膽苦苷在0.010 5～0.036 8 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4.4 樣品含量測定 取對照品溶液和供試品溶液進(jìn)行紫外全波長掃描。樣品及對照品吸收曲線作一階導(dǎo)數(shù)處理，供試品溶液和對照品溶液在266 nm處均有最大吸收，峰型較好。因此采用一階導(dǎo)數(shù)分光光度法測定樣品中環(huán)烯醚萜苷含量，結(jié)果見表3。

圖3 黃管秦艽中龍膽苦苷紫外吸收圖

圖4 黃管秦艽中龍膽苦苷紫外吸收一階導(dǎo)數(shù)圖

表3 甘肅10個產(chǎn)地黃管秦艽中環(huán)烯醚萜苷含量測定結(jié)果（n＝3）

2.2 灰色關(guān)聯(lián)度法的建立

2.2.1 參考序列的選擇 設(shè)有m個藥材樣品，每個藥材樣品有n項評價指標(biāo)，則可組成評價單元序列{Xak}（a＝1，2，3……m；k＝1，2，3……n；本研究中m＝10，n＝5）[9]。在質(zhì)量評價角度分析，醇浸出物、龍膽苦苷、總環(huán)烯醚萜苷類含量越高質(zhì)量越好，灰分、酸不溶性灰分含量越低質(zhì)量越好。為了統(tǒng)一評價標(biāo)準(zhǔn)，采用將低樣品對應(yīng)優(yōu)指標(biāo)高優(yōu)化的方法[10]。用灰色關(guān)聯(lián)度作為評價測度時，試驗將總灰分和酸不溶性灰分含量進(jìn)行取倒數(shù)轉(zhuǎn)換。評價指標(biāo)統(tǒng)一后，設(shè)最優(yōu)參考序列的各項指標(biāo)是n個指標(biāo)的最大值，記為{Xsk}＝max{1≤s≤m}{Xik}，最差參考序列的各項指標(biāo)是m個樣品對應(yīng)指標(biāo)的最小值，記為{Xtk}＝min {l≤t≤m}{Xik}[9]。

2.2.2 原始識別數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理 如果原始數(shù)據(jù)量綱不統(tǒng)一，則需要對其原始數(shù)據(jù)進(jìn)行變換處理。通常以均值化變換最常用，公式為Yik＝Xik/Yk（Yik為規(guī)格化處理后的數(shù)據(jù)，Xik為原始數(shù)據(jù)，Yk為第m個樣品的第k個指標(biāo)的均值）[11]。

2.2.3 關(guān)聯(lián)系數(shù)的計算 相對于最優(yōu)參考序列和最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)分別按公式（1）、（2）計算[12]。

2.2.4 關(guān)聯(lián)度的計算 相對于最優(yōu)參考序列和最差參考序列的關(guān)聯(lián)度分別按公式（3）、（4）計算[12]。

2.2.5 相對關(guān)聯(lián)度的計算 如果評價單元與最優(yōu)參考序列ri(s)關(guān)聯(lián)程度最大而同時與最差參考序列ri(t)的關(guān)聯(lián)程度最小，則說明所評價的序列越理想，為最佳評價單元。由此將評價單元序列同時相對于最優(yōu)參考序列和最差參考序列的相對關(guān)聯(lián)度r定義為ri＝ri(s)/（ri(s)＋ri(t)），（i＝1，2，……n），根據(jù)相對關(guān)聯(lián)度的大小對評價單元序列進(jìn)行排序，最終得到評價結(jié)果[12]。

3 質(zhì)量評價灰色關(guān)聯(lián)度模式的建立

3.1 樣品數(shù)據(jù)的建立

測定不同產(chǎn)地黃管秦艽藥材的醇浸出物、龍膽苦苷、總環(huán)烯醚萜苷類，總灰分和酸不溶性灰分含量5個主要評價指標(biāo)，計算各成分的百分含量，建立評價黃管秦艽藥材質(zhì)量的灰色模式識別數(shù)據(jù)集，見表4。

表4 甘肅10個不同產(chǎn)地黃管秦艽指標(biāo)性成分含量（%）

3.2 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

將原始數(shù)據(jù)集按照公式Y(jié)ik＝Xik/Yk進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果見表5。

表5 甘肅10個不同產(chǎn)地黃管秦艽原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理結(jié)果

3.3 關(guān)聯(lián)系數(shù)與關(guān)聯(lián)度的計算

分別由公式（1）、（2）、（3）、（4）計算各評價單元相對于最優(yōu)、最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)及關(guān)聯(lián)度ri(s)、ri(t)，結(jié)果見表6、表7。

表6 評價單元序列相對于最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)

表7 評價單元序列相對于最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)

3.4 計算相對關(guān)聯(lián)度

由公式計算黃管秦艽樣品的相對關(guān)聯(lián)度，按照ri的大小進(jìn)行排序，得出不同產(chǎn)地黃管秦艽的質(zhì)量名次，見表8。

表8 黃管秦艽樣品相對關(guān)聯(lián)度質(zhì)量排序

3.5 黃管秦艽藥材質(zhì)量評價

相對關(guān)聯(lián)度ri越大，該產(chǎn)地黃管秦艽的質(zhì)量評價越高[13]，10批樣品的相對關(guān)聯(lián)度在0.394～0.652之間。其中相對關(guān)聯(lián)度＞0.50的有6個產(chǎn)地，其藥材質(zhì)量評價較高；其余產(chǎn)地樣品的相對關(guān)聯(lián)度＜0.50，質(zhì)量評價較低。各樣品產(chǎn)地質(zhì)量評價為HGQJ5＞HGQJ2＞HGQJ8＞HGQJ7＞HGQJ9＞HGQJ3＞HGQJ6＞HGQJ10＞HGQJ4＞HGQJ1，卓尼縣柳林鄉(xiāng)觀景臺產(chǎn)地的黃管秦艽中指標(biāo)相對關(guān)聯(lián)度最大（0.652）、質(zhì)量評價最優(yōu)，其次為臨潭縣新城鎮(zhèn)劉旗村樣品（0.649），漳縣三岔鎮(zhèn)狼王溝樣品相對關(guān)聯(lián)度最小（0.394）、質(zhì)量評價較差。

4 討論

本研究在測定黃管秦艽中醇浸出物、龍膽苦苷、總環(huán)烯醚萜苷類、總灰分和酸不溶性灰分含量的基礎(chǔ)上對甘肅不同產(chǎn)地黃管秦艽質(zhì)量進(jìn)行了評價。醇浸出物含量測定按照藥典采用熱浸法測定，甘肅10個不同產(chǎn)地黃管秦艽藥材醇浸出物含量在29.24%～41.49%之間，均高于藥典中關(guān)于秦艽醇浸出物含量的規(guī)定；龍膽苦苷含量參照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行測定：[HPLC采用Thermo C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動為相甲醇-水（25∶75），流速1.0 mL/min，檢測波長274 nm]，不同產(chǎn)地黃管秦艽藥材中龍膽苦苷含量均高于藥典規(guī)定的秦艽中龍膽苦苷的含量（含龍膽苦苷和馬錢苷酸的總量不得少于2.5%）；水提液中總環(huán)烯醚萜苷類的含量測定參照文獻(xiàn)[14]采用一階導(dǎo)數(shù)于266 nm處測定吸光度，以濃度對吸光度作回歸曲線，計算其含量；總灰分和酸不溶性灰分部分產(chǎn)地含量高于藥典規(guī)定的秦艽總灰分、酸不溶性灰分含量。

目前，顯微模式識別、化學(xué)指紋圖譜、化學(xué)計量法等方法用于藥材質(zhì)量的評價[15-17]?；疑P(guān)聯(lián)度分析是灰色系統(tǒng)理論的基本內(nèi)容，本研究基于“中藥成分與中藥質(zhì)量是一種灰色關(guān)系”的認(rèn)識，建立了評價黃管秦艽質(zhì)量的灰色關(guān)聯(lián)度分析模型。灰色關(guān)聯(lián)度評價法作為合理評價不同來源的中藥的有效手段，可用于研究多成分之間互相影響、互相制約的問題[18]。因此，本研究以黃管秦艽中醇浸出物、龍膽苦苷、環(huán)烯醚萜苷、總灰分倒數(shù)、酸不溶性灰分倒數(shù)為評價指標(biāo)，計算相對關(guān)聯(lián)度，對不同產(chǎn)地黃管秦艽質(zhì)量進(jìn)行了評價，比較客觀地體現(xiàn)了黃管秦艽的內(nèi)在質(zhì)量，可為黃管秦艽的質(zhì)量評價提供新思路。

黃管秦艽為甘肅藥材資源，其分布廣泛，且黃管秦艽為藥典規(guī)定秦艽的近緣種，本試驗結(jié)果可為新資源的開發(fā)利用提供一定的基礎(chǔ)。

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Quality Evaluation of Gentiana officinalis H.Smith. from Different Producing Areas of Gansu Province by Grey Incidence Degree Method

WANG Jie1, ZHU Shun-juan1, FAN Qin2, YANG Li1,XIA Peng-fei3, WANG Yin-quan4, ZHAO Lei1,2,5
(1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Key Laboratory for Traditional Chinese (Tibetan) Medicine Chemistry and Quality Control of Gansu University, Lanzhou 730000, China; 3. Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology of TCM of Gansu Province, Lanzhou 730000, China; 4. Northwest Collaborative Innovation Center for Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 5. Cultivation Base for Key Laboratory of Chinese Medicine Quality and Standard of Gansu Province, Lanzhou 730000, China)

ObjectiveTo establish the degree of gray incidence model of Gentiana officinalis H.Smith. from differenct producing areas of Gansu Province and conduct quality evaluation.MethodsTen samples of Gentiana officinalis H.Smith. from different producing areas in Gansu Province were collected and the gentiopicroside, total iridoid gycoside, extractives, total ash, acid-insoluble ash content of Gentiana officinalis H.Smith were tested. The quality evaluation of grey incidence model of Gentiana officinalis H.Smith. was established by grey incidence model.ResultsThe relative correlation degrees of all evaluation items were in the range of 0.394–0.652. Among them, the relative correlation degree of samples from 6 producint areas were greater than 0.50, which had high quality evaluation. The relative correlation degrees of the rest samples from other producing areas were less than 0.50, which had low quality evaluation. The sample of Gentiana officinalis H.Smith. from Zhuoni County Liulin Township Observatory had the most highly correlated with the optimal reference sequence (0.652) and so the best in quality; The sample of Gentiana officinalis H.Smith. from Zhang County Sancha Town Langwang Ditch had the most lowly correlated with the optimal reference sequence (0.394) and so the worst in quality.ConclusionThis method and quality evaluation model can be used for the quality evaluation for Gentiana officinalis H.Smith., which can provide acertain experimental basis for the development and utilization of new resources.

Gentiana officinalis H.Smith.; grey incidence degree method; quality evaluation

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.017

R284.1

A

1005-5304(2017)03-0069-06

2016-04-29）

（

2016-06-20；編輯：陳靜）

國家自然科學(xué)基金（81660577）；甘肅省屬高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項基金（2011-06）；甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室自主基金項目（ZDSYS-ZZ-2015-001）；西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心重點項目（2015-05）；甘肅中醫(yī)學(xué)院中青年科研基金項目（ZQ-2014-2）

趙磊，E-mail：zzyhx@gszy.edu.cn