磷酸二酯酶4抑制劑咯利普蘭逆轉慢性酒精中毒及戒斷誘導的小鼠抑郁樣行為*

蔣 曦， 王國康， 趙應征， 俞雪鋒△

(1浙江醫藥高等專科學校， 2浙江大學明州醫院，浙江 寧波 315000； 3溫州醫科大學，浙江 溫州 325000)

·論 著·

磷酸二酯酶4抑制劑咯利普蘭逆轉慢性酒精中毒及戒斷誘導的小鼠抑郁樣行為*

蔣 曦2， 王國康1， 趙應征3， 俞雪鋒1△

(1浙江醫藥高等專科學校，2浙江大學明州醫院，浙江 寧波 315000；3溫州醫科大學，浙江 溫州 325000)

目的： 研究磷酸二酯酶4(PDE4)抑制劑咯利普蘭對酒精中毒戒斷誘導的抑郁樣行為的作用及對小鼠海馬和前額葉皮質腦區環磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶A(PKA)、cAMP反應元件結合蛋白(CREB)、磷酸化CREB(p-CREB)和腦源性神經營養因子(BDNF)表達的影響。方法: 取60 只雄性ICR小鼠，隨機分為空白對照組、空白+咯利普蘭組、慢性酒精模型組和咯利普蘭治療組(0.1、0.5和1 mg/kg)。給予酒精28 d，期間每周進行酒精戒斷處理。慢性酒精處理后，進行強迫游泳測試(FST)和懸尾測試(TST)，觀察小鼠抑郁樣行為；ELISA檢測小鼠海馬和前額葉皮質cAMP含量，Western blot檢測小鼠海馬和額葉皮質PKA、CREB、p-CREB和BDNF的表達。結果: 隨著飲酒天數及戒斷次數的增加，小鼠表現出明顯嗜酒現象，飲酒量增加(P<0.01)，FST和TST測試中的不動時間增加(P<0.01)。小鼠給藥咯利普蘭(0.5和1 mg/kg)28 d后，FST和TST不動時間與模型組相比明顯減少(P<0.05)，且能改善小鼠的嗜酒現象，小鼠飲酒量與模型組相比明顯減少(P<0.01)；相比于正常組，模型組小鼠海馬和前額葉皮質cAMP含量明顯降低(P<0.01)，并且海馬和額葉皮質PKA、p-CREB和BDNF也明顯低于正常水平(P<0.01)。咯利普蘭(0.5和1 mg/kg)給藥28 d后，海馬與前額葉皮質cAMP含量明顯增加(P<0.01)，酒精抑制的海馬腦區PKA、p-CREB和BDNF表達被逆轉(P<0.05)，且酒精抑制的前額葉皮質PKA和p-CREB表達被逆轉(P<0.05)。結論: 磷酸二酯酶4抑制劑咯利普蘭能明顯改善酒精中毒及戒斷引起的抑郁樣癥狀，且能減輕嗜酒癥狀，機制可能涉及第二信使cAMP通路。咯利普蘭通過抑制PDE4，增加海馬與前額葉皮質cAMP水平，進而激活PKA-CREB-BDNF通路，從而產生抗抑郁作用。

咯利普蘭； 抑郁； 慢性酒精中毒； 海馬； 前額葉皮質

酒精是除阿片類和精神刺激類物質之外的又一大成癮物品，已成為全球范圍內最常見的濫用物質[1]。在我國酒精濫用現象由來已久，據報道，在20 世紀80年代初我國酒精依賴癥患者的比率為0.016%，而在本世紀初已上升到9%[2]。酒精依賴成癮已經成為社會穩定和身體健康的重要影響因素之一，研究表明，歐洲每年用于酒精依賴癥的治療費用高達國內生產總值的0.68%～0.95%，已成為社會衛生保健系統的沉重經濟負擔[3]。

酒精依賴癥又稱為酒精成癮，主要癥狀為震顫、焦慮、情緒低落、一過性幻覺或錯覺等，長期酗酒將出現局部腦損傷和認知功能障礙的跡象。酒精成癮發病機制尚不明確，但是其癥狀卻與中樞神經性疾病中的抑郁癥極為相似。相關動物行為學研究發現在酒精成癮及戒斷階段，動物出現明顯的抑郁樣癥狀，表明兩者可能存在一定的聯系。臨床報道也證實抑郁癥與酒精濫用有關[4-5]，抑郁與酒精成癮共病率高達70%[6]，但兩者的共病機制仍不明確。酒精成癮與抑郁癥病理特點都表現為腦內特定腦區(如海馬、前額葉皮層等)大量神經細胞凋亡，相關神經保護蛋白表達減少，神經再生減少。相關研究成果還發現兩者的共病機制可能涉及腦內第二信使環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)通路[7]。

因直接調控腦內cAMP水平仍存在一定難度，研究學者開始關注cAMP特異性水解酶磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)。PDE 是催化cAMP 和環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)水解酶超級家族，目前有11 個家族成員(PDE1～11)。其中PDE4、PDE7 和PDE8 為cAMP特異性的水解酶，PDE5、PDE6 和PDE9 為cGMP 特異性的水解酶，其它PDE亞型 對cAMP 和cGMP 均可水解[8]。眾多亞型中，PDE4在腦內的分布最為廣泛，通過有效調控PDE4 水平而上調cAMP，可調節多項與抑郁相關的病理機制，包括神經遞質的合成與傳遞、關鍵神經營養因子的合成等。大量研究也證實PDE4抑制劑咯利普蘭(rolipram)具有良好的抗抑郁活性[9-10]。

最新研究還發現，第二信使cAMP通路與酒精攝入與成癮性相關[11]。急性酒精攝入實驗結果表明，抑制PDE4活性能明顯激活cAMP通路，然后一方面增加神經保護相關蛋白的表達，另一方面明顯減少酒精的攝入量。相關報道也指出PDE可能是治療酒精成癮及戒斷的關鍵靶點。

本研究以腦內cAMP的特異性水解酶PDE4為突破口，探討PDE4介導的cAMP信號轉導通路是否與酒精成癮戒斷階段的抑郁樣行為有關，進一步檢測蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response-element binding protein，CREB)和腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達，深入探討cAMP-PKA-CREB-BDNF通路是否參與酒精成癮和抑郁癥兩者的共病機制。

材 料 和 方 法

1 動物

成年雄性ICR小鼠80只， 6～8周齡，購于溫州醫科大學實驗動物中心,實驗動物許可證號為SYXK(浙)2015-0009。動物自由進食及飲水。所有實驗和動物處理符合1986 年11 月24日歐洲共同體理事會指導，并通過復旦大學動物護理和使用委員會批準。所有的實驗均在上午8～10時進行。

2 主要試劑和設備

2.1 試劑 無水乙醇購于無錫佳妮化工有限公司；咯利普蘭購于Sigma；cAMP ELISA 試劑盒、抗BDNF抗體(稀釋倍數1∶1 000)、抗β-actin抗體(稀釋倍數1∶1 000)和ECL曝光液購于Abcam；抗CREB抗體(稀釋倍數1∶200)、抗磷酸化CREB (phosphorylated CREB, p-CREB)抗體(稀釋倍數1∶200)、兔Ⅱ抗(稀釋倍數1∶1 000)及鼠Ⅱ抗(稀釋倍數1∶1 000)均為多克隆抗體，均購于Santa Cruz；脫脂奶粉購于碧迪醫療器械(上海)有限公司；Tris-HCl購于Biosharp；APS、SDS、TEMED及BCA蛋白濃度測定試劑盒均購于上海碧云天生物技術有限公司；30%聚丙烯酰胺和PVDF膜購于Solarbio。

2.2 設備 BS 110S 型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；JY92 2D 超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；WH 966 漩渦混合器(太倉市科教器材廠)；64 R 超速冷凍離心機(Beckman Coulter)；電泳與轉膜設備和自動酶標分析儀(Bio-Rad)。

3 實驗方法

3.1 慢性酒精成癮小鼠模型的建立[12]小鼠分為正常對照組、咯利普蘭(1 mg/kg)組、慢性酒精成癮組和慢性酒精成癮+咯利普蘭(0.1、0.5和1 mg/kg)組，共6組，每組10只小鼠。3～5只小鼠飼養為1籠。以酒精和水的體積比為5%的初始濃度，按10 mL/kg量取酒精溶液。第1、2、3和4周酒精濃度分別為5%、10%、20%和35%，將酒精溶液作為唯一的飲用來源。分別在第6、13、20和27天對各組小鼠進行酒精偏好度測試，測試后停止給予酒精，戒斷1 d后，再給予酒精，正常對照組與咯利普蘭組則在全過程中給予正常飲水。慢性酒精成癮+咯利普蘭(0.1、0.5和1 mg/kg)組給藥時間均在上午8時，連續給藥28 d。

3.2 酒精偏好測試 仿照糖水消耗實驗方法[13]，對小鼠進行酒精消耗測試。在第6、13、20和27天，每只小鼠單籠飼養，禁水24 h后同時給予酒精與自來水各1瓶，記錄1 h內酒水與水各自的消耗量，用酒水消耗率來表示實驗結果。酒水消耗率(%)= 酒水消耗量/(酒水消耗量+自來水消耗量)×100%。

3.3 強迫游泳測試(forced swimming test，FST) 動物被迫在一個局限的空間中游泳，首先以游泳、攀爬、掙扎試圖逃脫，隨后即進入一種被稱為“行為絕望”的不動狀態，以反映動物的抑郁狀態。在第27天酒精偏好測試結束后，進行戒斷處理，第28天上午進行強迫游泳實驗測試。實驗時將對照組、慢性酒精成癮組與慢性酒精成癮+咯利普蘭組小鼠逐只放入高45 cm、直徑20 cm、水深20 cm的游泳水槽中[水溫維持在(22±1) ℃]，觀察6 min，記錄后4 min內小鼠的絕對不動時間。

3.4 懸尾測試(tail suspension test，TST) 在距尾尖約1 cm 處用膠布把小鼠懸于高50 cm 的位置。小鼠被懸于高處會立刻出現逃生樣行為，然后轉變為被動不動。過了最初的掙扎期后小鼠會適應不動狀態， 類似于絕望和精神抑郁的狀態。實驗時將對照組、慢性酒精成癮組與慢性酒精成癮+咯利普蘭組小鼠懸于高處，測試時間為6 min，記錄后4 min內的累計不動時間，精確到秒。

3.5 ELISA檢測法 各組小鼠在行為學測試后處死，在4 ℃條件下迅速剝離大腦，用生理鹽水洗去血漬后分離出海馬和皮質，分別置預冷的RIPA 裂解液中進行組織勻漿。用 BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，調整樣品蛋白濃度為1 g/L，根據ELISA試劑盒進行測定。

3.6 Western blot法 小鼠處死后，分離的海馬與皮質，用 BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，經過上樣電泳及轉膜后，蛋白轉移至PVDF膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉 1 h或4 ℃封閉過夜， 隨后用TBST 洗膜3次， 加入相應的Ⅰ抗4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3 次， 每次7 min， 加入相應的Ⅱ抗， 孵育1 h。用TBST 洗膜3 次。曝光顯影后，以β-肌動蛋白(β-actin)作為內參照，以目標蛋白與內參照蛋白的積分吸光度的比值百分率表示蛋白的相對表達量。

4 統計學處理

采用SPSS 16.0統計軟件包與GraphPad Prism 軟件進行統計學處理，數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，數據進行單因素方差分析并用SNK-q檢驗進行檢驗分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 咯利普蘭對酒精依賴程度的影響

如圖1所示，第13、20和27天的酒精偏好測試中，與正常對照組相比，模型組小鼠對酒精的偏好程度顯著增加，差異具有統計學顯著性(P<0.01)。而在第20天和第27天的測試中，與模型組相比，1 mg/kg咯利普蘭給藥組小鼠飲酒量明顯減少(P<0.05或P<0.01)。

2 咯利普蘭對慢性酒精成癮戒斷后抑郁樣行為學的影響

經過28 d慢性酒精成癮及多次戒斷后，模型組小鼠出現明顯的抑郁樣行為，在FST中，與對照組相比，不動時間明顯增加(P<0.01)，1 mg/kg咯利普蘭給藥組與模型組相比，不動時間明顯減少(P<0.01)；在TST中，也得到了相似的結果，模型組小鼠不動時間明顯增加(P<0.01)，給予 1 mg/kg咯利普蘭作用28 d后，能明顯翻轉慢性酒精成癮及多次戒斷后引起的抑郁樣行為。此外，1 mg/kg咯利普蘭組與正常對照組相比，不動時間無顯著差異，見圖2。

3 咯利普蘭對慢性酒精成癮戒斷后海馬、額葉皮質cAMP水平的影響

如圖3所示，經過28 d慢性酒精成癮及多次戒斷后，模型組小鼠海馬內cAMP水平與正常對照組相比明顯降低(P<0.01)，而慢性0.5和1 mg/kg咯利普蘭給藥能明顯增加小鼠腦內海馬cAMP水平(P<0.05)。相對應的前額葉皮質腦區也有相似的變化，模型組小鼠cAMP水平明顯升高，咯利普蘭給藥能明顯翻轉慢性酒精成癮及多次戒斷后引起的cAMP水平失衡(P<0.01)。

Figure 1.The effects of rolipram on alcohol (Alco) consumption of the mice in alcohol preference test at 0 d, 6 d, 13 d, 20 d and 27 d. Mean±SEM.n=10.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsAlco group.

圖1 咯利普蘭對小鼠酒精偏好行為學的影響

Figure 2.The effects of rolipram (Rol) on the results of forced swimming test (A) and tail suspension test (B) in mice. Mean±SEM.n=10.**P<0.01vscontrol group (Rol 0 mg/kg);##P<0.01vsalcohol (Alco) group.

圖2 咯利普蘭對小鼠強迫游泳和懸尾測試結果的影響

4 咯利普蘭對慢性酒精成癮戒斷后海馬和前額葉皮質PKA、CREB、p-CREB和BDNF表達的影響

Figure 3.ELISA analysis of the cAMP level in the hippocampus (A) and prefrontal cortex (B). Rol: rolipram. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol group (Rol 0 mg/kg);#P<0.05,##P<0.01vsalcohol (Alco) group.

圖3 咯利普蘭對cAMP水平的影響

經過28 d慢性酒精成癮及多次戒斷后，模型組小鼠海馬內PKA和BDNF的蛋白水平與正常對照組相比明顯降低(P<0.01)，p-CREB與CREB比值明顯減小(P<0.01);給予1 mg/kg咯利普蘭后，相比于模型組，PKA和BDNF的蛋白水平增加(P<0.05)，p-CREB/CREB升高(P<0.05)。相似的是，模型組小鼠前額葉皮質腦區的PKA和BDNF蛋白水平，p-CREB與CREB的比值也明顯降低(P<0.05)；給予咯利普蘭后，能翻轉慢性酒精成癮及多次戒斷后引起的PKA和p-CREB/CREB的蛋白水平異常，BDNF表達呈現明顯增加趨勢，但差異無統計學顯著性。此外，1 mg/kg咯利普蘭組與正常對照組相比，PKA、p-CREB/CREB和BDNF的蛋白水平差異無統計學顯著性，見圖4～6。

Figure 4.Western blot analysis of PKA expression in the hippocampus (A) and prefrontal cortex (B). Rol: rolipram. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol group (Rol 0 mg/kg);#P<0.05vsalcohol (Alco) group.

圖4 咯利普蘭對PKA表達的影響

討 論

大量臨床研究發現，酒精依賴的患者，隨著依賴程度的加深及戒斷次數的增多，可能出現焦慮、抑郁等伴隨癥狀。動物研究也表明酒精依賴后，動物會出現抑郁、焦慮等一系列中樞病變[14]。本研究采用改良后的動物模型，經過慢性酒精戒斷處理的小鼠表現出明顯的抑郁樣行為，表現為強迫游泳測試和懸尾測試中不動時間的增加，而給予PDE4抑制劑咯利普蘭能明顯翻轉酒精戒斷后產生的抑郁樣行為。

Figure 5.Western blot analysis of p-CREB and CREB protein levels in the hippocampus (A) and prefrontal cortex (B). Rol: rolipram. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol group (Rol 0 mg/kg);#P<0.05vsalcohol (Alco) group.

圖5 咯利普蘭對p-CREB 和CREB蛋白水平的影響

PDE4作為cAMP的特異性水解酶，調控著機體內cAMP活性。相關研究也發現無論是酒精依賴患者，亦或是抑郁癥患者腦內海馬與額葉皮質腦區都出現了明顯的cAMP水平降低[15]，而通過抑制PDE4活性，調節cAMP水平能明顯改善抑郁樣行為[16]。本實驗也論證了這一觀點，給予咯利普蘭后，能明顯翻轉因酒精戒斷引起的抑郁樣行為。此外，在酒精偏好測試中，給藥組小鼠的酒精攝入量明顯降低，提示咯利普蘭可能具有抑制酒精攝入的作用。相關研究也表明升高腦內cAMP水平能明顯減少酒精的攝入量[17]，說明咯利普蘭可能通過抑制PDE4活性而升高cAMP水平，進而抑制酒精的攝入。行為學研究與相關報道均表明cAMP水平的調節可能影響酒精攝入量與酒精依賴伴隨的抑郁癥狀，因此實驗進一步檢測了cAMP水平，發現模型組腦內海馬和前額葉皮質cAMP水平明顯低于正常對照組，而咯利普蘭能翻轉這一現象，表明PDE4-cAMP可能是治療酒精依賴后抑郁癥狀的靶點，并且cAMP第二信使通路可能與酒精依賴后抑郁癥密切相關。

Figure 6.Western blot analysis of BDNF expression in the hippocampus (A) and prefrontal cortex (B). Rol: rolipram. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol group (Rol 0 mg/kg);#P<0.05vsalcohol (Alco) group.

圖6 咯利普蘭對BDNF表達的影響

為深入探討酒精依賴后抑郁癥與PDE4介導的cAMP第二信使通路的相關性，本實驗檢測了cAMP依賴性蛋白激酶——PKA。cAMP發揮的各種效應主要是通過激活PKA來實現的。PKA能調節蛋白的磷酸化，進而激活特定的基因轉錄，如CREB與BDNF。相關研究也發現，酒精中毒后cAMP水平降低，PKA水平也隨之降低[18]，相似的是，抑郁動物腦內PKA水平相比于正常動物明顯降低[9]。本實驗結果發現，模型組小鼠海馬和前額葉皮質PKA水平降低，咯利普蘭通過抑制PDE4活性，升高cAMP水平，從而升高了PKA的表達，進而改善抑郁樣行為，提示PDE-cAMP-PKA通路與酒后抑郁有關。但是實驗結果僅表明PKA水平的變化可能與酒精戒斷引起的抑郁樣行為有關，其是否與抑制酒精攝入有關仍待進一步研究證實。

CREB與BDNF是cAMP第二信使通路中重要的兩類神經保護蛋白，也是PKA直接調控的與神經再生密切相關的兩類蛋白[19-20]。cAMP的激活將上調PKA含量，使得CREB磷酸化，并進入細胞核，促使BDNF的表達增加，進而促進神經元的再生。相關研究發現抑郁動物海馬和前額葉皮質CREB和BDNF異常[9, 21]。CREB與BDNF不僅與抑郁的發病密切相關，也與酒精依賴及戒斷密切相關。前期實驗成果已表明[9]，隨著酒精攝入量及戒斷次數的增加，CREB的磷酸化下降明顯。這一結論也在本實驗得到論證，模型組小鼠腦內磷酸化CREB表達降低，咯利普蘭給藥組能明顯增加CREB的表達，表明cAMP介導的第二信使通路可能通過增加CREB的磷酸化表達改善小鼠酒精戒斷后產生的抑郁樣行為。此外，酒精也影響這BDNF的表達，cAMP介導的BDNF表達不僅在神經元的存活、生長、分化發育過程中發揮著重要的作用，同時也參與物質成癮的過程。相關研究發現BDNF水平下降將導致酒精消耗量增加，而其水平的增加則會減少酒精的攝入。本實驗結果發現咯利普蘭給藥組小鼠酒精攝入量明顯減少，可能與cAMP介導的BDNF水平升高有關，但是BDNF表達僅在海馬腦區觀察到明顯增加，前額葉腦區雖有明顯增加趨勢，但并無統計學差異，可能涉及藥物給藥劑量及實驗誤差，因此相關結論仍需進一步論證。

綜上所述，酒精依賴戒斷后出現的抑郁樣癥狀可能與第二信使cAMP通路有關。本研究發現通過調節腦內PDE4活性，從而增加cAMP水平，能明顯翻轉酒精依賴戒斷誘導的抑郁樣行為，這一作用可能與PDE介導的cAMP-PKA-CREB-BDNF通路有關。此外，研究還發現咯利普蘭通過抑制PDE4活性，具有抑制酒精攝入的作用，可能與cAMP水平升高，以及BDNF表達增加有關，提示PDE介導cAMP通路可能參與酒精攝入及成癮過程，這一作用仍需在更多的臨床前及臨床研究中得到進一步論證。下一步研究將深入探討PDE4抑制劑對不同腦區的影響，確認藥物作用的靶部位，進一步確認cAMP通路與疾病的相關性，同時也為酒精依賴后抑郁癥的治療提供理論依據。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Phosphodiesterase 4 inhibitor rolipram prevents chronic alcoholism and withdrawal-induced depression-like behaviors in mice

JIANG Xi2, WANG Guo-kang1, ZHAO Ying-zheng3, YU Xue-feng1

(1ZhejiangPharmaceuticalCollege,2ZhejiangUniversityMingzhouHospital,Ningbo315000,China;3WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:yuxuefeng0527@163.com)

AIM: To investigate the effect of phosphodiesterase 4 (PDE4) inhibitor rolipram on the levels of cyclic adenosine monophosphate (cAMP), protein kinase A (PKA), cAMP response element-binding protein (CREB), phosphorylated CREB (p-CREB) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the hippocampus and the prefrontal cortex (PFC) of alcoholism model mice. METHODS: The mice (n=60) were randomly divided into control group, control+rolipram group, alcoholism model group, and alcohol+rolipram (0.1, 0.5 and 1 mg/kg) groups. The mice were given alcohol preference test on days 6, 13, 20 and 27. After the test, the mice received withdrawal of alcohol for 1 d. On day 28, the mice were given behavior test of depression, and after the test, the mice were sacrificed. The cAMP levels in the hippocampus and PFC were detected by ELISA, and the protein levels of PKA, CREB, p-CREB and BDNF were detected by Western blot. RESULTS: The mice showed an obvious drinking phenomenon (P<0.01), and the immobility time of forced swimming test and tail suspension test was significantly increased (P<0.01), with increasing drinking days and withdrawal times. However, chronic treatment with rolipram for 28 d reversed this phenomenon. Moreover, the cAMP levels in the hippocampus and PFC were significantly decreased after 28 d alcohol treatment (P<0.01), and pretreatment with rolipram (1 mg/kg) obviously reversed this decrease (P<0.01). Parallel to these changes of cAMP, the protein levels of PKA, p-CREB and BDNF were also decreased in the hippocampus and PFC (P<0.01), and 28 d rolipram administration inhibited the decreased cAMP, PKA, p-CREB and BDNF levels in the hippocampus. Moreover, 28 d rolipram administration also reversed decreased cAMP, PKA and p-CREB in the PFC. CONCLUSION: Rolipram treatment protects against alcohol-induced depression-like behaviors, and also reduces alcohol drinking. These effects may be related to PDE4-cAMP-PKA-CREB-BDNF pathway.

Rolipram; Depression; Chronic alcoholism; Hippocampus; Prefrontal cortex

1000- 4718(2017)02- 0193- 07

2016- 08- 16

2016- 11- 21

國家自然科學基金資助項目(No. 81360195)；寧波市自然科學基金資助項目(No. 2016A610239)；浙江醫藥高等專科學校科研項目(No. ZPCSR2016003)

R749.6; R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.001

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