苦參堿通過調節單核吞噬細胞表型偏移改善博萊霉素誘導的肺纖維化*

李 鑫， 李 琦，3▲， 李 祎， 蘇程程， 周 欣， 彭守春， 魏路清△， 姬文婕△

(中國人民武裝警察部隊后勤學院 1附屬醫院呼吸與重癥醫學科， 2附屬醫院心臟醫院， 3錦州醫科大學武警后勤學院附屬醫院研究生培養基地，天津 300162)

苦參堿通過調節單核吞噬細胞表型偏移改善博萊霉素誘導的肺纖維化*

李 鑫1， 李 琦1，3▲， 李 祎1， 蘇程程1， 周 欣2， 彭守春1， 魏路清1△， 姬文婕1△

(中國人民武裝警察部隊后勤學院1附屬醫院呼吸與重癥醫學科，2附屬醫院心臟醫院，3錦州醫科大學武警后勤學院附屬醫院研究生培養基地，天津 300162)

目的： 研究苦參堿(matrine，MA)對博萊霉素(bleomycin，BLM)誘導的循環單核細胞和肺泡巨噬細胞表型偏移的調節作用。方法: 160只C57BL/6雄性小鼠隨機分為生理鹽水(NS)組、BLM組、苦參堿干預組(BLM+MA組)及溶劑對照組(BLM+NS組)，經口咽吸入法給予BLM (2.5 mg/kg)建立實驗性肺纖維化模型，對照組給予等體積NS，BLM+MA組和BLM+NS組分別在術后每天灌胃給予MA(15 mg·kg-1·d-1)或等量NS。術后第3、7、14和21天處死小鼠，采用HE染色和Masson染色觀察肺組織病理學變化及纖維化程度，采用堿水解法測定肺組織羥脯氨酸的含量，用流式細胞術分別檢測循環單核細胞亞群和支氣管肺泡灌洗液細胞表型的變化。結果: 與對照組相比，MA干預可以明顯減輕BLM誘導的小鼠肺組織炎癥反應及纖維化程度(P<0.05)；與NS組相比，BLM組的Ly6Chi單核細胞比例升高，肺泡巨噬細胞表型由M1型向M2型偏移，且與炎癥反應和纖維化程度呈現一定的相關性；MA干預后可以部分逆轉BLM誘導的循環單核細胞和肺泡巨噬細胞的表型偏移。結論: 苦參堿可以減輕BLM誘導的急性肺泡炎癥和肺纖維化程度，可能是部分通過逆轉循環單核細胞和肺泡巨噬細胞表型的偏移而實現的。

苦參堿； 肺纖維化； 單核細胞； 巨噬細胞； 博萊霉素

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種由各種病因引起的累及肺間質、肺泡或細支氣管的肺部彌漫性疾病，有病程發展不可逆、預后極差、臨床治療手段有限等特點[1]。單核吞噬細胞系統(mononuclear phagocyte system，MPS)由骨髓中的單核細胞前體細胞、血液循環中的單核細胞以及組織中由單核細胞分化而來的巨噬細胞和樹突狀細胞組成，是吞噬細胞最主要的組成部分，在機體自身免疫及抵御疾病等方面發揮重要作用[2]。本課題小組前期研究結果表明單核/巨噬細胞表型的偏移與博萊霉素(bleomycin，BLM)誘導的肺纖維化的發生發展密切相關[3-4]。

苦參堿(matrine，MA)是一種從傳統中藥苦參中分離出來的生物堿，大量證據表明MA具有抗氧化[5]、抗炎[6]及抗纖維化[7]等多種生物和藥理學作用。近年來，MA對肺纖維化的干預作用已經得到了廣泛研究[8]，但是其機制尚不清楚。本研究擬通過博萊霉素誘導的實驗性小鼠肺纖維化模型，探索苦參堿是否通過對博萊霉素誘導單核/巨噬細胞表型偏移的調控，從而干預了肺纖維化的發生發展。

材 料 和 方 法

1 動物

健康C57BL/6雄性小鼠，8～10周齡，體重18～20 g，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號為SCXK-(軍)2012-0004。小鼠常規飼養于清潔級動物房內，適應性喂養1周后進行實驗。

2 主要試劑

注射用鹽酸博萊霉素(NIPPON KAYAKU)；苦參堿(純度>98%，由武警后勤學院生藥教研室陳虹教授提供)；FITC標記的抗小鼠Ly6C抗體、PE標記的抗小鼠 CD11b抗體、7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)、PerCP/Cy5.5 標記的抗小鼠Ly6G、PE標記的抗小鼠CD206和PerCP/Cy5.5標記的抗小鼠CD64均購自BioLegend；羥脯氨酸(hydroxyproline, HYP)測定試劑盒(堿水解法，南京建成生物工程研究所)；其余試劑均為國產分析純。

3 主要方法

3.1 動物模型的制備 160只C57BL/6雄性小鼠隨機分為生理鹽水(normal saline, NS)組、BLM組、BLM+NS組和BLM+MA組。參照Lakatos等[9]經口咽吸入法建立肺纖維化模型，BLM組給予BLM(2.5 mg/kg),NS組給予等體容積無菌生理鹽水。BLM+MA組在造模后每天經口灌胃給予MA(15 mg·kg-1·d-1)，BLM+NS組給予同等容積的生理鹽水灌胃。

3.2 標本的采集及處理 分別于模型建立后第3、7、14和21天取材。首先采用乙二胺四乙酸(ethy-lene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管經下頜靜脈采集取外周靜脈血50 μL，進行循環單核細胞亞群的流式細胞術檢測。然后將小鼠輕度麻醉后摘眼球放血致死，灌洗組用1 mL預冷無菌生理鹽水行經支氣管肺泡灌洗，重復3次，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)離心后用于流式細胞術分析。未灌洗組左肺行病理學檢測；灌洗組左肺用于HYP含量的測定。

3.3 肺組織病理學檢測 根據前期研究結果[3]，選擇炎癥反應明顯的時點第3、7天進行檢測。對肺組織進行固定、脫水、透明、浸蠟及包埋處理后，切片。按常規方法進行蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色和Masson染色。參照Szapiel等[10]方法進行炎癥評分(inflammation score，IS)，取其平均值代表肺組織的炎癥程度。采用Image-Pro Plus 4.5軟件對肺間質纖維化程度進行分析，膠原容積分數(collagen volume fraction，CVF)代表肺纖維化程度，公式如下：CVF(%)=膠原面積/(圖像總面積-空白區域面積)×100%。

3.4 流式細胞術檢測循環單核細胞亞群比例變化 根據前期研究結果[3]，選擇單核細胞表型偏移明顯的時點第3、7天進行檢測。取新鮮EDTA抗凝血50 μL，按照說明書推薦劑量，加入PE-CD11b、FITC-Ly6C和PerCP/Cy5.5-Ly6G抗體及各自的同型對照抗體并混勻，24 ℃避光孵育15 min，加入紅細胞裂解液600 μL，混勻后避光靜置10 min，FC500流式細胞儀(Beckman Coulter，USA)檢測。流式細胞術設門策略參見文獻[11]。

3.5 肺泡巨噬細胞(alveolar macrophages, AMφ)表型偏移 根據前期研究結果[3]，選擇巨噬細胞表型偏移明顯的時點第3、7、14天進行檢測。用50 μL staining buffer重懸計數5×105BALF細胞，加入PerCP/Cy5.5-CD64和PE-CD206抗體，混勻后24 ℃避光孵育15 min，然后加入7-AAD，混勻后避光孵育5 min，加入600 μL staining buffer，300目尼龍濾網過濾后，流式細胞儀檢測。設門策略參見文獻[4]。

3.6 小鼠肺組織HYP含量測定 根據前期研究結果[3]，選擇肺纖維化程度最明顯的時點第21天進行檢測。按照試劑盒說明書采用堿水解法水解肺組織，氯胺T法測定肺組織HYP含量。

4 統計學處理

采用STATA 14.1軟件進行統計分析。計量資料均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Tukey’s檢驗，相關性采用Pearson相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組小鼠的肺組織病理變化觀察

如圖1所示，NS組肺組織經HE染色后在普通光學顯微鏡下可見肺泡結構基本正常，無炎性細胞浸潤和膠原纖維沉積。與NS組相比，BLM組及BLM+ NS組在第3天可見炎性細胞浸潤，部分肺間隔增厚，第7天炎癥反應加重，可見大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔塌陷。給予苦參堿干預的BLM+MA組炎性細胞浸潤及肺泡腔增厚與BLM組及BLM+NS組相比較輕，肺泡結構相對完整。第3、7天，與NS組相比，BLM組和BLM+NS組的IS增高(P<0.01)；BLM+MA組的IS低于BLM+NS組(P<0.05)。Masson染色結果顯示，NS組各時點均未見明顯膠原沉積。與NS組相比，第21天，BLM組及BLM+NS組可見大量致密的藍色膠原纖維，BLM+MA組膠原纖維減少。BLM組CVF值較NS組顯著升高(P<0.01)，BLM+MA組CVF值低于BLM+NS組(P<0.01)。

2 各組小鼠肺組織羥脯氨酸含量的變化

與NS組相比，BLM組第21天的HYP含量明顯增高(P<0.01);與BLM+NS組相比，BLM+MA組的HYP含量明顯降低(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The result of pathological staining and inflammation score (IS), collagen volume fraction (CVF), and hydroxyproline (HYP) content in the mouse lung tissues. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsNS group;#P<0.05,##P<0.01vsBLM+NS group.

圖1 苦參堿干預后各組小鼠肺組織病理染色及評分結果

3 各組小鼠循環單核細胞亞群比例的變化

流式細胞術分析結果顯示，NS組不同時點之間2種單核細胞亞群比例變化差異無統計學顯著性。與NS組相比，第 3、7天BLM組Ly6Chi的比例均升高(P<0.01)；與BLM+NS組相比，BLM+MA組第3天的Ly6Chi亞群比例降低(P<0.05)，第7天有下降趨勢,但差異無統計學顯著性。Ly6Clo單核細胞亞群比例變化趨勢與Ly6Chi相反，見圖2。

Figure 2.Matrine treatment reversed mononuclear phenotype switching induced by bleomycin. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsBLM+NS group.

圖2 苦參堿干預后各組小鼠循環單核細胞亞群的變化

4 各組小鼠肺泡巨噬細胞表型比例的變化

流式細胞術分析結果顯示，NS組不同時點之間2種巨噬細胞表型比例變化差異無統計學顯著性。與NS組相比，BLM組各時點AMφ M1的比例均降低(P<0.01)；與BLM+NS組相比，BLM+MA組第3天AMφ M1的比例變化差異無統計學顯著性，第7、14 天BLM+MA組 AMφ M1的比例均升高(P<0.01)。AMφ M2比例變化趨勢與AMφ M1相反，見圖3。

5 單核細胞亞群Ly6Chi與IS和CVF的相關關系

小鼠循環單核細胞亞群Ly6Chi在博萊霉素干預后，比例迅速升高，在炎癥反應期維持較高水平。將相同時點各組小鼠單核亞群Ly6Chi比例與相應肺組織IS，以及將變化最大的第3天小鼠單核亞群Ly6Chi比例與第21天的CVF進行相關性分析，結果如圖4所示，Ly6Chi比例與IS呈明顯正相關(r=0.6328，P<0.01)，Ly6Chi比例的變化與CVF值亦呈明顯正相關性(r=0.7857，P<0.01)。

6 M2肺泡巨噬細胞與IS和CVF的相關關系

小鼠M2肺泡巨噬細胞在博萊霉素干預后，比例升高，經MA干預后比例有所下降。將相同時點各組小鼠AMφ M2比例與相應肺組織IS，以及將變化最大的第14天小鼠AMφ M2的比例與第21天的CVF進行相關性分析，結果如圖4所示，AMφ M2比例與IS呈明顯正相關(r=0.7014，P<0.01)，AMφ M2與CVF值亦呈明顯正相關性(r=0.9326，P<0.01)。

Figure 3.Matrine treatment reversed alveolar macrophages switching induced by bleomycin. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsBLM+NS group.

圖3 苦參堿干預后各組小鼠肺泡巨噬細胞表型的變化

Figure 4.Pooled correlation analysis between mononuclear phagocytes and lung pathological changes.

圖4 Ly6Chi單核細胞亞群和M2型肺泡巨噬細胞與炎癥評分、膠原容積分數的相關性分析

討 論

在機體中，骨髓干細胞發育成單核母細胞，后者進一步分化成為前單核細胞并進入血流，在此處分化成為成熟的單核細胞，單核細胞穿過血管內皮，遷移到不同的組織，分化成為組織特異性的巨噬細胞，由于巨噬細胞是一種異質性細胞群體，不同組織甚至同一組織的巨噬細胞在表型和功能方面也存在較大差異[12-13]。由于單核/巨噬細胞具有異質性，小鼠單核細胞可分為具有抗炎作用的單核細胞Ly6Chi群和具有“巡視”功能的單核細胞Ly6Clo群[14]。巨噬細胞在不同環境刺激下分化為經典活化巨噬細胞(classically activated macrophage，CAMs/M1)和選擇性活化巨噬細胞(alternatively activated macrophage，AAMs/M2)2種極化類型。M1型細胞參與正向免疫應答，進行免疫監視；M2型細胞具有抑制炎癥的表型,同時能夠促進血管、淋巴管、肉芽組織的新生，促進組織修復[15]。本課題小組前期研究發現通過鹽皮質激素受體阻斷劑調節肺泡巨噬細胞的表型偏移能夠有效改善二氧化硅所致矽肺的早期炎癥反應及后期的肺纖維化程度[16]。

目前大量研究主要還是從抗炎及抗氧化等方面對博萊霉素誘導肺纖維化進行探討[17-19]。苦參堿在治療肺纖維化等疾病過程中也主要發揮著抗纖維化、抗炎、抗氧化等作用[20-21]，但其治療肺纖維化的具體作用機制仍不明確。本課題小組前期研究結果顯示在博萊霉素誘導的小鼠實驗性肺纖維化過程中，單核/巨噬細胞亞群隨著肺纖維化程度的發生發展呈明顯的動態變化[3]，同時發現給予螺內酯阻斷鹽皮質激素受體后減輕了早期炎癥反應及后期纖維化程度，其可能是通過降低炎癥早期快速升高的Ly6Chi單核細胞數量及抑制肺泡巨噬細胞選擇性激活實現的[11]。結合前期研究，在本研究中經MA干預后第3天肺組織的炎性細胞浸潤明顯減輕，同時發揮促炎作用的Ly6Chi群的比例也明顯低于對照組。在MA干預后，第21天肺組織CVF和HYP均低于BLM+NS組，同時發揮促纖維化作用的AMφ M2在第7、14天均低于BLM+NS組。通過相關性分析發現，Ly6Chi比例和AMφ M2比例與炎癥反應及肺纖維化程度均有一定的相關性，尤其發現第14天的AMφ M2比例與后期(第21天)肺纖維化程度密切相關。由此結果可驗證本研究假設：苦參堿發揮作用，可能是通過抑制博萊霉素致小鼠肺纖維化過程中單核細胞和巨噬細胞表型偏移，抑制Ly6Chi比例及促纖維化肺泡巨噬細胞M2的升高，進而減輕炎癥細胞滲出和膠原沉積。同時前期的Ly6Chi比例和AMφ M2比例能夠預測出后期的肺纖維化嚴重程度。

綜上所述，MA可以在一定程度上通過降低炎癥反應期的Ly6Chi表型的單核細胞的比例，和降低肺纖維化期的AMφ M2的比例，進而減輕炎癥反應和肺纖維化程度。MA通過調控單核/巨噬細胞表型治療博萊霉素誘導的肺纖維化的具體分子生物學機制有待后續進一步研究。

[1] 金曉光， 代華平， 龐寶森， 等. 博萊霉素致大鼠肺纖維化模型肺組織的動態病理變化及其發生機制 [J]. 中國病理生理雜志, 2009, 29(4):708-714.

[2] Jantsch J, Binger KJ, Muller DN, et al. Macrophages in homeostatic immune function [J]. Front Physiol, 2014, 5:146.

[3] Ji WJ, Ma YQ, Zhou X, et al. Temporal and spatial cha-racterization of mononuclear phagocytes in circulating, lung alveolar and interstitial compartments in a mouse model of bleomycin-induced pulmonary injury[J]. J Immunol Methods, 2014, 403(1-2):7-16.

[4] Xiang GA, Zhang YD, Su CC, et al. Dynamic changes of mononuclear phagocytes in circulating, pulmonary alveolar and interstitial compartments in a mouse model of experimental silicosis[J]. Inhal Toxicol, 2016, 28(9):393-402.

[5] Zhao P, Zhou R, Zhu XY, et al. Matrine attenuates focal cerebral ischemic injury by improving antioxidant activity and inhibiting apoptosis in mice[J]. Int J Mol Med, 2015, 36(3):633-644.

[6] Sun D, Wang J, Yang N, et al. Matrine suppresses airway inflammation by downregulating SOCS3 expression via inhibition of NF-κB signaling in airway epithelial cells and asthmatic mice[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016, 477(1):83-90.

[7] Yu JL, Li JH, Chengz RG, et al. Effect of matrine on transforming growth factor beta1 and hepatocyte growth factor in rat liver fibrosis model[J]. Asian Pac J Trop Med, 2014, 7(5):390-393.

[8] Ma X, Chen R, Liu X, et al. Effects of matrine on JAK-STAT signaling transduction pathways in bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J]. Afr J Tradit Complement Altern Med, 2013, 10(3):442-448.

[9] Lakatos HF, Burgess HA, Thatcher TH, et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a supe-rior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation[J]. Exp Lung Res, 2006, 32(5):181-199.

[10]Szapiel SV, Elson NA, Fulmer JD, et al. Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude, athymic mouse[J]. Am Rev Respir Dis, 1979, 120(4):893-899.

[11]Ji WJ, Ma YQ, Zhou X, et al. Spironolactone attenuates bleomycin-induced pulmonary injury partially via modulating mononuclear phagocyte phenotype switching in circulating and alveolar compartments[J]. PLoS One, 2013, 8(11):e81090.

[12]Mosser DM, Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation [J]. Nat Rev Immunol, 2008, 8(12):958-969.

[13]Wallner S, Grandl M, Konovalova T, et al. Monocyte to macrophage differentiation goes along with modulation of the plasmalogen pattern through transcriptional regulation[J]. PLoS One, 2014, 9(4):e94102.

[14]Tam JW, Kullas AL, Mena P, et al. CD11b+Ly6ChiLy6G-immature myeloid cells recruited in response toSalmonellaentericaserovar Typhimurium infection exhibit protective and immunosuppressive properties[J]. Infect Immun, 2014, 82(6):2606-2614.

[15]De Paoli F, Staels B, Chinetti-Gbaguidi G. Macrophage phenotypes and their modulation in atherosclerosis[J]. Circ J, 2014, 78(8):1775-1781.

[16]蘇程程， 張譯丹， 向國安， 等. 鹽皮質激素受體阻斷劑對SiO2誘導的肺巨噬細胞表型偏移的調節 [J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(6):1112-1117.

[17]高淑艷， 馮 濤. 丙戊酸鈉減輕博萊霉素致大鼠肺纖維化[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(3):552-556.

[18]黃新莉. 博萊霉素誘導的肺纖維化大鼠肺組織中AAT/SO2的變化[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(10):1904.

[19]彭 婷， 杜海堅， 李 理， 等. 吉非替尼通過增加Foxo3a活性抑制肺纖維化小鼠上皮-間質轉分化[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(3):444-448.

[20]Zhang B, Liu ZY, Li YY, et al. Antiinflammatory effects of matrine in LPS-induced acute lung injury in mice[J]. Eur J Pharm Sci, 2011, 44(5):573-579.

[21]凌 偉， 謝 敏， 石俊青. 苦參堿對肺成纖維細胞TGF-β1信號轉導途徑的干預作用[J]. 四川大學學報:醫學版, 2009, 40(6):994-999.

(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Matrine attenuates bleomycin-induced pulmonary injury partially via modulating mononuclear phagocyte phenotype switching in mice

LI Xin1, LI Qi1,3, LI Yi1, SU Cheng-cheng1, ZHOU Xin2, PENG Shou-chun1, WEI Lu-qing1, JI Wen-jie1

(1DepartmentofRespiratoryMedicine&IntensiveCareMedicine,2HeartCenter,3PostgraduateTrainingBaseofJinzhouMe-dicalUniversity,AffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPloiceForce,Tianjin300162,China.E-mail:ji_wenjie@hotmail.com;wei_luqing@hotmail.com)

AIM: To investigate the influence of matrine (MA) on the phenotype switching of mouse monocytes and alveolar macrophages induced by bleomycin (BLM). METHODS: All mice were randomly divided into normal saline (NS) group, BLM group, BLM+NS group and BLM+MA group. The mice were administered with BLM at 2.5 mg/kg via oropharyngeal instillation. The mice in BLM+MA group were treated with MA (15 mg·kg-1·d-1) by oral gavage following BLM administration. The mice were sacrificed on days 3, 7, 14, and 21. The lungs were removed for pathological analysis. The circulating monocyte subsets and polarization state of bronchoalveolar lavage fluid (BALF)-derived alveolar macrophages were analyzed by flow cytometry.RESULTS: The results of HE and Masson trichrome staining in BLM and BLM+NS groups exhibited classical pathological stages of lung fibrosis, including acute inflammation phase and later fibrosis phase. Compared with BLM+NS group, MA treatment alleviated the inflammatory response and the degree of fibrosis induced by BLM (P<0.05). There was a rapid change of circulating Ly6Chimonocytes and its magnitude was positively associated with the pulmonary inflammatory response. An expansion of M2-like alveolar macrophages was positively correlated with the magnitude of lung fibrosis. Moreover, MA treatment partially normalized the phenotype switching of monocytes and alveolar macrophages.CONCLUSION: Matrine treatment attenuates BLM-induced pulmonary injury partially via modulating the phenotype switching of monocytes and alveolar mocrophages.

Matrine; Pulmonary fibrosis; Monocytes; Macrophages; Bleomycin

1000- 4718(2017)02- 0322- 07

2016- 09- 05

2016- 10- 09

國家自然科學基金資助項目(No. 81102088； No. 81441101； No. 81570335)；天津市自然科學基金資助項目(No. 15JCZDJC35000)；武警后勤學院附屬醫院重點項目(No. FYZ201510； No. FYZ201605)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.021

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通信作者 姬文婕 Tel: 022-60577283； E-mail： ji_wenjie@hotmail.com； 魏路清 Tel: 022-60578671； E-mail： wei_luqing@hotmail.com

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