擬交感效應對快速起搏離體心臟心房縫隙連接蛋白43重構的影響*

舒成霖， 何 燕△， 曾志羽， 何 濤， 李金軼， 黃偉強， 許 鍵， 黃艷群

(廣西醫科大學第一附屬醫院 1老年心血管內科， 2心電診斷科， 3心血管病研究所，廣西 南寧 530021)

擬交感效應對快速起搏離體心臟心房縫隙連接蛋白43重構的影響*

舒成霖1， 何 燕1△， 曾志羽1， 何 濤2， 李金軼3， 黃偉強3， 許 鍵1， 黃艷群1

(廣西醫科大學第一附屬醫院1老年心血管內科，2心電診斷科，3心血管病研究所，廣西 南寧 530021)

目的： 通過建立離體擬交感心房顫動模型，探討縫隙連接蛋白43(Cx43)水平的變化。方法: 15只雜種犬隨機分為3組(每組5只):對照組(control組)、快速心房起搏組(RAP組)和異丙腎上腺素灌流+快速心房起搏組(ISO+RAP組)。經胸骨正中切開術，快速取出心臟，建立心臟Langendorff離體灌流模型。各組分別檢測心房有效不應期(AERP)及房顫誘發率，免疫組化檢測酪氨酸羥化酶(TH)在細胞內的表達，Western blot 檢測Cx43和磷酸化Cx43的蛋白含量，免疫熒光檢測Cx43在心肌組織的變化，TUNEL法檢測心肌細胞凋亡，熒光比色法檢測線粒體活性氧簇(ROS)的生成量。結果: 與control組比較，RAP組的AERP無明顯變化，且僅出現電紊亂， ISO+RAP組的AERP明顯縮短(P<0.05)，并可成功誘發房顫。與control組比較，RAP組和ISO+RAP組的TH表達量、細胞凋亡指數和線粒體ROS生成量均逐漸增多(P<0.05)，Cx43蛋白表達量和磷酸化水平逐漸減少(P<0.05)。免疫熒光顯示，與control組相比，RAP組的Cx43熒光強度降低，且呈明顯側鏈化，ISO+RAP組則呈點狀散在分布。結論: 交感神經可能通過氧化應激效應，引起Cx43的重構與下調，從而介導心房顫動的發生。

交感神經； 縫隙連接蛋白 43； 心房顫動； 氧化應激； 自噬

縫隙連接蛋白是維持細胞與細胞間連接與通信的結構，它可以允許小分子如ATP、cAMP、IP3、葡萄糖等通過。在心臟中，縫隙連接蛋白介導心肌細胞之間的電偶聯，形成細胞通路，使引起同步收縮的電激動有序傳播[1]。其中，縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)在心肌中表達最豐富。心房顫動(atrial fibrillation，AF)是臨床上最常見的房性心律失常。自主神經張力的改變和神經重構是房顫發生和維持的重要因素。研究表明交感神經與房顫的發生密切相關[2]，但其內在機制目前尚不十分明確。已有的臨床資料表明，房顫患者縫隙連接蛋白43表達量與正常對照組相比表達有升有降[3]。本研究旨在運用離體灌流技術，在脫離機體神經體液影響的情況下，構建擬交感房顫模型，并在此基礎上探討Cx43的變化情況。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及主要試劑

實驗雜種幼犬15只，雌雄不分，體重在2～3 kg。異丙腎上腺素(isoprenaline, ISO)注射液、戊巴比妥鈉粉劑、肝素鈉注射液、改良臺氏液(北京索來寶)；分子探針H2DCF/DA(Sigma)；兔抗Cx43抗體(CST)；鼠抗Cx43單克隆抗體(Santa Cruz)；鼠抗磷酸化Cx43抗體(Chemicon)；兔抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)抗體(北京博奧森)。DF-5A電生理刺激儀、凋亡試劑盒(Roche)。

2 主要方法

2.1 實驗動物分組及模型構建 動物雌雄不分，隨機分成3組，每組5只。對照(control)組將實驗犬以3%戊巴比妥鈉腹腔注射后麻醉，固定于手術臺上，行胸骨正中切開術，向左心室注射肝素8 000 U，快速將心臟連同肺一并取出，置于預冷臺氏液中修剪，分離心臟，擠出剩余血液，隨后將主動脈根部連接至心臟離體灌流儀，37 ℃下以改良臺氏液灌注心臟(250 r/min)，待心率恢復至100次/min左右后，分別于左、右心耳，心尖部放置針狀電極，連接電生理儀，刺激儀，記錄心電圖，持續灌流約1 h后留取心房組織；快速起搏(rapid atrium pacing，RAP)組：灌注方法同control組，僅在灌流時以頻率800次/min起搏30 s，共30次；ISO+RAP組：以含0.1 μmol/L異丙腎上腺素的改良臺氏液灌流心臟，余同RAP組。

2.2 電生理參數測量 心臟搏動穩定后即行電生理參數檢測，以S1S2心臟程序期前刺激法檢測心房有效不應期(atrial effective refractory period，AERP)，S1S2偶聯間期從基礎刺激周長300 ms開始，刺激比例為8∶1，10 ms步長遞減，脈寬2 ms，刺激強度為2倍的舒張閾值強度。直至不能奪獲心房的最長S1S2間期為AERP，重復3次，取平均值。記錄除對照組外房顫的誘發次數，誘發出的房顫定義為持續時間大于2 s的快速不規則心房電活動。

2.3 心房肌TH免疫組化染色和分析 取下部分左心房組織，快速置于4%甲醛固定24 h后包埋，常規石蠟切片，于60 ℃烤箱中烘烤2 h，經二甲苯及乙醇脫蠟后于檸檬酸鹽緩沖鹽中高溫高壓修復3 min，以3% H2O2孵育10 min，PBS漂洗5 min×3次，滴加TH抗體(1∶300)，置于4 ℃孵育過夜。采用二步法行TH免疫組織化學染色(按試劑盒說明書操作)，光鏡下陽性為棕褐色。

2.4 Western blot檢測Cx43總蛋白和磷酸化蛋白的含量 將凍存左心房組織用液氮研磨，勻漿，加RIPA裂解液，再加入100 mg/L PMSF，提取總蛋白，用BCA法行蛋白濃度測定。按每泳道加總蛋白40 μg，在12%分離膠和5%濃縮膠上電泳后以100 mA×2 h濕轉將蛋白條帶轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉緩沖液室溫搖動封閉1 h，分別加入小鼠單克隆抗Cx43抗體(1∶1 000)、小鼠抗磷酸化Cx43抗體(1∶1 000)和小鼠抗GAPDH單克隆抗體(1∶10 000)，4 ℃孵育過夜，室溫下加相應Ⅱ抗(1∶10 000)孵育2 h，室溫下TBST溶液清洗蛋白膜15 min×3次，用增強化學發光法顯色，X光片曝光顯影。凝膠成像系統攝像分析。

2.5 免疫熒光測定Cx43 取左心房肌組織行常規石蠟縱向切片，脫蠟后于檸檬酸鹽緩沖鹽中高溫高壓修復3 min，10%血清封閉1 h，倒去血清，滴加Ⅰ抗Cx43(1∶50)于4 ℃孵育過夜；第2天將玻片用PBS漂洗后，以FITC標記的熒光Ⅱ抗(1∶100)室溫避光孵育1 h，PBS漂洗后，DAPI染色，緩沖甘油封片。Olympus熒光顯微鏡下觀察切片，將數字化圖像儲存于計算機，待實驗結束后進行圖像分析。

2.6 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡 參照凋亡試劑盒說明書進行實驗。光鏡下正常心肌細胞核呈藍綠色，凋亡細胞核呈棕褐色。每張切片與凋亡細胞分布區域各取3個高倍視野，計算出每100個細胞的凋亡細胞數，并以百分數表示凋亡指數(apoptotic index，AI)。

2.7 熒光比色法測ROS的生成 各組心房肌組織在取下后1 h內于冰上快速剪碎，采用碧云天公司線粒體提取試劑盒分離線粒體。隨后參照Korde等[4]的方法測定線粒體ROS。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計學軟件對實驗數據進行分析。計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組AERP的比較

Control組與RAP組的AERP差異無統計學顯著性；與RAP組比較，ISO+RAP組的 AERP明顯縮短(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The comparison of AERP in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsRAP group.

圖1 各組AERP的比較

2 各組房顫誘發率的比較

Control組與RAP組均無法誘發出房顫，RAP組僅出現短暫心房電紊亂現象。與RAP組比較， ISO+RAP組則可誘發出房顫(P<0.05)，各組間房顫的陽性誘發率比較見圖2。

3 各組TH免疫組化染色和分析

TH陽性為細胞核特異性著色，呈棕褐色。同control組相比，各組TH陽性逐漸增多，且ISO+RAP組明顯多于RAP組，見圖3。

4 Cx43的免疫熒光染色和Western blot 檢測結果

免疫熒光染色可見，control組的Cx43蛋白表達清楚，位于心肌閏盤處，主要呈端-端分布，條狀，少數呈點狀散在分布，心肌細胞側邊分布較少。RAP組Cx43熒光相對減弱，主要依心肌細胞長軸方向呈側-側分布，條狀，少數呈點狀散在分布。ISO+RAP組的Cx43表達明顯減少，呈點狀散在分布，見圖4。

Western blot檢測結果顯示，與control組相比，RAP組和ISO+RAP組的Cx43總蛋白及磷酸化Cx43蛋白的含量均降低，且呈逐漸下降趨勢，相鄰各組間差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

5 各組心肌細胞凋亡的比較

TUNEL染色觀察可見，凋亡陽性心肌細胞核呈棕褐色，未凋亡細胞核呈深藍色。與control組相比，各干預組的AI值均明顯升高(P<0.01)，且由RAP組至ISO+RAP組呈逐漸增高的趨勢(P<0.01)，見圖5。

Figure 2.The positive induction rates of atrial fibrillation in each group. A: the ECG showed that atrial fibrillation was induced successfully (a) or just atrial electrical disorder appeared (b); B: the quantitative analysis of the atrial fibrillation rates. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsRAP group.

圖2 各組房顫誘發率的比較

Figure 3.Detection of tyrosine hydroxylase (TH) by immunohistochemical staining in each group (×400). The positive staining showed as brown. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsRAP group.

圖3 各組TH免疫組化染色結果

Figure 4.The total protein expression of Cx43 and phosphorated protein level of Cx43 in each group. A: observation of the protein expression of Cx43 in the myocardial tissues under microscope with immunofluorescence staining (×200); B: determination of the total and phosphorylated proteins of Cx43 in the myocardial tissues by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsRAP group.

圖4 各組心肌細胞Cx43總蛋白及磷酸化Cx43蛋白水平的比較

Figure 5.Observation of apoptosis of the myocardial cells in each group by TUNEL staining (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsRAP group.

圖5 各組心肌細胞凋亡的TUNEL染色

6 各組ROS生成量的比較

與control組比較，各組ROS的生成量均明顯增加(P<0.05)，且ISO+RAP組生成量高于RAP組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖6。

Figure 6.The generation of ROS in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsRAP group.

圖6 各組ROS生成量的比較

討 論

縫隙連接蛋白是構成縫隙連接的基本結構和功能的蛋白，每6個跨膜的蛋白亞基圍繞中央孔在相鄰細胞膜上排列形成一個連接子，進而構成縫隙連接。Cx43是構成哺乳動物心臟縫隙連接通道的主要蛋白。Cx43形成的縫隙連接通道的數目、大小、特征及互相連接的心肌細胞的幾何形狀保證了化學物質和電沖動在相鄰心肌間的有效傳遞[5]。大量研究表明，Cx43的重構和心律失常的發生密切相關[6]。心房顫動是臨床最常見的心律失常，自主神經重構與其發生機制密切相關。目前大多數房顫研究主要為在體實驗，離體實驗很少。在本研究中，我們成功構建了擬交感房顫模型，并進一步探討了其可能的內在機制。

我們發現，control組和RAP組AERP未發生明顯改變，而ISO+RAP組AERP則明顯縮短，同時，ISO+RAP組可以成功誘發出房顫。β-腎上腺素能受體的持續刺激是交感神經活躍的標志，ISO是人工合成非選擇性β-腎上腺素能受體激動劑，因此ISO可用于模擬交感神經興奮狀態。TH是交感神經特異性標志物，TH陽性區域提示交感神經分布[7]。研究中，control組、RAP組和ISO+RAP組的TH陽性呈逐漸遞增趨勢。這說明高頻起搏可一定程度興奮交感神經，但在實驗所持續的時長里，其對心電活動影響不大。而交感神經高度興奮后，可以明顯縮短AERP，并顯著促進交感神經的增生，從而增加房顫的易感性。這也證實了交感神經和房顫間的密切關系。

人體內存在維持蛋白質內在穩定性的機制，主要包括泛素化系統和自噬作用。對于低再生能力的細胞，則更需要這種機制來確保其蛋白質的質量。當出現心功能不全或心臟處于某些應激狀態(如氧化應激，缺氧等)時，會激活閏盤處分布的自噬小體，進而引起Cx43的內部化、側鏈化，甚至降解[8]。在我們的研究中，我們也發現，經高頻起搏刺激后，胞膜Cx43的分布出現了明顯的側鏈化趨勢，且總蛋白含量略有下降。在熒光比色檢測活性氧族的實驗中，我們發現ISO所激發的交感神經興奮狀態可加劇氧化應激效應。因此，在ISO+RAP組Cx43無論分布還是含量都出現了明顯的減少。另外，眾所周知，Cx43在經過磷酸化后才能更好代表其功能狀態[9]，實驗中，我們也發現ISO+RAP組的磷酸化Cx43也出現明顯下調，這也更進一步說明了細胞之間的信號傳導受到了顯著影響。在細胞凋亡實驗中，我們也發現，control組，RAP組，ISO+RAP組的凋亡指數呈逐漸增高的趨勢。有研究者認為在應激狀態的早期Cx43的降解是一種保護性的反應，這是為了防止細胞內生成的有害物質迅速傳播，從而使損傷局限化。但是隨著損傷的加劇和時間的延長，這種保護機制開始發揮相反的作用，會進一步加劇細胞的自噬作用，引起更多細胞凋亡，進而使心功能受損[10-11]。

在既往研究中，Cx43和房顫的關系一直存在一定爭議。Wetzel等[12]發現，Cx43的總含量在房顫病人中表達增高。嚴卉等[13]發現，房顫患者中的Cx43的表達量增加，但排列紊亂無規則。而最近的一些研究中，Shin等[14]通過構建心肌肥厚模型，借助食道調搏儀誘發心房顫動，發現Cx43表達下降和側鏈化會增加房顫的易感性，Igarashi等[15]通過快速心房起搏建立房顫模型，發現房顫組Cx43表達降低，而以腺病毒轉染增加Cx43的表達后，可以減少房顫的發生。Cx43的重構包括了Cx43的內部化，側鏈化，乃至降解。而真正能夠發揮信號傳導作用的是位于閏盤處的縫隙連接蛋白，側鏈化的Cx43傳遞信號的功能大為減弱[3]。因此，部分研究中Cx43總含量增高，可能是由于發揮信號傳導功能的縫隙連接蛋白雖然減少，但側鏈化及內部化增多，從而引起總含量增高。

綜上所述，我們認為Cx43的重構和降解與房顫的易感性密切相關，而交感神經可能通過氧化應激效應，引起Cx43的重構與下調，從而介導心房顫動的發生。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of sympathomimetic agent on remodeling of connexin 43 in atrium of isolated heart with rapid atrial pacing

SHU Cheng-lin1, HE Yan1, ZENG Zhi-yu1, HE Tao2, LI Jin-yi3, HUANG Wei-qiang3, XU Jian1, HUANG Yan-qun1

(1DepartmentofGeriatricCardiology,2DepartmentofElectrocardiogram,3DepartmentofCardiology,FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:hyxjwxy@126.com)

AIM: To investigate the changes of connexin 43 (Cx43) via establishing a model of sympathomimetic atrial fibrillation (AF). METHODS: The mongrels (n=15) were randomly divided into control group, rapid atrial pacing (RAP) group and isoprenaline (ISO) perfusion+RAP group (ISO+RAP group). All mongrels’ hearts were taken out rapidly by median sternotomy to establish the cardiac model with Langendorff perfusioninvitro. The atrial effective refractory period (AERP) and AF inducability were tested. The expression and distribution of tyrosine hydroxylase (TH) were analyzed by immunohistochemistry. Total protein level of Cx43 and phosphorylation of Cx43 were determined by Western blot. The distribution of Cx43 were also observed by immunofluorescence staining. The cell apoptosis was analyzed by TUNEL staining. The generation of reactive oxygen species (ROS) in the mitochondria was measured by fluorescence spectrophotometry. RESULTS: No significant change of AERP was found between control group and RAP group, while that in ISO+RAP group was significantly decreased (P<0.05) and induced AF. Compared with control group, the expression of TH, apoptotic index and the generation of ROS increased gradually (P<0.05), while the content of Cx43 decreased gradually both in the total protein and the phosphorylation levels in RAP group and ISO+RAP group (P<0.05). The fluorescence intensity of Cx43 was also attenuated and Cx43 were lateralized apparently in RAP group, while Cx43 were characterized as punctate distribution in ISO+RAP group. CONCLUSION: Sympathetic nerves may activate autophagosome at intercalated discs and trigger cell apoptosis, resulting in remodeling and downregulation of Cx43 via oxidative stress, thus having effects on mediating and maintaining AF.

Sympathetic nerves; Connexin 43; Atrial fibrillation; Oxidative stress; Autophagy

1000- 4718(2017)02- 0215- 06

2016- 07- 28

2016- 11- 07

國家自然科學基金資助項目(No. 81260039)；廣西自然科學基金資助項目(No. 2013GXNSFAA278005)；第一批廣西醫學高層次骨干人才培養“139”計劃經費

R541.7； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.004

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