組蛋白乙?；揎検Ш庠诒侥I上腺素誘導小鼠心肌肥厚中的調控作用*

彭 昌， 羅孝美， 李 碩， 孫慧超

(遵義醫學院 1附屬醫院兒內科， 2基礎醫學院生理教研室，貴州 遵義 563000； 3重慶醫科大學附屬兒童醫院心內科，重慶 400010)

組蛋白乙?；揎検Ш庠诒侥I上腺素誘導小鼠心肌肥厚中的調控作用*

彭 昌1△， 羅孝美2， 李 碩1， 孫慧超3

(遵義醫學院1附屬醫院兒內科，2基礎醫學院生理教研室，貴州 遵義 563000；3重慶醫科大學附屬兒童醫院心內科，重慶 400010)

目的： 探討苯腎上腺素誘導小鼠心肌肥厚的組蛋白乙酰化調控機制，為防治肥厚性心肌病提供新的思路。方法: 選取健康C57BL/6小鼠，苯腎上腺素皮下注射建立小鼠心肌肥厚模型，實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time PCR)和染色質免疫共沉淀技術(chromatin immunoprecipitation, ChIP)分別檢測心臟核轉錄因子GATA結合蛋白4(GATA binding protein 4, GATA4) mRNA表達水平及其啟動子區組蛋白H3第27位賴氨酸乙?；?H3K27ac)水平，Western blot檢測小鼠心肌組織組蛋白H3K27ac、心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)及α-肌球蛋白重鏈(α-myosin heavy chain, α-MHC)的表達，HE染色及超聲心動圖觀察小鼠心肌肥厚。結果: Western blot及ChIP-qPCR表明小鼠心肌組織組蛋白H3K27ac水平及GATA4啟動子區組蛋白H3K27ac水平在苯腎上腺素組顯著高于生理鹽水對照組(P<0.05)，GATA4及ANP的表達水平在苯腎上腺素組也顯著高于生理鹽水對照組(P<0.05)；而組蛋白乙?；敢种苿┢針渌崮軌蚪档捅侥I上腺素誘導的組蛋白H3K27的高乙?；?，且GATA4 mRNA及ANP蛋白的表達水平在漆樹酸處理組也顯著降低(P<0.05)；HE染色及超聲心動圖顯示苯腎上腺素能夠降低左室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)和左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)并增加左室后壁(left ventricular posterior wall，LVPW)厚度,誘導小鼠心肌肥厚，而漆樹酸能夠提高LVESD和LVEDD并降低LVPW厚度，從而改善小鼠心肌肥厚。結論: 組蛋白乙?；揎検Ш鈪⑴c了苯腎上腺素誘導的小鼠心肌肥厚，而組蛋白乙酰化酶抑制劑漆樹酸能夠下調苯腎上腺素誘導的組蛋白高乙?；M而改善小鼠心肌肥厚。

苯腎上腺素； 心肌肥厚； 高乙酰化

肥厚性心肌病是臨床中較為常見的心肌病，目前尚無確實有效的治療方法，其最重要的病變在于心肌重塑和心肌肥厚及其由此誘發的心力衰竭。心肌肥厚是一個復雜的病理生理過程，多種因素均參與其中[1-3]。研究表明[4-6]，表觀遺傳調控在心肌重塑及心肌肥厚中發揮了關鍵的調控作用。本課題組前期研究發現[7]，組蛋白乙?；揎検Ш鈪⑴c了孕期酒精暴露致胎鼠心肌肥厚的發生發展。但臨床中引起心肌肥厚的常見因素并不是飲酒，苯腎上腺素(phenylephrine，PE)是誘導心肌肥厚模型的常用藥物，但其導致心肌肥厚的機制并不完全清楚。因此，本實驗通過苯腎上腺素誘導小鼠心肌肥厚模型，從表觀遺傳的全新角度探討組蛋白乙酰化調控在心肌肥厚中的作用，為尋求肥厚性心肌病的有效治療方案提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 材料

染色質免疫共沉淀(chromatin immunoprecipita-tion，ChIP)試劑盒購于Merck Millipore；ChIP級抗組蛋白H3第27位賴氨酸乙?；?H3 lysine 27 acetylation, H3K27ac)單克隆抗體、抗心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)多克隆抗體和抗α-肌球蛋白重鏈(α-myosin heavy chain, α-MHC)單克隆抗體購于Abcam；熒光定量PCR試劑盒及逆轉錄試劑盒購于TaKaRa；SDS-PAGE凝膠試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司，總RNA提取試劑盒購于北京百泰克生物技術有限公司。

2 方法

2.1 實驗動物分組、建模及標本制備 選取8～10周SPF級C57BL/6小鼠(由重慶醫科大學動物中心提供)，隨機分為6組：正常(normal)組、生理鹽水組(normal saline，NS)、PE組、PE+二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)組、PE+漆樹酸(anacardic acid，AA)組和AA組。苯腎上腺素組每次給予苯腎上腺素20 mg/kg皮下注射(每天2次)，連續皮下注射1個月建立心肌肥厚模型；苯腎上腺素+漆樹酸組除給予苯腎上腺素外，另給予漆樹酸(DMSO稀釋)5 mg/kg腹腔注射(每周2次)，連續注射1個月，其它對照組給予相應劑量的生理鹽水注射。小鼠分籠飼養，自由進食飲水。建模成功后，二氧化碳麻醉處死小鼠，75%乙醇消毒剖開胸腔分離心臟，放入-80 ℃冰箱保存備用。

2.2 ChIP 取小鼠心臟組織50 mg，將其剪碎，預冷PBS清洗后加入終濃度為1%的甲醛交聯15 min后勻漿。超聲破碎儀將DNA切割至200 ～1 000 bp之間。加入ChIP級抗H3K27ac抗體4 ℃搖床過夜沉淀DNA，65 ℃逆轉交聯8～10 h，純化并回收DNA。用核酸蛋白測定儀測定A260/A280比值，以確定ChIP后DNA的純度和濃度，于-20 ℃保存。

2.3 ChIP-qPCR 選取GATA4基因外顯子5’端前1 000 bp序列，針對該序列設計特異性引物。引物用Primer Premier 5.0 軟件設計，由寶生物公司合成。將GATA4基因產物進行梯度稀釋，運用Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR儀擴增，做出標準曲線，得到R2值和擴增效率。GATA4的上游引物序列為5’-TCTTCCACTTCCACACGTACCAA-3’，下游引物序列為5’-CAGAGGGAGTTGGGAGACGTAG-3’，產物大小為158 bp。反應條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s、59 ℃ 15 s、68 ℃ 20 s，45個循環。所得數據用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀自帶基于Pfaffl原理的相對定量數據分析軟件分析。

2.4 Real-time PCR 針對GATA4基因CDS核心編碼區設計特異性引物，引物用Primer Premier 5.0 軟件設計，由寶生物公司合成。將GATA4基因產物進行梯度稀釋，運用Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR儀擴增，做出標準曲線，得到R2值和擴增效率。GATA4的上游引物序列為5’-TGCCAACTGCCAGACTACCAC-3’，下游引物序列為5’-TCAGGTTCTTGGGCTTCCGT-3’，產物大小132 bp。反應條件為95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s, 59 ℃ 30 s, 39個循環。選取β-actin作為內參照。

2.5 Western blot檢測H3K27ac、ANP和α-MHC的蛋白表達 提取小鼠心肌組織胞漿蛋白和核蛋白，8%或12%SDS-PAGE凝膠分離蛋白，PVDF膜半干轉膜后，5%脫脂牛奶封閉1 h分別加入兔來源抗H3K27ac、ANP和α-MHC單克隆抗體(稀釋比例為1∶1 000)及GAPDH兔來源多克隆抗體(Abcam;稀釋比例為1∶5 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次15 min，然后加入HRP標記山羊抗兔的Ⅱ抗(北京中杉金橋公司; 1∶5 000)脫色搖床上孵育2 h，TBST洗滌3次，每次15 min，運用Bio-Rad圖像分析儀進行圖像掃描；采用Quantity One 4.4軟件進行分析。

2.6 超聲心動圖及HE染色 10 %水合氯醛腹腔麻醉小鼠后，運用Vevo 770超聲儀行小鼠心臟左室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)、左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)、左室收縮末期后壁(left ventricular end-systolic posterior wall，LVESPW)厚度和左室舒張末期后壁(left ventricular end-diastolic posterior wall，LVEDPW)厚度檢查。超聲結束后剖開胸腔，取出心臟，置于4 %多聚甲醛溶液中4 ℃固定48 h切片進行HE染色。

3 統計學處理

采用SPSS 23.0統計軟件包進行統計學分析。所有數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較應用單因素方差分析，組間均數比較應用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 漆樹酸逆轉苯腎上腺素誘導的小鼠心肌組織中組蛋白H3K27高乙酰化

Western blot實驗結果顯示：小鼠心肌組織中組蛋白H3K27ac的水平在苯腎上腺素組顯著高于生理鹽水組，兩者相比差異有統計學意義(P<0.05)，而漆樹酸處理組組蛋白H3K27ac水平則顯著低于苯腎上腺素組(P<0.05)，見圖1。

2 漆樹酸逆轉GATA4啟動子區苯腎上腺素誘導的組蛋白H3K27高乙酰化

ChIP-qPCR結果表明，心臟核轉錄因子GATA4啟動子區組蛋白H3K27ac水平在苯腎上腺素組高于生理鹽水組，差異具有統計學意義(P<0.01)，而漆樹酸能夠顯著降低心臟核轉錄因子GATA4啟動子區組蛋白H3K27ac水平(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The level of H3K27ac in the myocardial tissues of the mice with different treatments. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsPE group.

圖1 小鼠心肌組織組蛋白H3K27ac水平的比較

Figure 2.The expression of H3K27ac in the promoter ofGATA4 detected by ChIP using anti-H3K27ac antibody. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsPE group.

圖2 用H3K27ac抗體進行ChIP檢測心臟轉錄因子GATA4啟動子區組蛋白H3K27ac的表達

3 漆樹酸下調苯腎上腺素誘導的心臟核心轉錄因子GATA4 mRNA過表達

Real-time PCR實驗結果顯示，在小鼠心肌組織中心臟核心轉錄因子GATA4的mRNA表達水平在苯腎上腺素組處理組顯著高于生理鹽水組，2組相比差異有統計學意義(P<0.05)，而漆樹酸+苯腎上腺素組GATA4的mRNA表達量顯著低于苯腎上腺素組(P<0.05)。但漆樹酸+正常組GATA4的mRNA表達水平與正常組之間的差異并沒有統計學顯著性，見圖3。

4 漆樹酸下調苯腎上腺素誘導的心肌肥厚標志物ANP蛋白的過表達

Western blot實驗結果顯示：心肌肥厚相關基因ANP的表達量在苯腎上腺素組顯著高于生理鹽水組，2組相比差異有統計學意義(P<0.05)；漆樹酸處理后的苯腎上腺素組ANP表達量顯著低于苯腎上腺素組，差異有統計學意義(P<0.05)。而α-MHC的表達水平在苯腎上腺素組及漆樹酸+苯腎上腺素組均沒有明顯變化，見圖4。

Figure 3.The mRNA expression of heart nuclear transcription factor GATA4 in the mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsPE group.

圖3 小鼠心臟核轉錄因子GATA4的mRNA表達

5 漆樹酸改善苯腎上腺素誘導的小鼠心肌肥厚

HE染色組織切片的觀察結果表明，苯腎上腺素處理組小鼠心臟出現明顯的心肌肥厚，尤其以左心室及室間隔明顯，而漆樹酸處理組可以部分改善苯腎上腺素誘導的小鼠心肌肥厚。同時，小鼠心臟超聲心動圖發現： LVESD和LVEDD在苯腎上腺素組低于生理鹽水組，而漆樹酸能夠部分提高LVESD和LVEDD。同時，超聲心動圖發現在心臟的收縮末期和舒張末期小鼠LVPW厚度在苯腎上腺素組均較生理鹽水對照組明顯增厚。此外，小鼠的心臟指數(心臟重量/體重，heart weight/body weight，HW/BW)在苯腎上腺素組也顯著高于生理鹽水對照組，而漆樹酸能夠減低左室壁厚度及改善心臟指數，見圖5、表1。

Figure 4.The expression of ANP and α-MHC in the myocardial tissues of the mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsPE group.

圖4 小鼠心肌組織中ANP及α-MHC蛋白表達量的比較

討 論

心肌肥厚是多種心臟疾患的病理過程，是發展為心功能不全或心衰的一個必經階段[8]。目前對其發生發展的機理并不十分清楚，且尚無有效的治療手段[9]。研究發現多種因素均參與了該病理過程的發生發展。近年研究證實表觀遺傳修飾參與了這一病理過程，但表觀遺傳學研究內容較為廣泛，而其中的組蛋白乙?；揎検潜容^重要的一種翻譯后調控方式[10-11]。因此，本課題組通過苯腎上腺素誘導小鼠心肌肥厚模型從表觀遺傳學的組蛋白乙?；揎椀娜陆嵌忍接懶募》屎竦陌l生機理。

本研究結果發現在苯腎上腺素誘導的小鼠心肌肥厚模型中，組蛋白H3K27ac水平顯著高于生理鹽水對照組，且心臟核轉錄因子GATA4啟動子區域的組蛋白H3K27ac水平在苯腎上腺素組也顯著增高。國內外研究[12-13]表明心臟核轉錄因子GATA4在心肌肥厚過程中發揮了重要作用，是一個心肌肥厚的關鍵轉錄因子；本實驗結果也發現苯腎上腺素處理小鼠心肌組織中GATA4的mRNA表達水平也是顯著高于生理鹽水對照，且變化水平與組蛋白H3K27ac水平相一致。轉錄水平的變化并不代表最終下游結構基因的變化。ANP是目前較為公認的心肌肥厚標志物[14-15]。因此，我們進一步檢測了ANP的蛋白表達水平，免疫印跡結果發現ANP的蛋白表達水平在心肌肥厚小鼠中也明顯增高，而心臟結構蛋白α-MHC在同樣的心肌樣品中并沒有顯著變化，表明α-MHC并沒有參與苯腎上腺素誘導小鼠心肌肥厚的過程。上述結果提示組蛋白H3K27乙?；揎検Ш饨閷У男募》屎裣嚓P基因的表達異常可能參與了心肌肥厚這一病理過程。但是組蛋白修飾位點繁多(如H3K4、H3K9等)，其它位點的修飾是否也參與了苯腎上腺素誘導的心肌肥厚尚有待進一步研究。

Figure 5.The images of HE staining and echocardiography in the heart of the mice.

圖5 小鼠心臟HE染色及超聲心動圖的觀察

表1 小鼠超聲心動圖及心臟指數比較

*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsPE group.

為了進一步證實組蛋白乙?；揎検Ш鈪⑴c了心肌肥厚的發生發展，組蛋白乙酰化酶特異性抑制劑漆樹酸被用于干預苯腎上腺素處理小鼠，結果表明漆樹酸處理組小鼠組蛋白H3K27ac水平及GATA4、ANP表達水平與苯腎上腺素組相比均明顯降低。與國外報道的組蛋白乙?；敢种苿┙S素能夠逆轉心肌肥厚相一致[16]。同時，本研究還從組織切片及心臟功能方面探討了漆樹酸對心肌肥厚的影響，HE染色及超聲心動圖結果表明組蛋白乙?；敢种苿┢針渌崮軌蝻@著改善小鼠心臟左室后壁厚度及LVESD和LVEDD，進一步表明組蛋白乙酰化修飾失衡參與了苯腎上腺素誘導的小鼠心肌肥厚的發生，提示組蛋白乙?；敢种苿┢針渌峥梢宰鳛樾募》屎穹乐蔚暮蜻x藥物之一。但該組蛋白乙酰化修飾的上游信號通路及哪些組蛋白乙?；傅膩喰蛥⑴c了心肌肥厚的發生仍不十分清楚，尚有待進一步研究明確。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Role of histone acetylation modification imbalance in regulation of cardiac hypertrophy induced by phenylephrine

PENG Chang1, LUO Xiao-mei2, LI Shuo1, SUN Hui-chao3

(1DepartmentofPediatrics,TheAffiliatedHospital,2DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,China;3DepartmentofHeartCenter,Children’sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China.E-mail:pengchang_2006@126.com)

AIM: To investigate the regulatory mechanism of histone acetylation on cardiac hypertrophy induced by phenylephrine, and to provide a new idea for preventing and curing hypertrophic cardiomyopathy.METHODS: Phenylephrine was given by continuous subcutaneous injection for modeling cardiac hypertrophy in C57BL/6 mice. The le-vel of histone H3 lysine 27 acetylation (H3K27ac) in the promoter of cardiac nuclear transcription factorGATA4 and the mRNA expression of GATA4 were identified by chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time PCR, respectively. Meanwhile, the protein expression of histone H3K27ac, atrial natriuretic peptide (ANP) and α-myosin heavy chain (α-MHC) was determined by Western blot. Cardiac hypertrophy in the mice was observed by HE staining and echocardiography. RESULTS: The results of Western blot showed that the level of histone H3K27ac in phenylephrine group was significantly increased compared with normal saline group (P<0.05), and ChIP-qPCR data showed that the level of histone H3K27ac in the promoter ofGATA4 was increased significantly in the same samples (P<0.05). The expression levels of GATA4 mRNA and ANP protein in phenylephrine group were apparently increased compared with normal saline group (P<0.05). However, histone acetylase inhibitor anacardic acid attenuated histone H3K27 hyperacetylation induced by phenylephrine, and downregulated the over-expression of GATA4 and ANP in the heart of the mice (P<0.05). HE staining and echocardiography data showed that phenylephrine apparently increased left ventricular posterior wall thickness and decreased left ventricular end-systolic diameter and left ventricular end-diastolic diameter, while anacardic acid also reversed these indexes that mentioned above and attenuated cardiac hypertrophy induced by phenylephrine in the mice.CONCLUSION: Histone acetylation modification imbalance is involved in cardiac hypertrophy induced by phenylephrine, and the histone acetylase inhibitor anacardic acid decreases histone hyperacetylation induced by phenylephrine and attenuates car-diac hypertrophy in the mice.

Phenylephrine; Cardiac hypertrophy; Hyperacetylation

1000- 4718(2017)02- 0227- 06

2016- 08- 30

2016- 11- 23

國家自然科學基金資助項目(No. 81560040)；遵義醫學院博士啟動基金資助項目(院字(2015)4號)；遵義醫學院與科技學院大學生創新訓練項目(遵醫科院【2015】3108號)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.006

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