補陽還五湯對實驗性自身免疫性腦脊髓炎單核巨噬細胞的免疫調控作用*

田倩倩， 李艷花， 尉杰忠， 王曉慶， 張紅珍， 劉建春， 郭文娟， 劉春云， 楊春彥， 肖保國， 馬存根, △

(1山西中醫學院“2011”協同創新中心/神經生物學研究中心，山西 太原 030024； 2大同大學腦科學研究所，山西 大同 037009； 3復旦大學華山醫院神經病學研究所，上海 200025)

補陽還五湯對實驗性自身免疫性腦脊髓炎單核巨噬細胞的免疫調控作用*

田倩倩1， 李艷花2， 尉杰忠2， 王曉慶1， 張紅珍1， 劉建春1， 郭文娟1， 劉春云2， 楊春彥1， 肖保國3， 馬存根1, 2△

(1山西中醫學院“2011”協同創新中心/神經生物學研究中心，山西 太原 030024；2大同大學腦科學研究所，山西 大同 037009；3復旦大學華山醫院神經病學研究所，上海 200025)

目的： 探討補陽還五湯(BYHWD)治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的有效性及對單核巨噬細胞免疫調控的作用及機制。方法: 雌性C57BL/6小鼠用小鼠髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35-55肽段(MOG35-55)免疫制作慢性EAE模型，隨機分為生理鹽水處理組和BYHWD組。在免疫后第3天開始分別予以生理鹽水和BYHWD灌胃，500 μL/d，持續觀察臨床癥狀和體質量變化。免疫后17 d各組統一處死部分動物，HE染色觀察炎性細胞浸潤情況，髓鞘染色觀察脊髓髓鞘脫失比例，流式細胞術檢測脾細胞M1型和M2型巨噬細胞表型；免疫熒光組織化學染色和Western blotting檢測脊髓巨噬細胞iNOS、TNF-α、arginase及IL-10的表達。結果: BYHWD推遲EAE起病，減輕EAE癥狀，抑制中樞神經系統脊髓的炎性浸潤和髓鞘脫失，促進脊髓及脾組織中M1型巨噬細胞轉化為M2型。結論: BYHWD干預可緩解EAE行為學和病理學的改變，其作用機制可能與其誘導巨噬細胞極性轉化相關。

補陽還五湯； 實驗性自身免疫性腦脊髓炎； 巨噬細胞

多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經系統(central nervous system，CNS)的慢性自身免疫炎癥性疾病，以腦白質內神經髓鞘脫失、軸突變性及炎性細胞浸潤為主要病理特征[1]。目前因有效性低、嚴重的慢性毒性以及較高的處理成本等毒副作用的影響，MS仍缺乏有效的治療方法[2]。中藥是多種天然藥物成分的復合體，以多靶點、多途徑、整體調節、協同作用強、毒副作用小為特點，能有效改善患者臨床癥狀，延緩疾病進程，調節免疫功能，彌補西醫的不足[3]。

實驗性自身免疫腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是目前國際公認的研究MS的動物模型。近年來，祖國醫學對MS及EAE進行積極的理論與實踐探索認為[4]，本虛標實是本病的主要特征，肝腎陰虛、脾腎陽虛為本虛,痰、血瘀、濕、熱合而為標實。其中，氣虛血瘀證作為MS的常見證型之一，益氣活血能明顯改善臨床癥狀，降低致殘率，提高生活質量。

補陽還五湯(Buyang-Huanwu decoction，BYHWD)作為中醫臨床常用方劑，源自清代著名醫家王清任的《醫林改錯》，由生黃芪4兩、當歸尾2錢、赤芍1.5錢、川芎1錢、地龍1錢、桃仁1錢和紅花1錢組成，具有益氣養血、活血通絡之功效。藥理研究發現BYHWD可改善微循環、血液流變學和血流動力學，抗炎抗氧化，調節免疫，還具有神經保護作用[5]。本研究應用BYHWD對EAE小鼠進行干預，探討BYHWD對EAE小鼠單核巨噬細胞的免疫調控機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

8～10周齡C57BL/6小鼠，體質量18～20 g，購自北京維通利華公司，經山西大同大學倫理委員會批準，所進行的實驗遵守國際動物實驗委員會指導方針。實驗前小鼠在無病原菌動物房清潔級飼養(25 ℃左右)，12 h明暗交替，相對濕度40%～60%，自由飲食喂養1周。

2 實驗藥物

藥物補陽還五湯按王清任《醫林改錯》原方，由生黃芪120 g、當歸尾6 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、地龍3 g、桃仁3 g和紅花3 g組成。藥材購自太原同仁堂藥店，并由山西中醫學院專家鑒定合格。以上藥物加水浸泡2 h，加10倍量水(約1 500 mL)，煎煮2次，第1次60 min，第2次30 min，過濾，2次濾液合并，靜置過夜；次日將藥液離心(1 500 r/min、5 min),取上清濃縮至80～100 mL，相當于生藥2 kg/L，置冷，4 ℃冷藏備用。

3 主要試劑和儀器

小鼠髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35-55肽段(myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide fragment 35-55，MOG35-55)由上海強耀生物科技有限公司合成；百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)購自Alexis；完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)購自Sigma；結核分枝桿菌(tuberculosis bacilli，TB)、Flour-488-CD11b、PE-CD16/32和PE-CD206購自Becton Dickinson；β-actinⅠ抗購自CST；CD68Ⅰ抗購自eBioscience；誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)購自ENZO；精氨酸酶1(arginase-1，Arg-1)購自BD;腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)購自PeproTech；白細胞介素10 (interleukin-10，IL-10)購自eBioscience；HRP標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠、山羊抗大鼠Ⅱ抗及BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。凝膠成像分析儀購自Bio-Rad；熒光顯微鏡購自Olympus；冰凍切片機購自Leica；流式細胞儀為BD FACS Calibur產品。

4 主要方法

4.1 EAE模型建立及分組 42只8～10周齡雌性C57BL/6小鼠應用隨機數字表按平均體質量隨機分為EAE對照組、補陽還五湯組，每組各21只。MOG35-55溶解于生理鹽水中，百日咳毒素溶于完全弗氏佐劑；采用針管混合器將等體積2種溶液充分混合，制成油包水樣乳白色混懸液，靜置后無分層為合格。在脊柱背側中線兩側，分4點皮下注射(每只0.1 mL)。在免疫當日和48 h后，各組小鼠每只分別每次腹腔注射PTX 300 ng。

4.2 補陽還五湯對所建動物模型進行干預 EAE小鼠分為生理鹽水對照組和補陽還五湯組。從免疫后第3天開始灌胃給藥，EAE對照組予以生理鹽水，補陽還五湯組每只給予補陽還五湯500 μL(按平均體重20 g計算，相當于35.60～44.53 g/kg)。每日給藥1次，每組12只動物持續給藥至免疫后28 d，9只動物于免疫后第17天處死。

4.3 行為學觀察及標本采集 給藥期間持續觀察動物的癥狀與體質量。采用國際通用的5分評分制對小鼠進行臨床癥狀評分：無任何臨床癥狀為0分；尾部張力消失，可見輕度步態笨拙為1分；一側后下肢無力，被動翻身后可以恢復為2分；雙后肢癱瘓，被動翻身后不能恢復，但給予刺激后可以挪動為3分；雙側后肢癱瘓伴前肢癱瘓為4分；瀕死狀態或死亡為5分。癥狀介于兩者評分之間者以±0.5分計。

免疫后17 d，采用0.3%戊巴比妥鈉每只0.2 mL腹腔注射麻醉后取脾臟，制備成單個核細胞懸液；用生理鹽水進行心臟灌注，至肝臟發白，各組5只動物快速冰上解剖脊髓組織，勻漿后提取蛋白，定量后采用Western blotting技術檢測iNOS、Arg-1、TNF-α和IL-10(抗體均以1∶1 000稀釋)的蛋白水平；各組其余4只動物用4%多聚甲醛灌流進行體內組織固定，然后分離脊髓，OCT包埋劑包埋，于液氮中冷凍，做厚度為10 μm的冰凍切片，進行髓鞘、HE及免疫組化染色。

4.4 髓鞘染色 取脊髓切片于95%乙醇中浸泡15 min，浸于Luxol固藍(Luxol fast blue, LFB)液中，57 ℃孵育24 h，于95%乙醇溶液浸洗10 min，去離子水浸洗5 min，0.05%碳酸鋰快速浸洗10 s，70%乙醇分化至灰質與白質能夠清晰辨別，去離子水浸洗5 min，梯度乙醇脫水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

4.5 HE染色 將脊髓切片水中浸泡2 min，蘇木精染色4 min，快速水洗，0.5%鹽酸乙醇分化15 s,0.5%伊紅30 s，快速水洗，梯度乙醇脫水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性樹膠封片,光鏡下觀察。

4.6 免疫組化實驗 脊髓的冰凍切片置于濕盒中1% PBS沖洗 5 min、3次；敷Ⅰ抗CD68、iNOS、Arg-1、TNF-α和IL-10(1∶1 000)后4 ℃過夜；1% PBS沖洗每次5 min×3次；敷育相對應的熒光Ⅱ抗(1∶10 000)，避光放置2 h； 1% PBS沖洗3次；甘油封片，鏡檢。

4.7 Western blotting實驗 用組織裂解液在4 ℃條件下充分裂解脊髓組織蛋白，并用BCA法測定蛋白含量。制備蛋白上樣緩沖液樣品，用10% SDS-PAGE分離蛋白。電泳完畢后，將分離好的蛋白凝膠用濕式轉移法轉移到硝酸纖維膜(穩流220 mA，2 h)，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入抗iNOS、Arg-1、TNF-α、IL-10(1∶1 000)及抗β-actin(1∶10 000)的抗體，4 ℃過夜；次日洗滌后孵育相對應的HRP偶聯Ⅱ抗(1∶10 000)室溫2 h。洗膜后進行化學發光反應，用Bio-Rad凝膠成像分析儀檢測條帶，Image Lab 3.0軟件進行灰度值比較，并進行統計學分析。

4.8 流式細胞術檢測脾細胞的M1型和M2型巨噬細胞表型 小鼠脾細胞懸于50 μL 1% BSA-PBS緩沖液中，分別加1 μL Flour-488-CD11b、PE-CD16/32和PE-CD206抗體，室溫避光20 min。PBS洗2次各加500 μL PBS，上流式細胞儀檢測。

5 統計學處理

統計分析采用GraphPad Prism統計分析軟件進行數據處理，計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示，兩兩比較使用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 BYHWD緩解EAE小鼠發病程度

8周齡C57BL/6小鼠被免疫后，在免疫后第3天給予BYHWD灌胃治療，臨床觀察癥狀評分及體重直到第28天。EAE對照組小鼠自免疫后第10天起逐步發病。觀察到小鼠精神萎靡不振、食欲減退、體重減輕及皮毛不光整，尾部及四肢肌力下降甚至出現癱瘓，臨床癥狀評分最高可達4.5分。與EAE對照組相比，補陽還五湯組起病時間明顯推遲(P<0.01)，臨床癥狀評分明顯降低,見圖1A。同時，隨著臨床癥狀評分的加重，EAE對照組小鼠的體重呈明顯下降趨勢，而補陽還五湯治療組小鼠體重下降不明顯，見圖1B。

Figure 1.BYHWD delayed the onset of EAE and attenuated the severity of EAE. A: clinical score; B: body weight. Mean±SD.n=21.**P<0.01vsEAE．

圖1 BYHWD緩解EAE小鼠臨床癥狀和體重丟失

2 BYHWD減少脊髓白質髓鞘脫失

LFB染色顯示EAE對照組脊髓白質出現大面積髓鞘脫失，而BYHWD組髓鞘脫失面積明顯減少。EAE對照組髓鞘脫失與白質面積比值為(45.98±10.96)%，BYHWD組為(1.88±0.66)%，差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The demyelination in the spinal cord of the mice in EAE group and BYHWD group with Luxol fast blue staining. The pixel area (%) of demyelination in white matter was calculated by Image-Pro Plus software. 1: the demyelinating area of spinal cord in EAE group; 2: the demyelinating area of spinal cord in BYHWD group. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsEAE group．

圖2 EAE組和BYHWD組小鼠的脊髓脫髓鞘

3 BYHWD抑制脊髓組織中炎性細胞浸潤

大量巨噬細胞侵入中樞在EAE和MS發生發展過程中扮演重要角色，因此，本課題利用HE染色和CD68免疫熒光染色分析了脊髓組織的炎性細胞浸潤情況。結果顯示：臨床癥狀較重的EAE對照小鼠脊髓白質區呈現大量炎性細胞浸潤，尤以腰膨大處炎性細胞浸潤更為明顯，HE染色結果顯示EAE對照組脊髓白質區炎性浸潤細胞占整個脊髓面積的比值為(1.43±0.46)%，BYHWD組炎性細胞浸潤明顯減少，僅為(0.45±0.43)%，差異有統計學顯著性(P<0.05)；與脊髓HE染色一致，免疫熒光染色EAE對照組脊髓白質區域CD68+巨噬細胞浸潤明顯，而BYHWD明顯抑制CD68+巨噬細胞的浸潤(P<0.05)，見圖3。

4 BYHWD促進脊髓組織中M1型巨噬細胞轉化為M2型

巨噬細胞按照其表型和分泌的細胞因子功能可分為以分泌促炎因子為主、發揮促炎功能的M1型巨噬細胞及以降低炎性反應、促進組織修復為主的M2型巨噬細胞。免疫組化結果顯示，M1型巨噬細胞促炎因子iNOS和TNF-α在EAE組脊髓白質區浸潤明顯，成大片點狀分布；而在BYHWD組僅有零星陽性浸潤，與對照組相比數量明顯減少(P<0.05)。Arg-1和IL-10作為M2型巨噬細胞抑炎因子，它們的表達在BYHWD治療組的陽性分布比較密集，與EAE對照組比較具有明顯差異(P<0.05)。脊髓Western blotting實驗的結果與免疫組化結果相一致，見圖4。

5 BYHWD使脾臟組織中巨噬細胞從M1型轉化為M2型

脾臟作為全身最大的外周免疫器官，是參與免疫反應的重要基地。流式細胞術的結果表明，與EAE組相比，BYHWD也可抑制脾臟M1型巨噬細胞表面標志CD16/32的表達(P<0.05)，使脾臟M2型巨噬細胞表面標志CD206表達呈增高趨勢(P<0.05)；BYHWD組CD16/32與CD206表達比值明顯低于EAE對照組，差異有統計學顯著性(P<0.05)。同時對冰凍脾組織切片行免疫組化染色，結果顯示與脊髓組織染色結果一致，EAE小鼠經BYHWD治療后，可顯著抑制iNOS的表達，同時促進Arg-1的表達(P<0.05)，見圖5。

Figure 3.BYHWD inhibited macrophage infiltration in spinal cord of EAE mice. A: HE staining, a number of inflammatory cells in whole spinal cord were calculated by Image-Pro Plus software; 1: posterior root of spinal cord; 2: lateral region of the white matter of the spinal cord. B: the expression of CD68 in the spinal cord of the mice in EAE group and BYHWD group. The number of CD68+cells in whole spinal cord were calculated by Image-Pro Plus software. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsEAE group.

圖3 BYHWD抑制EAE小鼠脊髓組織中巨噬細胞浸潤

討 論

BYHWD是清代王清任所創氣虛血瘀理論的代表方劑，出自《醫林改錯·卷下·癱痿論》[6]，方中重用生黃芪四兩為君藥補氣扶正以固本，桃仁、紅花各一錢、赤芍一錢半兼顧血瘀，歸尾二錢、川芎一錢養血行氣而不傷正，針對久病入絡加用地龍搜剔通絡[7]。藥理學研究發現，其有效成分黃芪甲苷、阿魏酸、芍藥苷、紅花黃色素、川芎嗪等[8]，具有抗炎抑炎、免疫調節、神經保護等作用[9-10]。

MS 是由髓鞘特異性CD4+T 細胞介導的、發生于中樞神經系統常見的慢性炎性脫髓鞘自身免疫性疾病，臨床上以“萎證”居多。其確切病因尚不清楚，目前比較公認的是在髓鞘的自身免疫、感染性因子、性別、環境因素和遺傳背景等多種因素作用下，自身免疫系統對CNS 進行攻擊，導致髓鞘破壞，繼而造成對運動、感覺、視覺等的損傷[11]。由本文結果可以看出，BYHWD 的治療可以降低EAE 疾病的嚴重程度，延遲EAE 小鼠的發病時間；病理學研究發現，BYHWD 治療后能夠顯著抑制脊髓白質髓鞘脫失，促進髓鞘再生。這顯示了BYHWD治療EAE 的良好效果。

巨噬細胞與EAE的發展有密切關系，它有抗原提呈能力，能分泌炎性細胞因子，參與髓鞘脫失和軸突的損傷。在已有的實驗研究中發現，在EAE的發生發展中，巨噬細胞具有關鍵作用[12]。

巨噬細胞根據其功能分化為致炎性的M1 型巨噬細胞和抗炎性的M2 型巨噬細胞[13]。M1 型巨噬細胞的標志有CD16/32、CD40、IL-12、iNOS 等，M2型巨噬細胞的標志為CD206、IL-10、Arg-1、CD14、CD23等[14-15]。M1/M2型巨噬細胞的平衡是炎性反應程度的重要指標[16]。研究證實，M1/M2的失衡在EAE發生發展過程中起著重要作用，表現為M1細胞占優勢介導炎性免疫反應。如果抑制M1細胞，降低促炎細胞因子的分泌，或者促進M2細胞的分化，則能緩解EAE發病嚴重程度[15]。TNF-α作為重要的細胞炎性因子在EAE 的發生和發展中發揮著重要作用，其升高水平與疾病的嚴重程度密切相關[17]。在EAE 動物模型中TNF-α表達增加，可以加重EAE的炎癥反應癥狀，本實驗結果與之一致。郭小彬等[18]通過測定實驗動物血清TNF-α的表達，顯示EAE 癥狀隨著血清TNF-α的表達的增高而逐漸加重。在楊春彥等[19]、章培軍等[20]的實驗中也證實，在EAE的發展過程中，通過藥物可抑制促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的釋放，同時促進抗炎因子IL-10的表達來緩解臨床癥狀。這些均預示著巨噬細胞的極性轉化在EAE發生發展過程中起著重要的作用。

Figure 4.BYHWD promoted the polarization of M1 macrophages into M2 in spinal cord tissue of EAE mice. The expression of iNOS, Arg-1, TNF-α and IL-10 in the spinal cord of EAE group and BYHWD group was measured by immunofluorescence (A, ×20) and Western blotting (B). Mean±SD.n=4～5.*P<0.05vsEAE group.

圖4 BYHWD促進脊髓組織中M1型巨噬細胞轉化為M2型

我們之前的一系列研究也表明fasudil作為治療EAE的有效藥物之一，體外實驗的結果證實可直接促進M1炎癥型巨噬細胞向M2型轉化[21]，并且體內實驗也證實了其可使表達高氧化應激產物和促炎癥因子的M1型巨噬細胞向抑制免疫炎癥反應和促進組織修復作用的M2型巨噬細胞轉化[22]。我們對新合成藥物WAR5的研究也發現，WAR5化合物與fasudil的作用機制具有相似性，即可誘導M1炎癥型巨噬細胞向M2抗炎型巨噬細胞分化[23]。本實驗通過BYHWD干預EAE結果顯示其可抑制巨噬細胞/小膠質細胞的iNOS、TNF-α及CD16/32，而增加抗炎型M2細胞Arg-1、IL-10和CD206的表達。這種細胞極性轉化，可以顯著改善組織內的炎癥微環境，減少對神經組織的損傷，進而改善臨床療效[24-25]。

Figure 5. BYHWD promoted the polarization of M1 macrophages into M2 in the spleen of EAE mice. A: the cells were stained with macrophage marker CD11b and M1/M2 markers， and the polarization of M1/M2 was analyzed using flow cytometry. Representative dot plots from 1 of 3 experiments with the similar results are showed. The results are expressed as the percentage of double positive cells in four-quadrant diagram. B: the expression of iNOS and Arg-1 in the spleen of the mice in EAE group and BYHWD group was measured by immunofluorescence. Mean±SD.n=4～5.*P<0.05vsEAE group.

圖5 BYHWD使脾臟組織中巨噬細胞從M1型轉化為M2型

綜上所述，BYHWD治療EAE可明顯改善臨床癥狀、抑制炎癥反應，可能與其誘導炎癥性M1型巨噬細胞向抗炎性的M2表型轉化、從而抑制中樞及外周神經系統的炎癥反應有關。這也為MS的干預治療提供了新的途徑。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Immunoregulatory effect of Buyang-Huanwu decoction on monocyte-macrophages in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis

TIAN Qian-qian1, LI Yan-hua2,YU Jie-zhong2, WANG Xiao-qing1, ZHANG Hong-zhen1, LIU Jian-chun1, GUO Wen-juan1, LIU Chun-yun2, YANG Chun-yan1, XIAO Bao-guo3, MA Cun-gen1, 2

(1“2011”CollaborativeInnovationCenter/ResearchCenterofNeurobiology,ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Taiyuan030024,China;2InstituteofBrainScience,DatongUniversity,Datong037009,China;3InstituteofNeurology,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200025,China.E-mail:macungen2001@163.com)

AIM: To explore the therapeutic effect of Buyang-Huanwu decoction (BYHWD) on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and its immunoregulatory effect on monocyte-macrophages. METHODS: Chronic EAE was induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide fragment 35-55 (MOG35-55) in the female C57BL/6 mice, which were randomly divided into saline group and BYHWD group. On day 3 after immunization, the mice in BYHWD group were orally administrated with BYHWD, while normal saline was given to the control mice. The clinical score and body mass were recorded every other day. At day 17 after immunization, the mice were sacrificed and spinal cords were obtained for HE staining and myelin staining. The M1 and M2 macrophage phenotypes of splenic cells were detected by flow cytometry and immunofluorescence staining. The protein expression of iNOS, TNF-α, arginase and IL-10 in the spinal cord macrophages was determined by Western blotting. RESULTS: BYHWD delayed the onset of EAE, reduced the clinical scores of EAE, inhibited the inflammatory cell infiltration and demyelination in the spinal cord, and promoted the conversion of M1 macrophages into M2 phenotype in the spinal cord and spleen. CONCLUSION: BYHWD intervention attenuates the behavioral and pathological changes in the EAE mice, and its mechanism may be related to the macrophage conversion.

Buyang-Huanwu decoction; Experimental autoimmune encephalomyelitis; Macrophage

1000- 4718(2017)02- 0200- 08

2016- 06- 27

2016- 10- 19

國家自然科學基金資助項目(No. 81473577)；山西省自然科學基金資助項目(No. 2013011052-4)；山西省國際科技合作項目(No. 2013081058)；山西省回國留學人員重點科研資助項目(2014-重點7)；山西中醫學院“2011”培育計劃項目(No. 2011PY-1)

R363； R392

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.002

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