人牙髓干細胞和根尖乳頭干細胞體外分化能力的對比研究*

譚小兵，郭 宇，劉 佳，徐靜舒，戴青原

(1.云南省第一人民醫院口腔內科，昆明 650032；2.昆明醫科大學第一附屬醫院心內科，昆明 650032)

人牙髓干細胞和根尖乳頭干細胞體外分化能力的對比研究*

譚小兵1，郭 宇1，劉 佳1，徐靜舒1，戴青原2△

(1.云南省第一人民醫院口腔內科，昆明 650032；2.昆明醫科大學第一附屬醫院心內科，昆明 650032)

目的 對比研究人牙髓干細胞(DPSCs)和根尖乳頭干細胞(SCAP)的體外生長特性、增殖及礦化能力。方法 采用酶消化法體外培養人DPSCs和SCAP，誘導分化培養基誘導細胞成骨/成牙本質向分化，流式細胞儀檢測特異性標記物，茜素紅染色檢測礦化程度，逆轉錄PCR(RT-PCR)檢測分化標記物表達。結果 人DPSCs和SCAP為成纖維細胞樣貼壁生長，SCAP增殖率較高；兩種細胞表達特異性間充質干細胞(MSCs)標記物：CD34、CD45(-)，CD90、CD105、CD146(+)，基質細胞抗原1(STRO-1)、八聚體轉錄因子4(OCT-4)(+)，SCAP特異性標記物CD24(+)。成骨誘導3周可形成明顯鈣化結構，SCAP鈣化能力較強。成骨誘導2周2種細胞均可表達分化標記物：骨涎蛋白、骨鈣素、牙本質涎磷蛋白，且隨誘導時間表達逐漸增加。結論 人DPSCs和SCAP均具有間充質干細胞典型特征，可分化為成牙本質樣細胞，是牙源性組織工程的可靠干細胞來源。

牙髓；干細胞；牙根尖；牙再礦化；組織工程

間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有自我更新能力和多向分化潛能，能分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等[1]。MSCs能進入生物材料內部生長、分化，可修復缺損組織[2]。骨髓MSCs(BMMSCs)是組織工程最為可靠的干細胞，但獲取困難，細胞數量及增殖能力有限，限制了其進一步應用[3]。最近人們成功從牙組織中分離出多種MSCs：首先是牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)[4]；其后又發現另一種特性的MSCs：根尖乳頭干細胞(stem cell from apical papilla,SCAP)[5]。與BMMSCs相比，牙源性MSCs易于獲取，增殖速率高，體外蛋白表達模式相似，有多向分化潛能，牙源性MSCs(包括DPSCs、SCAP)均可在體外分化為成牙本質細胞，植入免疫缺陷小鼠皮下可形成牙髓-牙本質樣復合體組織[6-7]。

DPSCs和SCAP來源組織結構相似、位置相鄰，即牙髓和根尖乳頭組織。兩種細胞雖然有相同特征，但二者遺傳特性不同，有不同基因和蛋白表達模式，在不同微環境中功能也不同[8]。本研究通過體外對比研究DPSCs和SCAP成骨/成牙本質分化能力，以了解不同牙源性MSCs的生物特性，為進一步牙髓再生研究提供研究基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 基礎培養基(α-MEM)、Ⅰ型膠原酶、FITC結合CD24/34/45/基質細胞抗原1(STRO-1)(小鼠抗人單抗)購自美國Invitrogen公司，FBS購自美國Hyclone公司，Ⅱ型中性蛋白酶購自瑞士Roche公司，70 μm細胞濾網購自美國BD公司，成人MSCs成骨誘導分化培養基購自廣州賽業生物科技公司，PE結合CD90/105/146/八聚體轉錄因子4(OCT-4)(小鼠抗人單抗)購自美國eBioscience公司，總RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司，c-DNA合成試劑盒/iTaq DNA聚合酶/dNTP混合物購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離培養 收集阻生拔除的下頜第三磨牙(<20歲)，無菌工作臺內切取根尖孔外乳頭組織；釉牙骨質界處做一環形切口，分離暴露髓腔，30# k銼取出牙髓組織。充分剪碎，37 ℃、Ⅰ型膠原酶(3 mg/mL)與Ⅱ型中性蛋白酶(4 mg/mL)混合液內振蕩孵育60 min，離心，棄上清液，加入α-MEM完全培養基(α-MEM + 15% FBS+1%谷氨酰胺+1%青/鏈霉素)，過70 μm細胞濾器得到單細胞懸液，加入適量完全培養基，37 ℃、5% CO2恒溫箱內常規培養。第2天換液，常規培養，每日倒置相差顯微鏡下觀察。細胞90%融合后傳代培養，第2～5代細胞用于實驗。細胞計數：兩種細胞接種于6孔板(2×105/孔)，每24小時計數細胞，共培養96 h，繪制細胞生長曲線。本實驗所有操作均符合云南省第一人民醫院倫理委員會標準，并取得患者書面同意。

1.2.2 成骨/成牙本質誘導 第3代DPSCs、SCAP接種于6孔板(2×104/cm2)，第2天換為成骨誘導分化培養基(α-MEM完全培養基+10 mmol/L β-磷酸甘油+0.1 μmol/L地塞米松+50 μmol/L抗壞血酸)，37 ℃、5% CO2常規培養，每2～3天換液，共誘導3周。每周處理：棄原液，PBS清洗，4%甲醛室溫固定15 min，1%茜素紅(美國Sigma公司)室溫染色20 min，PBS清洗，倒置相差顯微鏡(Olympus CKX-4,日本)下，觀察礦化情況，計算礦化比例。同等數量的DPSCs和SCAP接種于6孔板內常規培養，作為正常對照。

1.2.3 細胞特異性標志物檢測 收集第3代DPSCs、SCAP，D-PBS沖洗，加入流式緩沖液吹打，再加入10 μL相應抗體(CD24、CD34、CD45、CD90、CD105、CD146、STRO-1)，室溫避光孵育30 min；加入1% PFA，上機檢測。OCT-4、IgG2ak-PE抗體處理：4% PFA-磷酸鹽緩沖液(PBS)固定液、室溫避光孵育20 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入1×細胞打孔液，室溫避光孵育10 min，同樣條件離心、棄上清液，加入對應抗體10 μL，再加入D-PBS混勻，室溫避光孵育30 min，加入1% PFA 液，流式細胞儀(美國貝克曼)檢測，Summit 5.1軟件分析數據。

1.2.4 細胞成骨誘導分化標志物檢測 成骨誘導2周后收集兩種細胞，總RNA試劑盒提取RNA，取5μL RNA，紫外分光光度機(美國Thermo公司)測量濃度，20 μL體系逆轉錄試劑盒合成單鏈cDNA，反應條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。檢測3個相關基因：骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、牙本質涎磷蛋白(dentin sialophosphopretein，DSPP)，GAPDH為管家基因。根據目的基因設計引物(表1)。PCR反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環35次；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。電泳檢測、成像。

1.3 統計學處理 SPSS12.0軟件進行分析，兩兩比較用t檢驗，檢驗水準α=0.05。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞形態和生長特性 分離培養1 d即可看到單個細胞貼壁生長，第4天形成克隆生長，SCAP需5～6 d鋪滿培養瓶，DPSCs要10 d形成單細胞層鋪滿。 DPSCs細胞為紡錘形、多角形或長梭形，形態較大，而SCAP細胞形態較小，多為成纖維細胞樣或星形，有許多胞質突或偽足，很快形成致密單細胞層。結果顯示DPSCs和SCAP表現有不同增殖率，相應細胞生長曲線也說明這一點(圖1)。

A、B、C:下頜第三磨牙牙髓和根尖乳頭組織；D：細胞生長曲線；E：DPSCs第4天(P0，100×)；F：DPSCs第10天(P0，100×)；G：SCAP第4天(P0，100×)；G：SCAP第10天(P0，100×)。

圖1 人DPSCs和SCAP原代培養(Olympus CKX-41倒置相差顯微鏡)

2.2 細胞體外礦化 成骨/成牙本質誘導1周即觀察到單層細胞邊緣開始聚集并形成高密度團，SCAP主要從周邊向中央遷移形成細胞團，DPSCs整層細胞卷曲形成細胞團，同時有明顯礦化結構形成。隨著誘導時間延長，礦化結構逐漸增多，3周后兩種細胞都觀察到大量棕紅色鈣化物，誘導分化早期DPSCs礦化結構形成較多，后期二者礦化比例相似，但SCAP鈣化物密度明顯要高，同時對照組內也出現極少量鈣化結構(見圖2、表2)。

A：DPSCs誘導3周后(200×)；B：DPSCs對照組(100×)；C：SCAP誘導3周(200×)；D：SCAP對照組(100×)。

圖2 人DPSCs和SCAP誘導礦化組織染色(Olympus CKX-41倒置相差顯微鏡)

表2 DPSCs和SCAP不同時間礦化組織比例分析(%)

2.3 細胞特異性標志物 流式細胞檢測結果顯示DPSCs、SCAP均不表達CD34、CD45，幾乎100%DPSCs、SCAP均為CD90、CD105陽性，CD146染色均為強陽性(分別為28.4%、54.8%)。細胞多潛能標記物STRO-1(分別為28.3%、12.4%)，OCT-4(分別為43.6%、58.0%)染色均為陽性。SCAP表達特異性標記物CD24(10.9%)，而DPSCs沒有表達(圖3)。

圖3 人DPSCs和SCAP特異性標志物流式檢測

2.4 細胞分化標記物表達 DPSCs、SCAP誘導第1周兩種細胞即均有分化標記物的表達：BSP(322 bp左右)、OCN(140 bp左右)和DSPP(226 bp左右)。隨著誘導時間的延長，各標記物表達量明顯增加。DPSCs未誘導組第1和2周時也見BSP、DSPP和OCN 的少量表達，SCAP未誘導組的DSPP有少量表達(圖4)。

圖4 RT-PCR 檢測DPSCs和SCAP 誘導不同時間后BSP、DSPP及OCN的表達

3 討 論

本研究采用酶消化法進行人DPSCs和SCAP的原代分離，酶消化法理論上會釋放組織內包含的所有細胞，來自于血管周圍微環境中的成纖維樣細胞、不成熟干/祖細胞、內皮細胞和周細胞會貼壁生長，血細胞和碎屑則隨細胞換液而去除[9]。牙髓組織屬于疏松結締組織，牙根尖乳頭組織是根部牙髓組織的前體組織，兩種組織之間有一層富集細胞層，酶消化法得到的DPSCs和SCAP均可形成具有不同特征的克隆形成單位——成纖維細胞(colonyforming unit-fibroblasts，CFU-Fs)，在同一克隆內有不同大小和形態的細胞，其重要特性之一就是成牙本質細胞分化潛能[10]。因此有必要指出，與其他研究者相同[11-12]，本研究中人DPSCs和SCAP也非純干細胞培養，主要混雜有血干/祖細胞及少量其他成纖維樣細胞，但兩種細胞均取自同一個牙齒，在同樣環境下培養，將同樣的細胞混雜因素考慮在內，對本實驗對比結果并無影響。目前仍沒有一個或幾個標記物可以特異性鑒定人DPSCs和SCAP，主要參照BMMSCs的鑒定標準，并結合細胞多向分化潛能及牙源性特異性標記物DSPP的表達。兩種牙源性MSCs的具體定位尚不十分清楚，可能位于血管周及神經鞘周[13]。

本研究結果顯示，SCAP細胞為小圓形、紡錘形，體外礦化能力強，可能是由于根尖乳頭組織尚未完全發育，與DPSCs相比，SCAP表現為更高的增殖率。CD34和CD45選擇性表達于哺乳動物造血干/祖細胞或所有白細胞表面。本研究DPSCs和SCAP均不表達CD34、CD45，說明無血細胞污染。CD90、CD105為人MSCs特異性標記物，本實驗DPSCs和SCAP幾乎均為CD90、CD105陽性，純度很好。CD24是人根尖乳頭干細胞特異性標記物，表達率為3.2%～15.3%，在其他MSCs中沒有表達，包括DPSCs，本研究SCAP的CD24表達率為10.9%，與Bakopoulou等[14]研究結果一致。CD146、STRO-1均為MSCs表面標志物，與細胞分化潛能有關，本實驗兩種牙源性MSCs細胞CD146、STRO-1均為陽性，說明DPSCs和SCAP有良好的自我更新能力和分化潛能，與Bakopoulou等[15]研究結果一致。本研究還檢測了與干細胞維持自我更新能力有關的胞內標記物OCT-4的表達情況，結果進一步說明了兩種細胞的自我更新能力。

DPSCs和SCAP成骨/成牙本質誘導3周后均能形成礦化小節及三維礦化結構。成骨/成牙本質誘導液中添加成分在胞外基質礦化過程中發揮重要作用。地塞米松與β-磷酸甘油、抗壞血酸體外協同作用可促進MSCs分化為成骨/成牙本質系，其適宜濃度為10～100 nmol/L[16]。β-磷酸甘油在礦化過程及成骨細胞活性調整方面起到重要作用，其功效與成骨/成牙本質細胞高堿性磷酸酶(ALP)活性密切相關，β-磷酸甘油與KH2PO4同時提供有機和無機磷酸根離子以促進生物礦化[17]。細胞遷移和礦化結構形成也出現在正常對照組中，但數量非常少，因為缺乏有機和無機磷酸根離子的來源。

DPSCs和SCAP誘導1周和2周后，成骨/成牙本質系分化標記物檢測均有表達，包括BSP、OCN、DSPP，且隨著誘導時間延長，各標記物表達量明顯增加，與文獻[18-19]研究結果一致。BSP是主要的骨胞外基質涎蛋白，其表達與基質沉積同時出現，與礦化過程密切相關；OCN是成骨細胞分化晚期標志物，其出現提示基質沉積的開始[18]。DSPP是DSPP mRNA初始翻譯產物，隨后分為牙本質磷蛋白和牙本質涎蛋白，是牙源性組織的特異性標記[19]。DSPP在牙本質形成過程中起關鍵作用，是成牙本質分化的相對特異性標記物。

本研究得到的DPSCs和SCAP能分化為成牙本質樣細胞，具有遷移和礦化能力，可在體外形成有序礦化結構，為了解牙源性MSCs生物特性提供了實驗證據，有助于牙源性干細胞用于牙髓再生等方面的研究。如何聯合應用牙源性MSCs、生物可吸收性支架(如聚乳酸-羥基乙酸共聚物、多肽凝膠等)、生長因子(如骨形態發生蛋白家族、趨化因子等)誘導牙髓再生是下一步的研究方向。

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Comparative characterization of osteo/odontogenic differentiation capability of human dental pulp stem cells and stem cells from apical papilla in vitro*

TanXiaobing1,GuoYu1,LiuJia1,XuJingshu1,DaiQingyuan2△

(1.DepartmentofCariologyandEndodontics,theFirstpeople′sHospitalofYunnanProvince,Kunming,Yunnan650032,China;2.DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China)

Objective To compare the growth characteristics,proliferation and osteo/odontogenic differentiation capability of stem cells from human dental pulp (dental pulp stem cells,DPSCs)and apical papilla (stem cells from apical papilla,SCAP)in vitro.Methods Human dental pulp and apical papilla tissues were separated from impacted third molars of young healthy donors at the age of root development and digested by collagenase type Ⅰ and dispase type Ⅱ to derive primitive DPSCs and SCAP.Cells were then induced for osteo/odontongenic differentiation by medium containing β-glycerophosphate,dexamethasone and KH2PO4.Flow cytometry was utilized to test the expression of specific markers of stem cells,including CD24,CD34,CD45,CD90,CD105,CD146,STRO-1 and OCT-4.AR-S was used to display the mineralization structure and RT-PCR was applied to analyze the expression of bone sialoprotein (BSP),osteocalcin (OCN)and dentine sialophosphoprotein (DSPP).Results Both DPSCs and SCAP were positive for CD90,CD105,CD146,STRO-1 and OCT-4,in percentages varying according to cell type,without expression of CD34 or CD45.Only SCAP expressed CD24 positively.Both cells formed organized mineralization structure after 2 weeks of induction in time-dependent manner,with more mineralization by SCAP and expressed differentiation markers,including BSP,OCN and DSPP.Conclusion Human DPSCs and SCAP possess the characteristics of MSCs and could be differentiated into odontonblast-like cells in vitro.Both cells are approachable stem cell sources for dental tissue engineering.

dental pulp;stem cells;tooth apex;tooth remineralization;tissue engineering

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.05.004

國家自然科學基金資助項目(81360161)；云南省教育廳基金資助項目(2015Y153)。 作者簡介：譚小兵(1974-)，副主任醫師，碩士，主要從事干細胞在牙髓再生中的作用研究。△

，E-mail:dqy0823@163.com。

R781.3

A

1671-8348(2017)05-0586-04

2016-07-09

2016-09-07)