低表達miR-21對苦參堿誘導的肝癌HepG2細胞凋亡的影響*

羅耀玲， 黃鈾新， 賴 平， 張敏鴻

(1贛南醫學院第一附屬醫院臨床醫學研究中心， 2贛南醫學院第一附屬醫院核醫學科, 3贛南醫學院，江西 贛州 341000)

低表達miR-21對苦參堿誘導的肝癌HepG2細胞凋亡的影響*

羅耀玲1， 黃鈾新2， 賴 平3， 張敏鴻1

(1贛南醫學院第一附屬醫院臨床醫學研究中心，2贛南醫學院第一附屬醫院核醫學科,3贛南醫學院，江西 贛州 341000)

目的： 探討miR-21低表達能否增強苦參堿(matrine，MAT)對肝癌細胞的促凋亡作用。方法: 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測不同濃度MAT作用HepG2細胞后miR-21的表達情況。流式細胞術檢測miR-21低表達對MAT誘導的細胞凋亡的影響；RT-qPCR和Western blot檢測miR-21低表達對MAT誘導的細胞凋亡中Bcl-2和Bax mRNA和蛋白表達水平的影響。結果: miR-21表達量隨MAT作用濃度的增加而增加；miR-21低表達可促進MAT誘導的細胞凋亡,并促進Bax mRNA和蛋白的表達(P<0.05)，而抑制Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(P<0.05)。結論: miR-21低表達可通過抑制Bcl-2和促進Bax的表達來增強MAT誘導的HepG2細胞凋亡。

miR-21； 苦參堿； HepG2細胞； 細胞凋亡

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是危害我國居民健康的主要惡性腫瘤之一，每年新發病例超過 40 萬，且發病仍呈上升趨勢[1]，目前仍未有滿意的治療方法。近年來，從中藥中提取的抗癌藥物因其抗腫瘤作用確切，副作用小而受到國內外研究的關注。苦參堿(matrine，MAT)是傳統中藥苦參的有效成分，具有多方面的腫瘤抗性機制，主要包括抑制腫瘤細胞增殖、浸潤、轉移和誘導腫瘤細胞凋亡等[2-3]。

肝癌的微小RNA(microRNA，miRNA，miR)調控機制表明，miRNA既可直接參與細胞凋亡或細胞周期的調節，也可通過調節癌基因和(或)抑癌基因來參與HCC的發生[4]。近期研究發現miRNA 亦參與到中藥抗腫瘤作用過程中[5-6]，但其作用方式和機制還不是很清楚。本課題組在研究苦參堿誘導肝癌細胞株HepG2凋亡時發現，苦參堿可致miR-21表達上調。由此推測，miR-21可能參與了苦參堿誘導的肝癌細胞凋亡。本研究將驗證這一推測并初步探討miR-21參與調控苦參堿誘導的肝癌細胞凋亡的分子機制。

材 料 和 方 法

1 試劑

苦參堿(索萊寶);化學合成修飾的miR-21抑制物(inhibitor, In)片段(In-miR-21)及其陰性對照(negative control, NC)片段由上海吉瑪合成；Lipofectamine 2000(Invitrogen)；細胞周期凋亡檢測試劑盒(BD)；TRIzol試劑(北京雷根)；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(上海吉瑪)；抗β-actin、Bcl-2、Bax和IgG抗體(中杉金橋)。

2 方法

2.1 細胞培養與轉染 人肝癌細胞系HepG2(本室保存)培養于含10%胎牛血清(四季青)的RPMI-1640培養液(Gibco)中，所有實驗用細胞均處于對數生長期，存活率大于95%。細胞于轉染前1 d接種，待密度達50%左右進行轉染實驗，采用Lipofectamine 2000將In-miR-21及NC轉入HepG2細胞中，4 h換完全培養基培養，具體操作按照說明書進行。并通過RT-qPCR驗證轉染效果。

2.2 RT-qPCR檢測miR-21在不同濃度苦參堿作用的HepG2細胞中的表達 取對數生長期細胞，常規消化后按每孔2×105個接種于6孔培養板，第2天棄培養液，分別加入含新鮮配制的終濃度為0、0.25、0.5、0.75和1 g/L苦參堿的完全培養基，培養24 h后收集細胞，采用TRIzol提取總RNA，為了提到小RNA,加入異丙醇后-70 ℃放置過夜；以miR-21和U6的逆轉錄引物進行逆轉錄和實時熒光定量PCR。逆轉錄引物以及miR-21的PCR引物均由上海吉瑪合成。PCR反應條件為95 ℃ 3 min; 95 ℃ 12 s, 62 ℃ 40 s，40個循環。所有樣本均做3個復孔，并設陰、陽性對照組。以U6為內參照，數據采用相對定量法，以2-ΔΔCt法來進行分析。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期細胞，按每孔2×105個接種于6孔培養板，第2天轉染，分未轉染(non-transfection, NT)組、陰性片段轉染組(NC組)及miR-21 inhibitor轉染組(In-miR-21組)；于轉染5 h后棄培養液，并加入含新鮮配制的終濃度為0.75 g/L苦參堿(增殖抑制率為40%)的完全培養基，繼續培養24 h后收集各孔細胞(死細胞與活細胞都收集)，PBS洗2遍，然后用1×Annexin結合液調整濃度至1×109/L，從中取100 μL加5 μL Annexin V和5 μL PI(100 mg/L)，室溫避光作用15 min，加入400 μL 1×Annexin結合液，上流式細胞儀檢測。

2.4 RT-qPCR檢測不同處理組中Bcl-2和Bax的 mRNA表達 采用TRIzol提取不同處理組細胞中的總RNA。Bcl-2的上游引物為5’-GGAGAGGGTCACAAATCCTAAA-3’，下游引物為5’-TGCCACAGA GTTATTCCATCAA-3’；Bax的上游引物為5’-ATGGGCTGG ACATTGGACT-3’，下游引物為5’-GGGCAGAAGGCACTAATCAAG-3’；β-actin的上游引物為5’-TATCCAGGCTGTGCTATCCC-3’，下游引物為5’-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3’。PCR條件和數據分析同2.2。

2.5 Western blot檢測不同處理組中Bcl-2和Bax的蛋白表達水平 用蛋白裂解液冰上裂解各組細胞30 min，然后12 000 r/min離心5 min，上清即為總蛋白。用BCA定量試劑盒定量后進行SDS-PAGE(各組總蛋白上樣量均為30 μg)分離蛋白并電轉PVDF膜，通過封閉液封閉、Ⅰ 抗孵育、洗滌膜、Ⅱ 抗孵育、洗滌膜的過程，最后ECL顯影，Bio-Rad凝膠成像儀上拍照，并做灰度分析。

3 統計學處理

將所得實驗數據經SPSS 16.0統計學軟件分析，結果以均數±標準差(mean±SD)表示，多個樣本均數間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 miR-21在In-miR-21轉染組與非轉染組中的表達比較

RT-qPCR結果表明，與非轉染組和陰性對照轉染組相比，轉染了miR-21抑制劑的組中miR-21的表達量明顯降低(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The relative expression levels of miR-21 in the HepG2 cells transfected with In-miR-21. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNT or NC.

圖1 miR-21在非轉染組、陰性轉染組和In-miR-21轉染組中的相對表達量

2 miR-21在不同濃度苦參堿作用的HepG2細胞中的表達比較

RT-qPCR結果表明，苦參堿作用HepG2細胞24 h后，隨著苦參堿濃度的增加，miR-21的表達亦不斷增加，當苦參堿濃度達到0.75 g/L以上時，與未加藥組相比，miR-21的表達顯著增加(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The relative expression of miR-21 in the HepG2 cells treated with different concentrations of matrine. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 g/L group.

圖2 miR-21在不同濃度苦參堿作用中的相對表達量

3 In-miR-21促進MAT誘導的細胞凋亡

miR-21是癌基因，可抑制細胞凋亡。為了了解低表達miR-21能否促進MAT誘導的細胞凋亡，我們采用Annexin V/PI雙染法檢測In-miR-21對MAT誘導的細胞凋亡的影響。定量分析凋亡百分比結果顯示MAT誘導的細胞凋亡率與對照組相比明顯增高(P<0.01)，與MAT處理的NC組相比無差異;In-miR-21與MAT共同處理后，細胞凋亡百分比明顯升高(P<0.05)，見圖3。這說明低表達miR-21可協同MAT促進細胞凋亡。

4 In-miR-21對MAT誘導的細胞凋亡中Bcl-2和Bax mRNA表達的影響

為了探討miR-21低表達后促進苦參堿誘導的細胞凋亡的機制，利用RT-qPCR檢查Bcl-2和Bax的mRNA表達情況。結果顯示NT+MAT組、NC+MAT組和In-miR-21+MAT組與NT組相比，Bcl-2 mRNA表達水平均降低(P<0.05)，而Bax的mRNA表達水平均升高(P<0.05)；In-miR-21+MAT組與NC+MAT組相比，Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)，而Bax的mRNA表達水平顯著升高(P<0.01), 見圖4。

5 In-miR-21對MAT誘導的細胞凋亡中Bcl-2和Bax蛋白的影響

灰度值統計分析結果表明各處理組與NT組相比，Bcl-2蛋白的表達水平均降低(P<0.05)，而Bax蛋白表達水平均升高(P<0.05)；In-miR-21+MAT組與NC+MAT組相比，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，而Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，見圖5。

Figure 3.In-miR-21 promoted MAT-induced HepG2 cell apoptosis. Mean±SD.n=3.◆P<0.05vsNT;*P<0.05vsNC+MAT.

圖3 In-miR-21促進MAT誘導的HepG2細胞凋亡

Figure 4.The effect of In-miR-21 on the mRNA expression of Bcl-2 and Bax in the HepG2 cells detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNT;##P<0.01vsNC+MAT.

圖4 In-miR-21對MAT誘導的HepG2細胞 Bcl-2和Bax mRNA表達的影響

Figure 5.The effect of In-miR-21 on the protein expression of Bcl-2 and Bax in the HepG2 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNT;##P<0.01vsNC+MAT.

圖5 In-miR-21對MAT誘導的HepG2細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

討 論

肝癌的治療目前仍然是以手術、放療和化療為主，總的5年生存率不高，且預后差。為此，人們不斷尋找各種新的治療方法，如干細胞療法[7]、生物免疫療法[8]、基因(包括miRNA)干預[9-10]、中藥療法等。近年來研究表明中藥可通過多種機制來影響腫瘤的生長、代謝過程，還可以對機體免疫力、內分泌等進行調控；起到了抑制腫瘤生長，減輕化療藥物的毒副作用，提高機體的免疫力的作用，從而提高腫瘤患者的生存周期和質量[11-13]。本課題組研究的苦參堿對肝癌亦具有較好的抗瘤效果，0.75 g/L苦參堿對HepG2細胞的增殖抑制率為40%(MTT實驗得出,本文未列出該結果)。

miRNA是一種長度為 18～25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，通過與靶基因的 3’端不完全或完全配對，進而在轉錄后水平發揮負調控靶基因表達的作用。miR-21是第1個在人類基因組中發現的 miRNA，位于17q23.2；是唯一在所有惡性腫瘤中高表達的 miRNA，被公認為一個致癌性小RNA[14]。眾多研究表明miR-21的表達增加會抑制細胞的凋亡而促進細胞增殖[15-16]。近期研究發現miRNA 亦參與到中藥抗腫瘤作用過程中，如Zhang等[5]發現在人非小細胞肺癌A549細胞中miR-21可通過下調PTEN抑制姜黃素的抗癌活性。PTEN是抑癌基因，已證實是miR-21的下游靶基因；當miR-21表達升高可降低PTEN的表達，使得PTEN/AKT信號通路持續活化，進而促進細胞增殖，減少凋亡。本實驗結果發現miR-21在苦參堿抗凋亡過程中隨苦參堿作用濃度的增加而表達增加。由此課題組猜想，降低miR-21的表達，能否增加苦參堿的抗凋亡作用呢？Annexin V/ PI流式結果表明，當降低HepG2細胞中miR-21的量時，與對照組相比，苦參堿抗凋亡的作用增強。

細胞凋亡是基因控制的細胞自主的有序的死亡過程。它涉及一系列基因的激活、表達和調控，尤其是對促凋亡基因和抑凋亡基因的調控。Bax是最常見的促凋亡基因，Bcl-2是最常見的抑凋亡基因，Bcl-2/Bax比率是啟動細胞凋亡的“分子開關”[17]。亦有研究表明Bcl-2是miR-21的一個靶基因[18]，因此本實驗選用它們作為細胞凋亡機制的初步研究。RT-qPCR和Western blot實驗結果表明miR-21低表達后，可促進苦參堿作用組中Bax mRNA和蛋白水平的表達，而抑制Bcl-2 mRNA和蛋白水平的表達。可見細胞中miR-21表達降低，可增加苦參堿誘導肝癌細胞的凋亡作用。

目前，miRNA在中藥抗腫瘤中的作用研究較少，miRNA在其中的調控機制亦不是很清楚。本課題的初步研究發現，miR-21參與了苦參堿抗腫瘤凋亡過程，過表達miR-21可抑制凋亡，而降低miR-21的表達則可促進腫瘤細胞的凋亡。通過本實驗，將為中藥的miRNA調控機制提供理論依據，同時也為中藥與miRNA聯合治療提供實驗依據。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of low expression of miR-21 on apoptosis of HepG2 cells induced by matrine

LUO Yao-ling1, HUANG You-xin2, LAI Ping3, ZHANG Min-hong1

(1ResearchCenterofClinicalMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,2DepartmentofNuclearMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,3GannanMedicalUniversity,Ganzhou341000,China.E-mail: 15970794928@163.com)

AIM: To explore whether miR-21 low expression enhances the effect of matrine (MAT) on the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.METHODS: Real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) was used to detect the expression of miR-21 in the HepG2 cells treated with different concentrations of MAT. The effect of miR-21 on MAT-induced HepG2 cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The mRNA and protein expression of Bcl-2 and Bax in the HepG2 cells treated with MAT was determined by RT-qPCR and Western blot. RESULTS: The expression of miR-21 increased with the increasing concentration of MAT. Low expression of miR-21 promoted MAT-induced apoptosis, and enhanced the expression of Bax at mRNA and protein levels (P<0.05), while inhibited the expression of Bcl-2 at mRNA and protein levels (P<0.05). CONCLUSION: Low expression of miR-21 enhances MAT-induced HepG2 cell apoptosis by inhibiting the expression of Bcl-2 and promoting Bax expression.

miR-21; Matrine; HepG2 cells; Apoptosis

1000- 4718(2017)02- 0284- 05

2016- 09- 12

2016- 11- 05

贛南醫學院校級課題 (No. YB201402)

R730.20； R730.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.015

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