下調TCF3抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和遷移能力

王士猛

(山東省菏澤市立醫院胸外科，山東 菏澤 274000)

下調TCF3抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和遷移能力

王士猛△

(山東省菏澤市立醫院胸外科，山東 菏澤 274000)

目的： 探索下調T細胞因子3(TCF3)抑制非小細胞肺癌細胞增殖和遷移的分子機制。方法: 運用Lipofectamine 2000轉染法將siTCF3和陰性對照siRNA(NCsiRNA)轉染非小細胞肺癌A549和H1299細胞；運用real-time PCR和Western blot分別測定TCF3的mRNA和蛋白水平；運用螢光素酶報告基因實驗測定TCF3的轉錄活性；MTT、克隆形成實驗、Transwell實驗和Annexin V-FITC/PI染色聯合流式細胞術分別測定細胞的活力、克隆形成能力、轉移能力及細胞凋亡率；Western blot檢測Wnt、c-Myc、基質金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-13、金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)-1的蛋白表達水平。結果: 與NCsiRNA轉染組的細胞比較，siTCF3顯著抑制A549細胞和H1299細胞中TCF3的mRNA 和蛋白水平 (P<0.01)。TCF3轉錄活性和c-Myc蛋白表達水平明顯低于NCsiRNA細胞(P<0.05)。MTT實驗結果顯示，培養24 h、48 h、72 h和96 h的A549-siTCF3和H1299-siTCF3細胞活力均顯著低于NCsiRNA細胞(P<0.05)。與NCsiRNA細胞相比，siTCF3顯著抑制A549細胞 和H1299細胞的克隆形成能力(P<0.01)。Transwell實驗結果顯示A549-siTCF3和H1299-siTCF3細胞遷移數顯著低于A549-NCsiRNA和H1299-NCsiRNA組細胞(P<0.05)。流式細胞術分析結果顯示A549-siTCF3細胞和H1299-siTCF3細胞的凋亡率顯著高于A549-NCsiRNA和H1299-NCsiRNA細胞(P<0.01)。Western blot實驗結果顯示，下調TCF3表達能抑制Wnt蛋白的表達，MMP-9和MMP-13的蛋白表達明顯降低，TIMP-1的蛋白表達增高。結論: siTCF3顯著抑制A549細胞和H1299細胞的增殖和遷移能力，并誘導細胞凋亡，其分子機制可能通過下調Wnt通路活性以及調控MMP家族關鍵成員的表達而實現。

非小細胞肺癌； T細胞因子3； 基質金屬蛋白酶

肺癌已成為嚴重威脅人類健康與生命最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率位居所有癌癥之首[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要類型，約占肺癌的80%～85%[2]。目前放療是NSCLC的主要治療方案，但NSCLC對放療產生耐受是導致預后不良和五年生存率低的主要原因[3]。因此，尋找和研發治療NSCLC的小分子靶向藥物是亟需解決的問題，已成為治療肺癌的重要課題。

T細胞因子3(T-cell factor 3，TCF3)是經典Wnt信號通路的效應分子之一。早期的研究發現TCF3基因缺失導致早期胚胎發育致死，表現為神經和中胚層發育缺陷[4]。TCF3過表達能刺激人皮膚毛囊隆突表皮原始祖細胞分裂并抑制細胞分化。研究發現TCF3與Oct4、Sox2、Nanog基因啟動子區域結合,拮抗這些基因的作用進而抑制鼠胚胎干細胞的自我更新[5-6]。Wnt通路激活使TCF3從相應的基因啟動子上脫離，激活靶基因轉錄從而增強多能干細胞的分裂活性并延遲對分化刺激的應答[7]。最近研究表明TCF3對腎癌、乳腺癌、胚胎癌等人類腫瘤的發生起著抑制或促進作用[8]。目前TCF3的功能在肺癌中的研究甚少[9]，近新研究發現TCF3在肺癌病人手術切除的癌變組織及幾種NSCLC細胞系中均有表達，在正常16HBE細胞中亦有表達，而在癌旁組織中無表達。但TCF3對肺癌發生、發展是促進還是抑制作用尚不清楚。本研運用siRNA干擾技術下調人肺腺癌細胞系A549細胞和H1299細胞中TCF3的表達，體外研究下調TCF3表達對肺腺癌細胞增殖和遷移的影響及其可能的分子機制，為以TCF3為靶點研發治療肺癌的靶向藥物提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 試劑和材料

非小細胞肺癌細胞系A549和H1299購自ATCC；MTT、DMSO和胰蛋白酶購自Sigma；DMEM培養基(Gibco)；胎牛血清和雙抗購自北京金博益生物技術有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；TOP-Flash/FOP-Flash質粒購自Upstate；Lipofectamine 2000轉染試劑購自Invitrogen；Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega；Transwell板購自Corning；抗c-Myc和GAPDH抗體購自Abcam；抗CTF3、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-9、MMP-13和金屬蛋白酶組織抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)抗體購自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG II 抗購自北京中杉金橋公司；Total RNA 提取試劑、反轉錄試劑盒(PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser)和real-time PCR 試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ)購自 TaKaRa；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Thermo。

2 主要方法

2.1 細胞培養 A549細胞和H1299細胞培養于DMEM培養基(含10% 胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素)中，置于37 ℃、5% CO2及完全濕度培養箱內，待細胞融合度達到80%～90%時進行細胞傳代。

2.2 siRNA合成和細胞轉染 針對TCF3基因開放閱讀框序列，運用Ambion的網上在線軟件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)設計siTCF3，同時設計陰性對照siRNA (negative control siRNA, NCsiRNA)，由上海生工合成。將生長良好的A549細胞和H1299細胞以細胞密度為每孔2×105個接種到6孔板中，培養至細胞融合度達到85%左右時按照Lipofectamine 2000說明書進行轉染。先用無血清OptiMEM培養液將Lipofectamine 2000稀釋和配置siTCF3，然后將等體積Lipofectamine 2000與siTCF3輕輕混勻，室溫靜置10 min后加入細胞中使siTCF3終濃度為30 μmol/L，培養4 h后換成完全培養基，以轉染NCsiRNA為陰性對照，置于培養箱中培養用于后續實驗。

2.3 Real-time PCR 轉染的細胞培養48 h后收集細胞，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA，濃度測定并保存于-80 ℃。按照RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA，反應條件為42 ℃ 1 h、70 ℃ 5 min；4 ℃放置10 min。cDNA置于-80 ℃保存。取2 ng cDNA進行real-time PCR反應，擴增引物見表1。反應條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35個循環；72 ℃ 10 min。運用 SYBR Green Ⅱ 熒光染料法和IQ5TMReal-time PCR Detection System (Bio-Rad)進行real-time PCR數據分析，結果經內參照GAPDH校正，mRNA相對表達量用 2-ΔΔCt表示。

表1 Real-time PCR引物序列

2.4 螢光素酶報告基因檢測 將轉染的A549和H1299細胞經胰酶消化，計數后以每孔5×104個接種于24孔板中，待細胞融合度為70%左右時進行細胞轉染。按照Lipofectamine 2000說明書將200 ng TOP-Flash報告質粒和10 ng FOP-Flash海腎螢光素酶對照質粒共轉染細胞，48 h后收集細胞。加入1×被動裂解緩沖液重懸細胞，置于4 ℃裂解24 h，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集上清并測定細胞上清中螢光素酶的活性。以海腎螢光素酶活性為內參照計算樣品中螢火蟲螢光素酶的活性。

2.5 MTT實驗測定細胞活力 將轉染的A549細胞和H1299細胞經胰酶消化后，以每孔2.5×104個接種于96孔板中，于培養箱中分別在24 h、48 h、72 h、96 h時進行MTT實驗，每孔加入20 μL(5 g/L)MTT，37 ℃繼續培養4 h，棄掉培養液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上室溫振蕩5 min，用酶標儀測定492 nm處的吸光度(A)值，按下式計算細胞活力抑制率(%)=(對照組A均值-實驗組A均值)/實驗組A均值×100%。

2.6 克隆形成實驗 轉染的A549細胞和H1299細胞經胰酶消化后計數，細胞以每皿500個/接種于90 mm細胞培養皿中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，設3個平行皿，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養，直到通過出現肉眼能清晰觀察到可見的細胞克隆(約2周)；棄掉培養基，PBS洗滌，4%甲醛固定10 min，PBS洗滌，吉姆薩染色10 min，自來水清洗，晾干后計數，按下列公式計算細胞克隆形成率=(細胞克隆數平均值/鋪板細胞總數)×100%。

2.7 細胞遷移實驗 轉染的A549細胞和H1299細胞經胰酶消化，然后在Transwell每個培養孔上室中加入2×104個細胞，下室為無血清培養基，設置空白對照組；37 ℃繼續培養6 h后，經4%多聚甲醛固定、乙醇脫水、結晶紫染色、洗滌。用棉簽輕輕擦去上室的貼壁細胞，在顯微鏡下拍照并計數從Transwell上室遷移至微孔膜下層的細胞，每組設3個重復孔，通過每組Transwell的遷移細胞數比較細胞的遷移能力。

2.8 流式細胞術測定細胞凋亡 轉染的A549細胞和H1299細胞經消化后以細胞密度為每孔3×104個接種接種到6孔板中，培養72 h后棄掉培養基，用PBS洗滌3次，無EDTA的胰酶消化，離心收集細胞，按照Annexin V/PI試劑盒說明書操作，先加入500 μL的binding buffer重懸細胞，再加入5 μL FITC標記的Annexin V和5 μL PI混勻，室溫下避光孵育15 min，運用流式細胞儀測定細胞凋亡。

2.9 Western blot實驗 轉染的A549細胞和H1299細胞培養48 h。收集細胞，加入RIPA重懸細胞，超聲破碎、12 000 r/min，4 ℃離心10 min，按照BCA試劑盒說明書測定總蛋白濃度。每個樣本取30 μg進行SDS-PAGE，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別孵育 Ⅰ 抗(Wnt、c-Myc、CTF3、MMP-9、MMP-13和TIMP-1)，β-actin為內參照，4 ℃過夜。TBST洗膜、孵育 II 抗，室溫1 h。ECL顯影后掃描，蛋白相對表達量經內參照歸一化后經Quanity One軟件分析。

3 統計學處理

每個實驗進行3次獨立重復試驗。應用SPSS 17.0統計軟件進行相關數據分析，結果用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 A549和H1299細胞中TCF3的mRNA及蛋白表達情況

Real-time PCR結果顯示，siTCF3顯著抑制A549細胞和H1299細胞中TCF3 mRNA的表達顯著低于陰性對照組(P<0.01)。Western blot實驗結果進一步顯示，siTCF3明顯下調A549細胞和H1299細胞TCF3蛋白的表達，與陰性對照組比較差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

2 Wnt通路的轉錄活性及其靶基因c-Myc的蛋白表達水平

TOP-Flash/FOP-Flash雙螢光素酶報告基因結果顯示，與陰性對照組比較，siTCF3轉染組細胞的TOP-Flash/FOP-Flash比值明顯降低(P<0.01)，提示TCF3可能具有促進轉錄調節的作用。Western blot實驗結果顯示，與陰性對照組比較，siTCF3轉染組細胞的c-Myc蛋白表達量明顯降低(P<0.01)，見圖2、表2。

3 干擾TCF3表達對肺癌細胞增殖的影響

MTT實驗結果顯示，轉染siTCF3的A549和H1299細胞培養24 h、48 h、72 h和96 h的細胞活力分別為(96.26±15.23)%、(78.93±11.27)%、(56.32±6.58)%、(43.54±5.52)%和(83.74±16.20)%、(65.31±9.52)%、(57.00±7.33)%、(36.90±4.38)%。除了24 h的A549細胞外，各時點的細胞活力顯著低于陰性對照組(P<0.05)，提示下調TCF3的表達能抑制A549細胞和H1299細胞的活力，見圖3。為了進一步證明下調TCF3能抑制肺癌細胞增殖，我們運用克隆形成實驗發現下調TCF3表達能抑制A549和H1299細胞的克隆形成，與陰性對照組比較，siTCF3顯著抑制A549和H1299細胞的克隆形成能力，其克隆形成率分別為(0.58±0.03)和(0.24±0.01)，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖4。

Figure 1.The expression of TCF3 at mRNA and protein levels in the lung cancer cells with RNA interference. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNCsiRNA group.

圖1 RNA干擾肺癌細胞中TCF3 mRNA和蛋白表達

Figure 2.The effect of down-regulated TCF3 expression on the transcriptional activity of Wnt pathway and the expression of target gene c-Myc protein. A: the detection of transcriptional activity in Wnt pathway by TOP-Flash/FOP-Flash; B: the protein expression of c-Myc detected by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNCsiRNA group.

圖2 下調TCF3表達對Wnt通路轉錄活性及靶基因c-Myc蛋白表達的影響

表2 Wnt通路的轉錄活性及Wnt靶基因c-Myc的蛋白表達水平

**P<0.01vsNCsiRNA group.

Figure 3.The effect of TCF3 down-regulation on the viability of lung cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNCsiRNA group.

圖3 下調TCF3的表達對肺癌細胞活力的影響

Figure 4.The effect of down-regulation of TCF3 expression on the colony formation ability of lung cancer A549 cells and H1299 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNCsiRNA group.

圖4 下調TCF3的表達對肺癌細胞克隆形成能力的影響

4 干擾TCF3表達對肺癌細胞遷移能力的影響

Transwell實驗結果顯示對照組細胞轉移通過肌質膜的數量明顯增多，而siTCF3轉染的A549細胞和H1299細胞遷移至下室的細胞數顯著降低，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05),見圖5。

Figure 5.The effect of TCF3 down-regulation on the migratory ability of lung cancer A549 cells and H1299 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNCsiRNA group.

圖5 下調TCF3表達對A549和H1299遷移的影響

5 下調TCF3表達對肺癌細胞凋亡的影響

流式細胞術分析結果顯示在TCF3下調的A549細胞和H1299細胞中，其細胞凋亡率明顯增高，分別為(31.40±4.12)%和(39.52±3.58)%，與陰性對照組比較差異具有統計學意義，提示下調TCF3的表達能誘導A549和H1299細胞凋亡，見圖6。

Figure 6.The effect of TCF3 down-regulation on the apoptosis of lung cancer A549 cells and H1299 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNCsiRNA group.

圖6 下調TCF3表達對A549和H1299細胞凋亡的影響

6 下調TCF3表達對肺癌細胞Wnt通路相關蛋白水平的影響

Western blot結果發現，下調TCF3的表達后，A549和H1299細胞中的Wnt、MMP-9和MMP-13的相對表達量顯著低于NCsiRNA細胞；TIMP-1蛋白的相對表達量顯著高于NCsiRNA細胞，見圖7。

Figure 7.The effect of TCF3 down-regulation on the expression of Wnt pathway-related proteins in lung cancer A549 cells and H1299 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNCsiRNA group.

圖7 下調TCF3的表達對Wnt通路相關蛋白水平的影響

討 論

Wnt/β-catenin信號通路是哺乳動物細胞內高度保守的關鍵信號通路，其與肺癌的發生發展密切相關[10]。TCF3是TCF/LEF家族的重要成員之一，是經典Wnt/β-catenin信號通路的關鍵成分。研究表明TCF3在一些分化程度較低的惡性腫瘤中表達[11]，但目前對TCF3在惡性腫瘤中的作用及機制研究較少。Lin等[11]證實TCF3可能通過下調Oct4抑制胚胎癌細胞的惡性表型。TCF3對乳腺癌組織的形成及維持癌細胞生長起著重要作用，但對乳腺癌細胞的侵襲及遷移能力無明顯影響[10]。然而，TCF3在肺癌中的作用及分子機制仍不清楚，相關的研究報道較少。

研究證實，在無Wnt信號刺激時TCF3與共阻遏因子Groucho、CtBP和HDAC等結合抑制Wnt基因轉錄[12-13]；異常的Wnt信號刺激下TCF3一方面作為β-catenin依賴的轉錄激活因子促進Wnt靶基因的轉錄激活，同時也能作為轉錄抑制因子下調Wnt靶基因的轉錄[14]。本研究結果顯示，干擾肺癌細胞系A549細胞和H1299細胞中的TCF3表達后，Wnt通路轉錄活性明顯降低，其下游靶基因c-Myc的表達明顯下調，提示TCF3在肺癌細胞的Wnt通路中起著轉錄激活的功能。可能的機制為Wnt通路激活時，大量游離的β-catenin進入細胞核，通過與Groucho/TLE競爭結合TCF3，將TCF3轉換為轉錄激活因子[15]。我們通過MTT、克隆形成實驗證實TCF3對肺癌細胞的增殖活性的影響，結果發現降低TCF3的表達使A549細胞和H1299細胞的活力和克隆形成率顯著降低。為了進一步探討TCF3影響A549和H1299細胞增殖的原因，我們運用Annexin V-FITC/PI染色和流式細胞術進行了細胞凋亡實驗，結果顯示干擾TCF3表達72 h后細胞的凋亡率明顯升高。推測TCF3可能通過調控Wnt通路下游勘基因c-Myc[16]等細胞凋亡相關基因而影響肺癌細胞的生長。

基質金屬蛋白酶基因家族在腫瘤細胞轉移過程中發揮關鍵作用[17]，MMP基因家族成員的表達與惡性腫瘤的高轉移活性密切相關[18]。研究證實MMP-1過表達能促進前列腺癌的增殖和轉移[19]。本研究觀察到下調TCF3表達顯著抑制A549細胞和H1299細胞的遷移，由此我們推測TCF3可能通過調控MMP家族基因的表達影響肺癌細胞的轉移。我們在A549和H1299細胞中的研究發現，siTCF3顯著抑制MMP-9和MMP-13蛋白的表達，促進基質金屬蛋白酶抑制因子TIMP-1的蛋白表達，提示siTCF3可能通過抑制MMP-9和MMP-13的表達抑制A549和H1299細胞的遷移能力。Western blot實驗結果發現下調TCF3表達抑制Wnt蛋白的表達，但是本研究沒有進一步證實MMP-9、MMP-13和TIMP-1表達與Wnt信號通路的關系，MMP家族成員中MMP-9、MMP-13和TIMP-1是否是Wnt通路靶基因？或者MMP通路和Wnt通路形成一種交叉網絡共同調控肺癌細胞轉移，這方面工作值得進一步研究。我們的研究發現，siTCF3顯著抑制A549和H1299細胞的增殖、遷移和誘導細胞凋亡，其分子機制可能通過下調Wnt通路活性以及調控MMP家族關鍵成員的表達而實現。提示TCF3有望成為治療肺癌的潛在靶向藥物，本研究為以TCF3為靶點研發治療肺癌的分子靶向藥物提供理論依據。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Down-regulated TCF3 expression inhibits growth and migratory abilities of non-small cell lung cancer cells

WANG Shi-meng

(DepartmentofThoracicSurgery,HezeMunicipalHospital,Heze274000,China.E-mail: 48947925@qq.com)

AIM: To investigate the effects of T-cell factor 3 (TCF3) expression on the growth and migratory abilities of the non-small cell lung cancer cells (NSCLC) and the underlying mechanisms. METHODS: The non-small cell lung cancer cells A549 and H1299 were transfected with siTCF3 or negative control siRNA (NCsiRNA) using Lipofectamine 2000. The expression of TCF3 at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blot, respectively. The activity of TCF3 transcription was measured using luciferase reporter gene assay. The cell viability, colony formation ability, migratory ability and apoptotic rate were monitored by MTT assay, colony formation assay, Transwell method and flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining, respectively. The protein expression levels of Wnt, c-Myc, matrix metalloproteinase (MMP)-9, MMP-13 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) were detected by Western blot. RESULTS: Compared with A549-NCsiRNA and H1299-NCsiRNA cells, the mRNA and protein levels of TCF3 were significantly inhibited in A549-siTCF3 and H1299-siTCF3 cells (P<0.01). The activity of TCF3 transcription and levels of c-Myc protein expression remarkably decreased as compared with NCsiRNA cells (P<0.05). The viability of A549-siTCF3 cells and H1299-siTCF3 cells cultured for 24 h, 48 h, 72 h and 96 h were notably lower than that of NCsi-RNA cells (P<0.05). The colony formation ability was significantly inhibited by siTCF3 compared with NCsiRNA cells (P<0.01). The numbers of migratory A549-siTCF3 and H1299-siTCF3 cells were significantly lower than those of A549-NCsiRNA and H1299-NCsiRNA cells (P<0.05). The apoptotic rates of A549-siTCF3 cells and H1299-siTCF3 cells were notably higher than those of A549-NCsiRNA cells and H1299-NCsiRNA cells (P<0.01). Down-regulated TCF3 expression inhibited the protein expression of Wnt, decreased the protein levels of MMP-9 and MMP-13 and enhanced the protein level of TCF3. CONCLUSION: siTCF3 suppresses the abilities of growth and migration, and induces apoptosis in A549 cells and H1299 cells by down-regulating Wnt pathway and regulating expression of key MMP family genes.

Non-small cell lung cancer; T-cell factor 3; Matrix metalloproteinases

1000- 4718(2017)02- 0289- 08

2016- 08- 11

2016- 10- 09

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.016

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△通訊作者 Tel: 0530-5613311; E-mail: 48947925 @qq.com