基質(zhì)金屬蛋白酶-1基因多態(tài)性對漢族人群牙種植早期失敗的影響

何世林,徐 鵬,白 石

(1.重慶市永川區(qū)婦幼保健院口腔科 402160；2.重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院種植科 400015)

基質(zhì)金屬蛋白酶-1基因多態(tài)性對漢族人群牙種植早期失敗的影響

何世林1,徐 鵬2△,白 石2

(1.重慶市永川區(qū)婦幼保健院口腔科 402160；2.重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院種植科 400015)

目的 從遺傳學的角度探討基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)的基因多態(tài)性是否與種植體早期失敗有關(guān)。方法 采用病例對照的臨床試驗設(shè)計方法，將選取的53例不吸煙、無牙周炎的漢族種植患者根據(jù)有無種植體早期失敗(1個月內(nèi))分為失敗種植體組和成功種植體組；同時收集所有患者的靜脈血提取DNA；采用聚合酶鏈式反應(yīng)和限制性片段長度多態(tài)性方法對MMP-1-1607位點進行基因型的測定。結(jié)果 攜帶MMP-1-1607 基因型1G/2G雜合子的患者其種植體早期失敗的發(fā)生率明顯高于攜帶MMP-1-1607基因型1G/1G純合子患者。多元Logistic回歸分析結(jié)果顯示：MMP-1-1607 1G/2G 基因型相對于MMP-1-1607 1G/1G基因型的比值比是13．894(P<0.05)。結(jié)論 MMP-1-1607 1G/2G 基因型和種植體早期失敗有相關(guān)性。

牙種植體；基質(zhì)金屬蛋白酶1；遺傳學研究；基因多態(tài)性

口腔種植失敗主要分為早期和晚期(指承擔咬合力以后)兩類[1-2]。早期失敗的主要原因一般是吸煙、年齡、系統(tǒng)疾病、骨的質(zhì)量和數(shù)量、外科損傷和手術(shù)中感染[3-4]。而晚期失敗主要原因是種植體周圍炎和咬合力量過大[5]。種植失敗的發(fā)生并不是平均分布的，主要發(fā)生在高危的人群，基因的表現(xiàn)型會影響骨結(jié)合，因此種植的失敗和基因的表現(xiàn)相關(guān)[6]。

基因多態(tài)性是指在生物種群中，同時和經(jīng)常出現(xiàn)兩種或多種等位基因。一般基因多態(tài)性分3大類：DNA片段長度多態(tài)性，DNA重復序列多態(tài)性，單核苷酸多態(tài)性(SNP)。而單核苷酸多態(tài)性是最常見的一種，占多態(tài)性的90%。基質(zhì)金屬蛋白酶類(MMPs)有多種生理作用，能調(diào)節(jié)各種細胞的行為，如血管生成、細胞增殖、凋亡等。MMP-1是間質(zhì)膠原酶中表達最為普遍的一種內(nèi)源性肽酶，主要作用是降解壞死組織的膠原纖維[7]。正常情況下在組織中表達比較低，但在生長因子和炎癥因子的刺激下，其表達會上調(diào)。有大量文獻證明，MMPs參與了許多基質(zhì)炎癥的疾病。MMP-1基因啟動子-1607位點插入一個鳥嘌呤G使序列由5-CGAT-3變?yōu)?-CGGAT-3，導致 1G/2G單核苷酸多態(tài)性。

某些遺傳因素的存在能影響宿主對微生物的反應(yīng)，自身的免疫應(yīng)答反應(yīng)能決定疾病的嚴重程度，因此宿主的易感性也是重要因素。有研究表明，在漢族人群中MMP-1基因啟動子區(qū)-16071G/2G的基因多態(tài)性與牙周炎發(fā)生發(fā)展存在著相關(guān)性[8-9]。 種植體周圍炎和牙周炎有相似性，但在炎癥進展速度和細胞組成方面仍有差別[10]。研究表明MMP-1基因多態(tài)性對種植早期失敗有影響。Santos等[7]在種植體失敗的病例中發(fā)現(xiàn)，MMP-1-1607 2G等位基因可能與種植體失敗有關(guān)。目前有關(guān)MMP-1基因多態(tài)性在漢族人群中對成功種植早期失敗的影響，還少見相關(guān)報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年3月至2013年3月在重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院種植科接受種植義齒修復的患者，共53例。其中，男31例，女22例，均為漢族。年齡21～62歲。患者的病史和臨床檢查包括：年齡、性別、民族、植入部位、骨質(zhì)量、種植體類型(奧齒泰osstem和賽弗 xive)、術(shù)中有無穿孔、術(shù)后有無感染、鄰牙牙周狀況。系統(tǒng)病史：血液病史、牙周病家族史、高血壓、心臟病、糖尿病、甲狀腺病、消化道疾病、女性患者的月經(jīng)狀況。其中所有納入患者均沒有吸煙史和牙周炎。種植成功標準：排除患者初期種植體穩(wěn)定性不足35N.cm的;口腔內(nèi)植入奧齒泰osstem或賽弗xive，按1個月內(nèi)未出現(xiàn)種植體松動、脫落(沒有負載)；同時種植修復后一年正常行使功能。種植失敗組26例，男18例，女8例。成功種植體組27例，男13例，女14例。

表1 不同基因型在兩組中的分布[n(%)]

1.2 樣本采集和DNA提取 種植手術(shù)前，抽取患者的靜脈血，采用TIANamp Blood DNA Kit(中國Tiangen公司)提取基因組DNA。

1.3 基因多態(tài)性分析

1.3.1 PCR擴增MMP-1基因啟動子區(qū)域 使用兩對引物分別擴增MMP-1基因啟動子區(qū)域，引物序列如下：引物MMP-1F，5′-GTT ATG CCA CTT AGA TGA GG-3′和引物MMP-1R，5′-TTC CTC CCC TTA TGG ATT CC-3′。 上述引物均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系終體積25μL，其中含10×PCR buffer 2.5μL，樣本DNA 2μL(約50～100 ng)，LATaq DNA聚合酶(大連TaKaRa公司)1 U；dNTP、MgCl2終濃度分別為0.2、1.5 mmol/L，引物終濃度為0.24 μmol/L。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94℃ 30 s，59℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循環(huán)32次；最后 72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠10 V/cm電泳10 min，確定擴增片段的特異性。

1.3.2 PCR擴增產(chǎn)物的純化 利用蝦堿性磷酸酶(SAP，1 U/μL，美國Promega公司)和核酸外切酶Ⅰ(ExoⅠ，5 U/μL，大連TaKaRa公司)純化PCR擴增產(chǎn)物。在每5微升的PCR產(chǎn)物中分別加入SAP和ExoⅠ各0.75 μL，37℃ 30 min酶切反應(yīng)，80 ℃ 15 min酶失活。

1.3.3 PCR純化產(chǎn)物的直接測序 使用BigDye terminator v3.1 sequencing Kit(美國ABI公司)試劑進行雙向測序反應(yīng),測序引物為上述的擴增引物MMP-1F、MMP-1R。采用乙醇/醋酸鈉法純化測序反應(yīng)的擴增產(chǎn)物，然后在ABI 3130基因測序儀上檢測分析結(jié)果。根據(jù)測序結(jié)果，判定MMP-1基因的基因型。

1.4 統(tǒng)計學處理 所有的分析均用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理。兩組比較采用的Fisher exact test；相關(guān)因素的相對危險度分析用Logistic回歸分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 種植體周圍炎組和成功種植體組基因型分布 種植體周圍炎組中發(fā)現(xiàn)2G等位基因的比例明顯高于成功種植體組。其中成功種植體組中1G/1G基因型為17位患者(占所有患者的比例為63%)，2G/2G基因型為9位患者(占比33%)。種植體周圍炎組中1G/1G基因型為0位患者(占比0%)，2G/2G基因型為5位患者(占比14%)。

2.2 不同基因型在對照組和試驗組中的分布 在種植失敗組中出現(xiàn)1G/2G或者 2G/2G基因類型的概率是比較高。見表1。

2.3 相關(guān)因素多元Logistic回歸分析 年齡、絕經(jīng)與否、骨質(zhì)是否4類3個影響因素的比值比分別為0.968、0.845、0.724，相應(yīng)的P值為0.720、0.521、0.652。

3 討 論

種植植入前備洞是一種潛在的骨損傷，從而機體對損傷會有炎癥反應(yīng)。不同細胞(如中性粒細胞，巨噬細胞，T、B淋巴細胞，角質(zhì)形成細胞，內(nèi)皮細胞，成纖維細胞，破骨細胞和成骨細胞等)的異常免疫應(yīng)答，都可以破壞種植體周圍骨組織。在炎癥情況下，炎癥細胞會釋放出炎癥信號因子。MMPs是一組含Zn+的能夠降解細胞外間質(zhì)的蛋白酶。MMP-1是間質(zhì)膠原酶中表達最為廣泛的一種內(nèi)源性肽酶，主要作用是降解壞死組織的膠原纖維(主要是Ⅰ型膠原)，并促進組織重建[6]。正常情況下在組織中表達比較低，但在生長因子和炎癥因子等內(nèi)源性因素的刺激下，其表達會上調(diào)。因此，MMP-1在炎癥情況下會對種植體周圍組織造成破壞。特別是早期，種植體在初期機械穩(wěn)定性下降的情況下，而骨結(jié)合沒有完全形成。此時如果患者的MMP-1表達過多，將對種植體周圍組織產(chǎn)生過多的破壞，導致種植體早期失敗。同時MMP-1表達過多的患者即使種植體形成骨結(jié)合，也更容易患種植體周圍炎[11]。

國內(nèi)林映荷等[12]對白細胞介素(IL)-1的基因多態(tài)性和種植體周圍炎的相關(guān)性進行了研究，發(fā)現(xiàn)IL-1β+3954基因型Ⅰ/Ⅱ雜合子和種植體周圍炎的發(fā)病相關(guān)。但是研究均納入了吸煙患者，由于長期吸煙者影響牙周健康和種植體的長期效果，故對研究結(jié)果有一定的影響。本研究所有納入患者均為不吸煙患者，保證了研究的準確性。

Santos等[7]在巴西拉丁裔患者中，種植體失敗的病例中發(fā)現(xiàn)2G等位基因的比例 (50%)明顯高于對照組 (25%)。同時，MMP-1-519等位基因如果由A替換為G，則MMP-1的表達會增加。但研究發(fā)現(xiàn)該等位基因的替換對種植早期失敗沒有影響[10]。而本研究結(jié)果顯示，在漢族人群中，失敗種植體組中發(fā)現(xiàn)2G等位基因的比例 (60%)也明顯高于成功種植體組(35%)，和Santos等[7]的結(jié)果一致。

種植體失敗的原因一般和牙周病息息相關(guān)。畢竟種植體周圍炎和牙周炎有相似的病理過程，而且種植體周圍炎是種植體失敗的重要原因[13]。通過基因多態(tài)性的篩查能確定種植可能失敗的高風險人群，有助于適當?shù)男g(shù)前預(yù)防和方案選擇，以此提高種植的成功率。但這種研究時間不長，國內(nèi)外研究的病例數(shù)量都偏少。而且影響牙種植體的局部因素和全身因素較多，仍然缺乏更多的循證醫(yī)學支持。因而還需要更多研究來證實MMP-1基因多態(tài)性在漢族人群中和種植體早期失敗的相關(guān)性。

[1]Esposito M,Hirsch J,Lekholm U,et al.Differential diagnosis and treatment strategies for biologic complications and failing oval implants:A review of the literature[J].Int J Oral Maxillofac Implants,1999,14(4):473-490.

[2]Ganeles J,Wismeijer D.Early and immediately restored and loaded dental implants for single-tooth and partial-arch applications[J].Int J Oral Maxillofac Implants,2004,19(suppl):92-102.

[3]Moy PK,Medina D,Shetty V,et al.Dental implant failure rates and associated risk factors[J].Int J Oral Maxillofac Implants,2005,20(4):569-577.

[4]Gruica B,Wang HY,Lang NP,et al.Impact of IL-1 genotype and smoking status on the prognosis of osseointegrated implants[J].Clin Oral Implants Res,2004,15(4):393-400.

[5]Hutton JE,Heath MR,Chai JY,et al.Factors related to success and failure rates at 3-year follow-up in a multicenter study of overdentures supported by Brnemark implants[J].Int J Oral Maxillofac Implants,1995,10(1):33-42.

[6]Yamada Y,Ando F,Niino N,et al.Association of a polymorphism of the matrix metalloproteinase-1 gene with bone mineral density[J].Matrix Biology,2002,21(5):389-392.

[7]Santos MC,Campos MI,Souza AP,et al.Analysis of MMP-1 and MMP-9 promoter polymorphisms in early osseointegrated implant failure[J].Int J Oral Maxillofac Implants,2004,19(1):38-43.

[8]Cao Z,Li C,Zhu G.MMP-1 promoter gene polymorphism and susceptibility to chronic periodontitis in a Chinese population[J].Tissue Antigens,2006,68(1):38-43.

[9]Lang NP,Berglundh T.Working Grp 4 Seventh European Wor.Periimplant diseases:where are we now?- Consensus of the Seventh European Workshop on Periodontology[J].J Clin Periodontol,2011,38(11):178-181.

[10]Yamada Y,Ando F,Niino N,et al.Association of a polymorphism of the matrix metalloproteinase-1 gene with bone mineral density[J].Matrix Biology,2002,21(5):389-392.

[11]Irshad M,Scheres N.Cytokine and matrix metalloproteinase expression in fibroblasts from peri-implantitis lesions in response to viable Porphyromonas gingivalis[J].J Periodontal Res,2013,48(5):647-656.

[12]林映荷，管東華，陸軒，等．白細胞介素-1基因多態(tài)性和種植體周圍炎的相關(guān)研究[J]．實用口腔醫(yī)學雜志，2008，24(4)：586-589．

[13]Silveira VR,Pigossi SC,Scarel-Caminaga RM,et al.Analysis of polymorphisms in interleukin 10,NOS2A,and ESR2 genes in chronic and aggressire periodontitis[J].Braz Oral Res,2016,30(1):e105.

The relationship between MMP-1 genetic polymorphisms and dental implant early failure in Chinese Han nationality

HeShilin1,XuPeng2△,BaiShi2

(1.DepartmentofStomatology,MaternalandChildHealthHospitalofYongchuanDistrict,Chongqing402160,China;2.DepartmentofImplantology,theAffiliatedStomatologyHospitalofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400015，China)

Objective To make clear the relationship between the genetic polymorphism of MMP-1 and implant early failure．Methods We conducted a case control study,53 cases patients (no smoking history and without periodontitis)who have underwent dental implant were divided into experimental group(with dental implant failure)and control group(with dental implant success)according to early failure of dental implant (within one month).DNA of 53 patients in Han nationality were extracted by using Chelex-100 method and polymorphisms of the mmp-1-1607 gene were detected by restriction fragment length polymorphism after polymerase chain reactions.Results Patients with MMP-1-1607(1G/2G)genotype exhibited a significantly higher occurrence of implant early failure than those with MMP-1-1607(1G/1G)gene type(P<0.05)．The OR of the 1G/2G versus the 1G/1G of the MMP-1-1607 genotype was 13．894(P<0．05).Conclusion MMP-1-1607(1G/2G)genotype is associated with implant early failure．

dental implants;matrix metalloproteinase 1;genetic research;polymorphism

何世林(1981-)，主治醫(yī)生，本科，主要從事口腔全科的研究。△

，E-mail:244920288@qq.com。

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.05.019

R782.12

A

1671-8348(2017)05-0635-03

2016-06-21

2016-08-19)