肺癌細胞系中KEAP1與NRF2相互作用區域基因突變的檢測*

周建平，李志芳，梁笠軒，徐 德

(1.攀枝花學院醫學院，四川攀枝花 617000；2.攀枝花學院附屬醫院，四川攀枝花 617000)

肺癌細胞系中KEAP1與NRF2相互作用區域基因突變的檢測*

周建平1,2，李志芳1，梁笠軒1，徐 德2

(1.攀枝花學院醫學院，四川攀枝花 617000；2.攀枝花學院附屬醫院，四川攀枝花 617000)

目的 檢測非小細胞肺癌細胞系中KEAP1及NF-E2相關因子2(NRF2)相互作用結構域基因的突變情況。方法 以6個非小細胞肺癌細胞系為材料，檢測KEAP1基因的第2至第6外顯子及NRF2的DLG和ETGE基序編碼序列的堿基序列突變情況，推測相應的氨基酸序列變異。同時檢測供試細胞系的細胞內活性氧濃度，分析目標序列突變對肺癌細胞抗氧化系統的影響。結果 在KEAP1基因第4外顯子區域發現4個所有癌細胞系共有的突變,部分細胞系的第3外顯子區域還存在錯義突變，所有NRF2-ETGE基序編碼序列均存在多重遺傳變異。活性氧檢測發現供試細胞系活性氧濃度均高于肺胚細胞。結論 KEAP1和NRF2基因相互作用結構域的基因突變在供試細胞系內普遍存在，非小細胞肺癌細胞系對細胞內活性氧濃度失去調控能力是普遍現象。

NF-E2相關因子2；非小細胞肺癌；KEAP1

NF-E2相關因子2(NRF2)是細胞氧化應激反應中的關鍵轉錄因子，通過與抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)相互作用，調控抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達[1]。NRF2的轉錄活性受胞漿蛋白(kelch-like ECH-associated protein-1，KEAP1)的負調控[1]。KEAP1通過其BTB區結合Cul3、Kelch區結合NRF2，將NRF2連接到E3復合體，使泛素從E3轉移到NRF2的賴氨酸殘基(位于ETGE基序、DLG基序之間)，泛素化的NRF2被迅速降解[2-3]。發生氧化應激時，KEAP1特定的半胱氨酸殘基被氧化修飾，導致DLG基序與KEAP1的親和力減弱而分離，從而使NRF2免于泛素化降解。

研究發現，KEAP1和NRF2的體細胞突變常見于肺癌患者體內。KEAP1和NRF2的表達水平影響著非小細胞肺癌患者的化學治療效果和無進展生存期[4-5]。約15%的肺癌患者攜帶KEAP1基因的體細胞突變[6]，從而使得KEAP1失去了對NRF2活性的負調控能力。同時，約10%的肺癌患者攜帶NRF2基因的體細胞變異[1]，使其能避免被KEAP1誘導降解，從而始終保持高度的NRF2轉錄因子活性。上述體細胞突變的存在，使得肺癌細胞能夠持續大量表達抗氧化蛋白和解毒酶類，是導致癌細胞耐藥的原因之一[7-8]。本研究以肺癌研究中常用的非小細胞肺癌細胞系為材料，對其核基因組中的KEAP1-Kelch區和NRF2-ETGE基序、NRF2-DLG基序的編碼區段進行了PCR擴增和測序，以檢測在這些常用肺癌研究材料中是否存在上述基因的突變，并結合細胞內活性氧水平的檢測，分析了上述非小細胞肺癌細胞系在肺癌研究中的適用性。

1 材料與方法

1.1 肺癌細胞的準備 非小細胞肺癌細胞系PC9、HCC827、NCI-H1975、NCI-H1299、NCI-H460、NCI-H661和肺胚細胞系WI-38均購自中國科學院細胞庫。凍存的細胞在37 ℃快速解凍后，1 000 r/min離心 5 min，用RPMI 1640基礎培養基清洗1～2次，并重懸后再離心，獲得的細胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基，37 ℃，5% CO2培養箱內培養，每天換1次培養基，待細胞80%粘連時收獲細胞。

表1 PCR擴增采用的正反向引物序列

1.2 DNA提取 采用天根快速DNA提取檢測試劑盒，(KG203)按說明書步驟進行DNA提取。首先取約5 mg細胞于1.5 mL Eppendorf管，加入100 μL緩沖液B1，用研磨杵(天根目錄號：WL046)反復研磨30 s至樣品與緩沖液B1混勻，再加入100 μL緩沖液B2，振蕩混勻，12 000 r/min離心2 min，吸取其上清液直接用于PCR。

1.3 PCR擴增及產物測序 采用生工PCR擴增試劑盒(B532493)，按說明書進行PCR擴增。PCR反應體系包括：模板、正反向引物、PCR Buffer (含Mg2+)、Pfu DNA聚合酶、dNTP。反應循環參數：95 ℃ 2 min進行DNA變性；95 ℃ 20 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，循環40次；最后于72 ℃延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳20 min后，于Bio-Rad熒光成像系統檢測，目標產物條帶切膠回收，獲得30～40 μL的純化產物。PCR純化產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，得到測序圖譜及序列。PCR擴增采用的正反向引物序列見表1。

1.4 基因突變的檢測 核酸序列位置編碼參考報道在美國國家生物技術信息中心網站(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的人類基因參考序列:KEAP1 (NM_012289.3)、NRF2(NM_006164.4)。根據與參考序列比對結果,確定檢測序列是否發生堿基突變，并用lasergene軟件的MegAlign程序預測其對應的蛋白質氨基酸序列改變。

1.5 活性氧濃度檢測 采用碧云天活性氧檢測試劑盒(S0033),按照說明書步驟處理供試的肺癌細胞。細胞的準備如1.1所述，待細胞長滿后調整細胞濃度為5×104/mL，按實驗分組接種于48孔培養板，每孔300 μL，37 ℃，5% CO2培養箱內培養24 h。觀察細胞80%粘連時，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗每孔細胞，加入DHE熒光染料，37 ℃下孵育30 min后，分別于熒光顯微鏡和熒光發光分析儀(Thermo Scientific)下拍照及檢測。

2 結 果

2.1 KEAP1的Kelch結構域對應外顯子基因突變分析 測序分析了KEAP1基因第2到第6外顯子區域的DNA序列,發現第3和第4外顯子區域存在錯義突變和同義突變(表2)。從錯義突變導致的氨基酸改變可以發現，所有供試細胞系在KEAP1第4外顯子區域的4個相同位點存在相同突變，推測可能顯著減弱KEAP1與NRF2的親和力。其中3個位點的氨基酸殘基電荷性質發生了顯著改變：第446位由酸性谷氨酸(E)變為堿性賴氨酸(K)，第459位堿性精氨酸(R)變為近中性的谷氨酰胺(Q)，第493位酸性谷氨酸(E)變為堿性賴氨酸(K)，上述氨基酸的變異可導致蛋白質構象的顯著改變，從而減弱甚至喪失KEAP1結合NRF2的能力。第475位纈氨酸(V)變為甘氨酸則可能導致蛋白質折疊能力的顯著改變。同時，部分細胞系的第3外顯子區域也存在錯義突變：第333位甘氨酸(G)變為半胱氨酸(C)，第236位的酸性天冬氨酸(D)變為堿性組氨酸(H)。

表2 KEAP1第2-6外顯子基因突變分析

2.2 NRF2-DLG和NRF2-ETGE基因序列編碼基因突變分析 對DLG及ETGE基因序列的基因突變檢測結果顯示，NRF2-DLG基因序列的堿基序列無突變，NRF2-ETGE基序對應堿基序列存在多重遺傳變異(表3)。所有供試細胞系的ETGE基因序列對應堿基序列均存在大量的點突變，同時在347和352位點還存在缺失突變，推測其編碼的氨基酸序列發生了極大改變，幾乎所有位點的氨基酸均發生了改變，供試6個細胞系中不存在可供KEAP1蛋白結合的ETGE基因序列。

表3 NRF2-ETGE基因序列編碼基因突變分析

續表3 NRF2-ETGE基因序列編碼基因突變分析

a：NRF2-ETGE基因序列的氨基酸序列為：77DEETGE82。

2.3 肺癌細胞內活性氧濃度檢測 采用2′,7′-二氧熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)法檢測供試細胞系的相對活性氧濃度發現，供試肺癌細胞內活性氧水平均顯著高于肺胚細胞WI-38，其中NCI-H1975細胞內活性氧濃度最高，其余細胞系的活性氧濃度相當。見圖1。

圖1 細胞內活性氧相對濃度比較

3 討 論

KEAP1/NRF2相互作用結構域基因突變在非小細胞肺癌細胞系內普遍存在，提示NRF2的轉錄因子活性的組成型表達是肺癌細胞增殖和存活的關鍵因素。KEAP1-NRF2調控系統在人類細胞的抗氧化和解毒調控中發揮著核心作用，非應激條件下，NRF2蛋白通過與KEAP1-泛素連接酶E3 復合體結合，不斷被泛素化降解[9]。在氧化應激狀態下，KEAP1蛋白中的活性半胱氨酸殘基被氧化修飾，造成其與E3連接酶親和力下降，使得NRF2能夠在細胞內穩定存在，從而具有轉錄因子活性，能夠進入細胞核內誘導一系列抗氧化和解毒基因的表達[10]。本次檢測到肺癌細胞系內普遍存在著KEAP1-Kelch結構域和NRF2-DLG/ETGE基因序列基因的突變，且都可能導致蛋白質一級系列的變異，導致蛋白質功能的異常，KEAP1蛋白不能與NRF2蛋白進行正確識別和結合。這意味著在供試肺癌細胞內的KEAP1-E3復合體均對NRF2失去了抑制作用，NRF2因子可在癌細胞內穩定存在，使得癌細胞內抗氧化蛋白和解毒酶類變為組成型表達，使癌細胞的抗氧化能力最強化，以適應和拮抗癌細胞內高濃度的活性氧累積。

組成型表達的NRF2轉錄活性對肺癌細胞的存活是必需的[11]，但是對于腫瘤治療和腫瘤研究而言，這一變化意味著不好的結果：NRF2誘導大量解毒酶類的表達，極大地增強了癌細胞對抗癌藥物的耐受性，有助于促進肺癌細胞耐藥[12-14]。研究發現，通過破壞肺癌細胞NRF2蛋白的穩定性，可以有效提高肺癌細胞對抗癌藥物的敏感性[13,15]。這意味著許多肺癌細胞對抗癌藥物的耐藥可能是NRF2或KEAP1基因突變導致的，使用具有不同遺傳背景的癌細胞系進行藥物測試可能得出不同的結論。因此，對于腫瘤藥物研發而言，選擇具有恰當遺傳背景的細胞系是藥物細胞測試能否成功的關鍵。

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Mutation detection in the interaction domains of NRF2 and KEAP1 in lung cancer cell lines*

ZhouJianping1,2,LiZhifang1,LiangLixuan1,XuDe2

(1.SchoolofMedicine,PanzhihuaUniversity,Panzhihua,Sichuan617000,China; 2.TheAffiliatedHospitalofPanzhihuaUniversity,Panzhihua,Sichuan617000,China)

Objective To detect the interaction domains′ gene mutations of KEAP1 and NRF2 in non-small-cell lung cancer cell lines,and to analyze the significance of these mutations on the study of lung cancer cell lines.Methods Six non-small-cell lung cancer cell lines were used as the research materials.The 2nd to 6th exons of KEAP1 and the coding sequences of DLG and ETGE motif were amplified by PCR,and the products were used for gene sequencing analysis.Obtained gene sequences were analyzed using NCBI databases to get the base locations of gene mutations,as well as the subsequent amino acid sequence changes.Meanwhile,the relative intracellular reactive oxygen species (ROS)concentrations in the tested cell lines were detected and used in the analysis of abnormal NRF2 transcriptional activity in lung cancer cell.Results Four mutations were detected in the 4th exon of KEAP1 gene from all the 6 cancer cell lines,several other missense mutations were also investigated in the 3rd exon of KEAP1 from some cancer cell lines.Multiple genetic variations were found in all the NRF2-ETGE motif-encoding sequences of the 6 cancer cell lines.All 6 cancer cell lines were found to have higher ROS concentration than the lung germ cell line.Conclusion Lung cancer cells generally contain high levels of ROS as well as gene mutations in KEAP1 and NRF2 genes which lead to abnormal transcriptional activity of NRF2 in lung cancer cell lines.

NF-E2 related factor 2；non-small-cell lung cancer;KEAP1

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.05.005

國家自然科學基金資助項目(81301893)；四川省攀枝花市科技計劃項目(2014TX-10-1)； 攀枝花學院大學生創新創業訓練計劃項目(2014cxcy084)。 作者簡介：周建平(1981-)，講師，博士，主要從事腫瘤相關細胞內信號轉導網絡研究。

R734.2

A

1671-8348(2017)05-0590-03

2016-06-30

2016-08-28)