miR-15a-5p抑制人肝癌SMMC-7721細胞增殖與遷移*

錢建升， 李 宇， 竇建衛

(1西安交通大學第一附屬醫院腫瘤放療科， 陜西 西安 710061； 2陜西省人民醫院放療科，陜西 西安 710068； 3西安交通大學醫學部藥學院, 陜西 西安 710061)

·短篇論著·

miR-15a-5p抑制人肝癌SMMC-7721細胞增殖與遷移*

錢建升1△， 李 宇2， 竇建衛3

(1西安交通大學第一附屬醫院腫瘤放療科， 陜西 西安 710061；2陜西省人民醫院放療科，陜西 西安 710068；3西安交通大學醫學部藥學院, 陜西 西安 710061)

目的： 觀察高表達的miR-15a-5p對人肝細胞癌SMMC-7721細胞增殖和遷移能力的影響。方法: 化學合成加入EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切位點的miR-15a-5p寡聚核苷酸，并進行測序確認；利用pcDNA6.2-GW/Em-GFP質粒構建miR-15a-5p真核表達載體，瞬時轉染SMMC-7721細胞，實時熒光定量PCR檢測miR-15a-5p的表達；CCK-8法和臺盼藍染色活細胞計數檢測SMMC-7721細胞的增殖能力，劃痕實驗檢測細胞遷移能力的變化。結果: 設計的miR-15a-5p序列與寡核苷酸測序結果匹配達100%；真核表達質粒瞬轉后人肝癌SMMC-7721細胞miR-15a-5p的表達量與對照組相比顯著增加(P<0.05)；miR-15a-5p高表達SMMC-7721細胞的增殖能力與對照組相比均顯著下降(P<0.05)；miR-15a-5p高表達組細胞遷移速度低于對照組。結論: 高表達的miR-15a-5p可抑制人肝癌SMMC-7721細胞的增殖和遷移能力。

miR-15a-5p； 肝細胞癌； 細胞增殖； 細胞遷移

肝細胞癌(簡稱肝癌)是最常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內發病率處于惡性腫瘤中的第6位，死亡率位于第3位[1]，由于惡性程度高、發病隱匿、病情進展快、易復發轉移等特性，絕大多數患者在確診時已經進入晚期，導致了包括手術、化療等治療手段的無力。在我國，肝癌的發病率位于惡性腫瘤的第4位，死亡率高居第2，僅次于肺癌。因此肝癌的防治是中國乃至全世界研究人員所面臨的重任。

微小RNA(microRNA, miR)-15a-5p是miR-15家族的一個成員，由位于染色體 13q14 區域內的基因編碼。既往研究認為miR-15a主要起到抑制腫瘤發生的作用，可抑制多種腫瘤細胞的增殖和遷移，可能成為抗腫瘤治療的新靶標[2]。但目前miR-15a-5p與肝癌侵襲和轉移的關系尚不清楚。本研究通過觀察miR-15a-5p對人肝癌細胞SMMC-7721增殖和遷移的影響，以期為尋找抑制肝癌增殖和轉移的分子靶點提供新的實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料

SMMC-7721細胞株購自中科院上海細胞所；菌株選用本室保存的TOP10 菌株；氨芐青霉素(新泰生物公司)；DNA無內毒素質粒提取試劑盒(Omega)；膠回收試劑盒(Tiangen)；pcDNA6.2-GW/Em-GFP質粒、轉染試劑 Lipofectamine 2000和RNA提取試劑TRIzol(Invitrogen)；T4 DNA連接酶及EcoR Ⅰ、HindⅢ、逆轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa)；PCR引物(上海生工)。

2 方法

2.1 化學合成miR-15a-5p寡聚核苷酸 在miRbase(http://mirbase.org/)網站查詢miR-15a-5p的前體序列，并分別在兩端添加EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位點，委托上海生工生物工程股份有限公司合成以上單鏈核酸，將各單鏈核酸稀釋至100 μmol/L， 65 ℃ 5 min形成DNA雙鏈，-20 ℃保存待用于載體構建。

2.2 載體構建 用EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切pcDNA6.2-GW/Em-GFP-pre-miR-15a-5p 質粒，然后用1%瓊脂糖凝膠分離雙酶切目的產物，用膠回收試劑盒按說明書操作回收大片段DNA。用T4 DNA連接酶連接目標片段和酶切載體，轉化TOP10感受態細菌，克隆后選擇陽性克隆的質粒進行測序。構建載體所用引物序列見表1。

表1 載體構建所用引物序列

2.3 細胞培養和轉染 人肝癌SMMC-7721細胞培養于含1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM中。放置于37 ℃、5% CO2的培養箱中，隔天換液，取對數生長期的細胞進行實驗。按每孔2×105個細胞鋪6孔板，24 h后進行瞬時轉染。將轉染miR-15a-5p的細胞命名為實驗組(experiment組)，轉染無義序列的載體命名為空載體組(scramble組)，無質粒僅使用轉染試劑處理組命名為對照組(mock組)，無任何處理組命名為空白組(blank組)。轉染4 h后換液，進行后續試驗。

2.4 Real-time PCR檢測miR-15a-5p在細胞中的表達 TRIzol提取SMMC-7721細胞總RNA。使用逆轉錄試劑盒和real-time PCR試劑盒對所提取RNA進行逆轉錄和real-time PCR實驗，實驗步驟參照試劑盒說明書，PCR引物序列見表2。根據總miRNA測定濃度，計算并調整各組總miRNA用量，按試劑盒操作規范加入miRNA特異反轉錄引物，于42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min、冰浴5 min，將miRNA反轉錄為第一鏈cDNA。cDNA可于-20 ℃保存2周。按SYBR Green/ROX qPCR Master Mix說明書步驟將第一鏈cDNA(按總RNA 100 ng～200 ng換算)、miRNA特異的上游引物、miRNA共同下游引物與預混的PCR試劑按25 μL體系混合，然后于PCR儀中進行“95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s， 40個循環”的PCR擴增。采用2-ΔΔCt法分析real-time PCR的實驗數據。

表2 miR-15a-5p的引物序列

2.5 CCK-8實驗檢測細胞活力 調整細胞密度接種于96孔板，每孔種約3 000個細胞，設對照組和實驗組，每組設3個復孔，置于細胞培養箱中培養，24 h后轉染質粒。在轉染24 h、48 h、72 h后從培養箱取出，每孔100 μL培養液中加入10 μL CCK-8試劑，置于細胞培養箱中培養3 h后取出，使用酶標儀測定450 nm處各孔吸光度(A)值，反映細胞活力。細胞活力 (%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100%。A(加藥)：具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A(空白)：具有培養基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度；A(0加藥)：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。

2.6 臺盼藍染色活細胞計數實驗 將培養至對數生長期的細胞利用0.25%胰酶消化成單個細胞，調整細胞濃度至3×107/L，于96孔板鋪板，37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜，待細胞完全貼壁后分別向不同分組的孔中轉染對應質粒或抑制子，轉染4 h后換液，隨后將培養板放入37 ℃、5% CO2培養箱中培養，分別于轉染完成后24 h、48 h和72 h 3個時點，用0.25%胰酶消化細胞，采用臺盼藍染色，進行活細胞計數。

2.7 細胞劃痕遷移實驗 在向培養板接種細胞之前，先用標記筆于6孔板背面輕點在兩端做標記。將培養好的細胞消化后接入6孔板培養，數量以貼壁后鋪滿板底為宜(數量少時可培養一段時間至鋪滿板底)。待細胞長滿板底后，用10 μL槍頭垂直于孔板制造細胞劃痕(可用培養板上蓋做尺子，使得劃痕筆直)，盡量保證每孔劃痕寬度一致。棄去劃畢孔中細胞培養液，PBS沖洗孔板3次，洗去細胞碎片。向PBS沖洗完畢的孔中加入2 mL無血清培養基。分別向不同分組的孔中轉染對應質粒或者抑制子，轉染4 h后換液，拍照記錄。將培養板放入37 ℃、5% CO2培養箱中培養，分別于24 h、48 h和72 h取出拍照。

3 統計學處理

使用SPSS 18.0軟件進行統計分析，實驗計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 測序鑒定

通過Chromas軟件和應用NCBI的BLAST功能，分別將設計的miR-15a-5p序列與測序結果比對。結果顯示匹配程度達100%，見圖1。

Figure 1.The sequencing result of miR-15a-5p.

圖1 miR-15a-5p的測序結果

2 SMMC-7721細胞瞬時轉染及實時熒光定量PCR實驗結果

在6孔板中培養人肝癌SMMC-7721細胞，培養24 h后用瞬時轉染試劑Lipofectamine 2000轉染構建好的miR-15a-5p載體。48 h后提取RNA, real-time PCR檢測轉染后miR-15a-5p的表達量。與空載組、對照組及空白組相比，實驗組中miR-15a-5p的表達量分別增加145.21%±10.32%、112.38%±12.25%和138.44±15.34%，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The expression level of miR-15a-5p. The cells transfected with pre-miR-15a-5p was named experiment group; the cells transfected with the vector of nonsense sequences was named scramble group; the cells treated with the transfection reagent was named mock group; the cells treated without any reagent was named blank group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsexperiment group.

圖2 各組miR-15a-5p表達水平的比較

3 高表達miR-15a-5p抑制人肝癌SMMC-7721細胞的增殖

轉染miR-15a-5p后用CCK-8法檢測其對SMMC-7721細胞活力的影響，結果顯示培養24 h、48 h和72 h后實驗組SMMC-7721細胞的活力與空載組、對照組及空白組相比均有顯著下降。24 h時，實驗組細胞的活力分別為空載組、對照組及空白組細胞總數的50.23%±3.21%、51.75%±2.26%和52.32%±1.78%，差異具有統計學意義(P<0.05)。48 h時，實驗組細胞活力分別為空載組、對照組及空白組細胞活力的40.59%±7.11%、33.33%±4.52%和34.38%±6.55%，差異具有統計學意義(P<0.05)。72 h時，實驗組細胞活力分別為空載組、對照組及空白組細胞活力的44.89%±8.32%、44.45%±8.69%和39.53%±6.21%，差異具有統計學意義(P<0.05),見圖3A。

在活細胞計數實驗中，實驗組細胞的增殖情況與對照組相比明顯受到抑制，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖3B。

Figure 3.Over-expression of miR-15a-5p inhibited the viability and growth of SMMC-7721 cells. A: the cell viability was measured by CCK-8 assay; B: the living cell numbers were counted by the method of Trypan blue exclusion. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsexperiment group.

圖3 高表達miR-15a-5p抑制肝癌細胞的增殖

4 高表達miR-15a-5p抑制人肝癌SMMC-7721細胞的遷移

每24 h觀察遷移的細胞，結果顯示，在48 h及72 h時，實驗組與空載組、對照組及空白組相比，細胞遷移速度顯著降低，測量數據經分析差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

討 論

miR-15a-5p與多種腫瘤增殖和遷移明確相關。目前僅國內一項研究發現miR-15a-5p對肝癌HepG2細胞增殖具有調控作用[3]，暫無其它研究報道miR-15a-5p對肝癌細胞增殖和遷移的影響。本研究中通過構建pre-miR-15a-5p過表達載體并瞬轉人肝癌SMMC-7721細胞，可顯著提高miR-15a-5p表達。進一步檢測證實高表達miR-15a-5p可抑制肝癌SMMC-7721細胞的增殖及遷移能力。這些結果提示miR-15a-5p表達與肝癌細胞增殖與遷移能力呈負相關。本研究中miR-15a-5p對肝癌細胞增殖的抑制能力結果與國內文獻報道相一致[4]。

Figure 4.Up-regulation of miR-15a-5p expression inhibited the migration ability of SMMC-7721 cells (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsexperiment group.

圖4 上調 miR-15a-5p表達可降低肝癌細胞的遷移能力

既往研究發現，在結腸瘤細胞 SW620 中，miR-15a-5p 與細胞周期蛋白 B1的 mRNA 3′ UTR 結合，抑制細胞周期蛋白 B1蛋白的合成，從而抑制結腸瘤細胞生長和增殖[5]。在頭頸部鱗癌中miR-15a-5p與細胞周期蛋白 E(cyclin E，CCNE)mRNA 的3′ UTR 結合，抑制CCNE 的合成，進而抑制腫瘤細胞的增殖[5]。在神經母細胞瘤，miR-15a-5p直接作用于伴有Kazal域的富含半胱氨酸逆誘導蛋白(reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs，RECK)，調控細胞的遷移能力，進一步證實可能與影響RECK下游基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表達與分泌有關[6]。在Dai等[7]的研究中發現，高表達miR-15a-5p可抑制骨肉瘤細胞SOSP-9607的快速增殖，可能通過靶向抑制細胞周期蛋白D1。在Alderman等[8]的研究中發現，miR-15a會引起細胞周期停止在G1/G0期，并且會下調SK-MEL-28以及CRL-2808黑色素瘤細胞系中AKT3(AKT亞家族成員)和CDCA4(E2F家族成員)的表達，這2種蛋白均與細胞的增殖相關。而過表達 miR-15a 時，miR-15a尚可與成纖維細胞生長因子2 (fibroblast growth factor 2, FGF2) mRNA的 3′ UTR結合抑制FGF2的表達，最終抑制腫瘤細胞的遷移與侵襲[9]。因此，我們推測miR-15a-5p可能通過直接調控多種細胞周期相關蛋白從而影響肝癌細胞增殖，而通過RECK影響MMP-9表達從而調控肝癌細胞遷移能力。另外Tian等[10]的研究發現，在骨肉瘤細胞MG-63中，miR-15a的過表達會通過直接抑制TNFAIP1達到抑制腫瘤的增殖、遷移以及侵襲的目的。

綜上所述，我們的研究證實了高表達miR-15a-5p在人肝癌細胞中能抑制肝癌細胞的遷移和侵襲。但miR-15a-5p抑制肝癌細胞增殖、遷移的機制，以及能否真正成為肝癌的藥物干預靶點及獨立的預后指標還需要進一步的研究證實。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

miR-15a-5p inhibits proliferation and migration of human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells

QIAN Jian-sheng1, LI Yu2, DOU Jian-wei3

(1DepartmentofRadiationOncology,TheFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2DepartmentofRadiationOncology,ShaanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China;3PharmaceuticalCollegeofXi’anJiaotongUniversityHealthScienceCenter,Xi’an710061,China.E-mail:jianshengqian@163.com)

AIM: To observe the influence of high expression of miR-15a-5p on the proliferation and migration of human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells. METHODS: The miR-15a-5p oligonucleotide, which was reconstructed with additional restriction sites ofEcoR Ⅰ andHindⅢ, was chemically synthesized and confirmed by sequencing. The miR-15a-5p eukaryotic expression system was constructed by pcDNA6.2-GW/Em-GFP-pre-miR-15a-5p plasmid. The miR-15a-5p was transfected into the SMMC-7721 cells transiently by plasmid, and quantified by quantitative real-time PCR at the mRNA level. The cell viability was measured by CCK-8 assay, and the living cell counting was performed by the method of Trypan blue exclusion. The migration ability of the SMMC-7721 cells with high expression of miR-15a-5p was detected by wound healing test. RESULTS: The sequence of miR-15a-5p oligonucleotide 100% matched the designed sequence. Compared with control group, the miR-15a-5p expression was increased significantly (P<0.05). The viability, the living cell number and the migration ability of the SMMC-7721 cells were decreased in high expression of miR-15a-5p group with statistically significant difference (P<0.05).CONCLUSION: The abilities of proliferation and migration in human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells are decreased by high expression of miR-15a-5p.

miR-15a-5p; Hepatocellular carcinoma; Cell proliferation; Cell migration

1000- 4718(2017)02- 0344- 06

2016- 09- 13

2016- 11- 21

國家自然科學基金資助項目(No. 81573983)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.024

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