超微量蛋白分析儀在微量樹突細胞中ERK蛋白及其磷酸化修飾檢測中的應用研究*

任怡然 程雪蓮 梁昊岳 白 楊 楊晚竹 于文穎 陳 婷 付偉超 郭 丹*

超微量蛋白分析儀在微量樹突細胞中ERK蛋白及其磷酸化修飾檢測中的應用研究*

任怡然①程雪蓮①梁昊岳①白 楊①楊晚竹①于文穎①陳 婷①付偉超①郭 丹①*

目的：建立利用超微量蛋白分析儀檢測微量細胞樣品中低豐度細胞外調節蛋白激酶(ERK)及其磷酸化修飾的應用方法，為在科研工作中應用該儀器提供實驗依據。方法：采用配制樣品溶液，上樣、分離、固定、免疫雜交和軟件定量等實驗步驟，進行化學發光檢測，對不同數目樹突狀細胞中ERK蛋白及其磷酸化修飾的定性及定量結果進行分析。結果：超微量蛋白分析儀能夠檢測到低至2000個細胞中的目的蛋白并獲得定量數據，該儀器還能夠有效分辨出20000個細胞中ERK蛋白不同形式的磷酸化修飾。結論：超微量蛋白分析儀有效完成了對低豐度細胞外調節蛋白以及蛋白質翻譯后修飾檢測。

超微量蛋白分析儀；微量細胞；翻譯后修飾；定量；化學發光

[First-author’s address]State Key Laboratory of Experiment Hematology, Institute of Hematology, Hospital of Blood Disease, Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China.

疾病標志物往往是那些生物體內的低豐度蛋白，傳統的蛋白分析技術所用的蛋白量通常很大，所得結果的分辨率及重復性很有限。超微量蛋白分析儀是一種新的蛋白質分析系統，使用超微量蛋白分析儀的納米技術的超微量蛋白免疫分析(nanofluidic proteomic immunoassay，NIA)方法可做到對少量樣品、低豐度蛋白以及蛋白質翻譯后修飾的定量研究[1-4]。超微量蛋白分析儀所用樣本量少，根據等電聚焦原理分離蛋白質，能夠靈敏地鑒定出低豐度靶蛋白，并且能夠得到大量數據，定量地分析結果[4-6]。對于蛋白質的研究而言，如何更加靈敏、快速、準確地獲得相關蛋白質的定量信息，對日后蛋白質研究發展成果向臨床醫療轉化具有重要的意義。

細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated Protein kinase，ERK)1/2是絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族中一條重要信號通路，能夠被多種細胞外刺激激活，調控細胞生長、增殖、分化以及死亡[7-11]。本研究以樹突狀細胞為樣本，研究不同細胞數目的樣品中ERK，以及采用脂多糖刺激后ERK蛋白產生磷酸化修飾的定性及定量信息，為微量細胞中低豐度蛋白質及蛋白質翻譯后修飾研究提供更加全面的幫助和支持。

1 超微量蛋白分析儀原理

自然界存在的天然蛋白質分子帶有電荷，而蛋白質的翻譯后修飾，如磷酸化、乙酰化、甲基化等會改變蛋白質的電荷。當蛋白質所處溶液的pH值不等于其等電點時蛋白質帶有電荷，并會在電場中移動；當蛋白質處于穩定的pH值梯度中，即pH值等于等電點時蛋白質凈電荷為0，在電場中不再移動，因此通過等電點分離，可以有效區分同一蛋白質的不同異構體及不同修飾。基于此原理，超微量蛋白分析儀運行可以分為上樣、分離、固定、免疫雜交和定量5個步驟。將樣品與兩性電解質、熒光pH值指示劑混合，進行毛細管電泳，蛋白質會根據等電點在毛細管里等電聚焦，遷移到固定位置后由紫外光線激活毛細管壁的化學交聯作用，將蛋白質捕獲，再用高靈敏度一抗、二抗進行免疫雜交，在顯色液作用下檢測到化學發光信號值，獲得定量信息[3，6，12]。

2 超微量蛋白分析儀的應用

2.1 設備與材料

(1)采用Nanopro 1000超微量蛋白分析儀(美國ProteinSimple公司)；384孔板(美國ProteinSimple公司)；細胞裂解液Bicine/CHAPS Lysis Buffer(美國ProteinSimple公司)；熒光指示劑PI Ladder 3(美國ProteinSimple公司)；蛋白酶抑制劑(美國ProteinSimple公司)；兩性電解質G3 premix(美國ProteinSimple公司)；抗體稀釋液(美國ProteinSimple公司)。

(2)樹突狀細胞(DC細胞)、一抗anti-ERK1/2抗體(ml)、一抗(抗磷酸)ERK1/2抗體[細胞信號技術(cell signaling technology，CST)]以及二抗(抗磷酸) HRP(細胞生物科學)均來自美國CST公司。

2.2 實驗流程

2.2.1 配制上樣溶液

不同樣品細胞數目分別為500個、1000個、2000個、4000個和8000個，陰性對照不加細胞，陽性對照加入20000個細胞，結合ERK1/2抗體。將脂多糖刺激的細胞分為兩組，每組細胞數目為20000個，一組與ERK1/2抗體孵育，一組與抗磷酸ERK1/2抗體孵育。上樣溶液配制為下述步驟。

(1)通過流式細胞儀計數，直接將一定數目細胞分選到384孔板內，在384孔板內加入10 μl Bicine/ CHAPS裂解緩沖液裂解，冰上裂解30 min。

(2)將G3 premix與PI Ladder 3按44 μl∶1 μl的比例配成預混液，渦旋振蕩15 s；將細胞裂解液與預混液按1∶3混合。同時加入蛋白酶抑制劑，使終濃度為1×磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline，PBS)。

(3)按1∶50將一抗與抗體稀釋液混勻，總體積50 μl，按1∶100將二抗與抗體稀釋液混勻，總體積50 μl；按1∶1將底物發光液A與B混勻，總體積50 μl。

(4)將含有樣品的混合液、一抗稀釋液、二抗稀釋液以及底物發光液加入384孔板不同排。樣品每孔5 μl，其他每孔6 μl。

(5)加樣后將384孔板置于4 ℃離心機，2500 r/min離心5 min，須保證孔板里無氣泡。離心后將孔板置于冰上等待上機。

2.2.2 上機設置及實驗結果分析

(1)打開Compass軟件，在Assay界面設置板布局：A排為樣品，B排為一抗稀釋液，C排為二抗稀釋液，F排為底物發光液；設置蛋白質分離時間為40 min；一抗孵育時間為2 h，二抗孵育時間為1 h；設置曝光時間分別為30 s、60 s、120 s、240 s、480 s和960 s；附件設備：清洗瓶裝滿超純水，廢液瓶倒空；實驗試劑盒耗材：放置毛細管盒，儀器清洗液、陽極液和陰極液；將384孔板放入儀器；運行程序。

(2)使用Compass軟件分析實驗結果。

3 實驗結果

3.1 毛細管中蛋白分離情況監測

超微量蛋白分析儀Compass軟件可實時監控蛋白質在毛細管中的分離情況。該實驗根據ERK等電點，使用兩性電解質G3 premix，其分離范圍為等電點5～8，熒光指示劑PI Ladder 3會根據等電點分離，在等電點4.9、6.0、6.4、7.0和7.3處有熒光標志(如圖1所示)。

圖1 毛細管中蛋白分離情況示圖

圖中每一橫排代表一個樣品，隨著分離時間的增加，熒光標志也會分離在毛細管不同位置以實時監測蛋白質分離情況。實驗中ERK蛋白的等電點為5～7，如果能看到熒光指示劑4.9和7.3在視野內則能說明蛋白也在此區間內。選取5個樣品為例，由圖1中A觀察顯示，每個樣品中5個不同等電點的熒光標志均在視野內顯示，表示蛋白質在毛細管中分離情況正常。圖1中B顯示的是不同時間監測窗口中熒光標志的變化，分別為5 min時和10 min時PI Ladder 3在毛線管中的分離狀態。在5 min時熒光指示劑彌漫在整個毛細管中，隨著時間的增加，而10 min時熒光指示劑已經慢慢等電聚焦。整個分離時間為40 min，最終熒光指示劑在毛細管中的分布會形成圖1A所示。

3.2 不同細胞數目樣品結果

(1)當細胞數目樣品為8000個細胞時可以看到清晰的蛋白峰，為4000個細胞時仍可以看到蛋白峰，但峰型較小。ERK1和ERK2蛋白質的熒光信號值分別為19.5和105.4，ERK2的S/N＞10，為19.3。2000個細胞時，ERK1和ERK2的熒光信號值分別為5.9和27.7，ERK1和ERK2的S/N＜10，但軟件仍可以檢測到蛋白峰。1000個細胞組和500個細胞時蛋白峰與背景噪音不可區分，軟件不可檢出。對照組結果，正對照含有20000個細胞，蛋白峰圖清晰且熒光信號值強，ERK1和ERK2蛋白質的熒光信號值分別為1262.8和3845.4，ERK1和ERK2的S/N遠＞10，為107.3和436.5。但由于細胞數目多，除了目的蛋白，會出現少量雜蛋白峰。負對照組無細胞，可以看到圖中無任何信號。不同細胞數目樣品的蛋白峰如圖2所示。

圖2 不同細胞數目樣品中ERK蛋白峰示圖

(2)ERK1和ERK2的熒光信號值分別為130.8和470.7且信噪比(S/N)均＞10，分別為23.6和85.9，表明該結果有意義。可以根據蛋白峰面積信息對目的蛋白進行定量研究，不同細胞數目樣品的定量信息見表1。

表1 不同細胞數目樣品中ERK蛋白定量信息

(3)Nanopro 1000超微量蛋白分析儀相當于更加靈敏和精準的微量western，該系統可以生成模擬western結果的泳道圖，如圖3所示。

圖3 不同細胞數目樣品中目的蛋白的模擬western泳道圖

圖3 顯示的是不同細胞數目樣品中ERK蛋白的模擬western泳道圖，該結果與蛋白峰圖顯示結果一致，正對照組有明顯的ERK1、ERK2蛋白條帶以及少量雜蛋白。負對照無條帶。在8000個細胞時顯示明顯的ERK1、ERK2蛋白條帶。在4000個細胞時仍可見ERK1、ERK2條帶，但是顏色略淺，其他細胞數目樣品條帶不可見。

3.3 ERK蛋白磷酸化修飾結果

(1)使用總ERK抗體去結合樣品時，ERK1、ERK2、pERK1、pERK2、ppERK1以及ppERK2都有清晰的蛋白峰。用ERK蛋白磷酸化抗體結合樣品時，峰圖中只顯示幾個有磷酸化修飾的峰。結果表明，nanopro 1000超微量蛋白分析儀能夠靈敏的檢測出蛋白質翻譯后修飾，將有修飾的蛋白與未修飾蛋白清晰的區分開，樣品磷酸化修飾的結果如圖4所示。

圖4 目的蛋白磷酸化修飾峰示圖

表2 目的蛋白磷酸化修飾定量信息

(2)ERK蛋白磷酸化修飾定量結果顯示，所有峰的S/N均＞10。峰面積信息也可以作為定量研究的依據，見表2。

(3)目的蛋白磷酸化修飾模擬western泳道圖結果與蛋白峰圖顯示結果一致，在總蛋白樣品中以及磷酸化修飾樣品中可見ERK蛋白及其各種磷酸化修飾的條帶，可以進行定性觀察，如圖5所示。

圖5 目的蛋白磷酸化修飾模擬western泳道圖

4 討論

運用Nanopro 1000超微量蛋白分析儀對不同數目的細胞樣品以及目的蛋白翻譯后修飾進行研究，證明該儀器能夠對低豐度蛋白定性及定量，并且適用于蛋白質翻譯后修飾研究。該儀器對信號通路的研究提供了新的視角[13-14]。隨著蛋白質研究的不斷深入，Nanopro 1000超微量蛋白分析儀也應用于臨床研究。有文獻報道，使用Nanopro 1000超微量蛋白分析儀研究20例早期結直腸癌患者術后缺血組織樣本中與癌癥相關生物標志物磷酸化修飾的定量結果，發現與正常組織相比，ERK1/2非磷酸化增多、AKT磷酸化增多、MEK1/2磷酸化增多[5]。Tikhanovich等[15]報道，使用Nanopro 1000超微量蛋白分析儀對foxo3蛋白不同形式的翻譯后修飾進行定量，研究丙型肝炎病毒和酒精共同作用誘導產生的foxo3翻譯后修飾這一復雜模型是如何導致丙肝發病，有效地為臨床檢測提供科學依據。

5 結語

隨著超微量蛋白分析技術的發展，該技術在科學研究領域的應用更加廣闊，可成為臨床檢測的重要手段。

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Application study of Nanopro 1000 in the detection of ERK protein in trace dendritic cells and its phosphorylation product/

REN Yi-ran, CHENG Xue-lian, LIANG Hao-yue, et al//China Medical Equipment,2017,14(2):131-134.

Objective:To understand the principles of Ultramicro-protein analyzer system and provide a reference for using it by analyzing low abundance ERK in trace dendritic cell and its phosphorylation product. And to provide application experience of this equipment in science and research work.Methods:The qualitative and quantitative results of ERK and its phosphorylation product in different numbers of dendritic cells were analyzed by means of preparation of sample, such as solution, instrument operation and software analysis.Result:Ultramicro protein analyzer system can detect target protein in as low as 2000 cells and obtain quantitative data. The instrument also can efficiently distinguish different phosphorylation modification form of ERK in 20000 cells.Conclusion:This system is very helpful for the study of low abundance extracellular regulation protein and post-translational modification of proteins.

Nanopro 1000 system; Trace cell; Post-translational modification; Quantification; Chemiluminescence

1672-8270(2017)02-0131-04

R197.39

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.02.039

2016-11-04

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(青年項目)(15JCQNJC10300)“G-CSF動員造血干祖細胞的分子機制研究”

①中國醫學科學院血液病醫院血液學研究所 實驗血液學國家重點實驗室 天津 300020

*通訊作者：guodan@ihcams.ac.cn

任怡然,女,(1990- ),碩士研究生。技師。中國醫學科學院血液病醫院血液學研究所 實驗血液學國家重點實驗室，研究方向：基因與蛋白相關儀器的應用。