豬日本乙型腦炎的PCR診斷

秦潔

（新鄉縣農牧局，河南新鄉453000）

豬日本乙型腦炎的PCR診斷

秦潔

（新鄉縣農牧局，河南新鄉453000）

日本乙型腦炎病毒（JEV）是一種單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬成員，也是一種重要的人獸共患病病原，可感染人和豬、馬、牛、羊、鼠、犬及禽類等多種動物，以流行性乙型腦炎為主的急性傳染病。其中，豬是日本乙型腦炎病毒的主要易感動物之一。豬感染日本乙型腦炎病毒主要表現為繁殖障礙和腦炎，臨床上以妊娠母豬發生流產，產死胎、木乃伊胎，公豬睪丸腫大為特征，腦炎癥狀多由感染的仔豬表現。筆者將一例豬感染日本乙型腦炎病毒的PCR診斷進行報道，以供參考。

1 臨床病例

2016年7月份至8月份，一小型養豬場陸續有14頭妊娠母豬發生流產，除偶有胎衣不下外，未見其他明顯的臨床癥狀。采集流產病豬和胎兒的主要臟器、睪丸、腹股溝淋巴結及胎衣送到新鄉縣進行布魯氏菌、衣原體、豬細小病毒、日本乙型腦炎病毒和豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒等與流產相關的病原檢測。

2 實驗室診斷

2.1 病料的DNA和RNA提取

將采集的病料組織加液氮充分研磨。取部分研磨好的樣品進行總DNA的提取，樣品以500 μl DNA提取液（10%SDS，20 mg/ml蛋白酶K）在56℃水浴中消化2 h是樣品完全裂解，加入等體積酚/氯仿/異戊醇萃取2次，上清中加入等體積的異丙醇和1/10體積的3 mol/L醋酸鈉，于-80℃冰箱中2 h沉淀DNA，12 000 r/min離心30 min，棄上清，所得白色沉淀即為DNA，晾干，加100 μl TE緩沖液溶解DNA，保存備用。取部分研磨好的樣品進行總RNA的提取，樣品以1 000 μl溶解TRizol，離心，上清加等體積氯仿充分混勻，離心去上清，重復此步驟一次，所得上清中加入異丙醇，于-80℃冰箱中沉淀RNA，12 000 r/min離心30 min，棄上清，所得白色沉淀即為RNA，晾干，加RNase free H2O溶解RNA，常規方法反轉錄為cDNA備用。

2.2 PCR檢測

布魯氏菌、衣原體和豬細小病毒的基因組為DNA，PCR檢測時以所提取的DNA為模板，日本乙型腦炎病毒和豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的基因組為RNA，PCR檢測時以反轉錄所得的cDNA為模板。以Takara Premix Taq?（Ex Taq?Version 2.0 plus dye）預混酶進行擴增，50 μl PCR反應體系含25 μl Premix Taq，2 μl模板，2 μl相應的上下游檢測引物，21 μl H2O。本試驗檢測日本乙型腦炎病毒所用引物為P1：5’-GATCTGGTGTTAGAAGG AGA-3’；P2：5’-TCACAATCCAGTGTGACTTC-3’。PCR反應條件為95℃預變性后，94℃變性45 s，52～57℃退火45 s，72℃延伸45 s，設35個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3 結果

將PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果發現，僅日本乙型腦炎病毒核酸陽性，在510 bp處有一條特異性目的條帶，而布魯氏菌、衣原體、豬細小病毒和豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的PCR結果均為陰性，這表明該豬場的母豬流產由豬日本乙型腦炎病毒感染引起。

4 討論

日本乙型腦炎又稱流行性乙型腦炎，是由日本乙型腦炎病毒感染引起的以中樞神經系統病變為主要特征的人獸共患傳染病。日本乙型腦炎屬于自然疫源性疾病，具有一定的季節性和區域性，與蚊的活動有密切關系，主要發生在蚊蟲較多的6～9月間。人和多種動物對日本乙型腦炎病毒均易感，人被感染發生乙型腦炎。牛、羊和禽類在多數情況下為隱性感染，不表現明顯臨床癥狀。馬感染后多表現腦炎癥狀，而豬主要表現為流產、死胎和睪丸炎等。豬被認為是日本乙型腦炎病毒最重要的天然宿主，通過豬—蚊—豬的流行環節在動物間循環。因此，豬日本乙型腦炎是一種威脅人畜健康的常見傳染病。

由日本乙型腦炎病毒感染引起的豬群繁殖障礙在我國規?；B殖場中比較常見。以流產為主要特征的豬日本乙型腦炎可根據該病的流行病學特點和臨床癥狀進行初步診斷，但需要與常見的可引起流產相關的病原如布魯氏菌、衣原體、偽狂犬病毒、豬細小病毒、豬圓環病毒、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒等進行區分。豬日本乙型腦炎的流行呈明顯的季節性，而豬布魯氏菌病、衣原體、偽狂犬病、豬細小病毒病等沒有流行的季節性；豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒感染的豬群除母豬發生流產、早產、死產和產木乃伊胎外，斷奶前仔豬表現呼吸道綜合征，新生仔豬死亡率很高；圓環病毒與之類似，對發病豬群中的仔豬影響很大。豬場發病時，可用血清學或分子生物學方法對上述病原進行診斷。筆者對發病豬場采集的樣品進行了布魯氏菌、衣原體、豬細小病毒、日本乙型腦炎病毒和豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的PCR檢測，發現所采集的病料中日本乙型腦炎病毒核酸為陽性，而其他病原的核酸為陰性。由于豬場的流產時節正值蚊蟲活躍，豬日本乙型腦炎的流行期，結合臨床癥狀，可以斷定該發病豬場的流產病例為豬日本乙型腦炎。

豬日本乙型腦炎目前尚無特效的治療藥物。在防控方面，豬發病時應及時隔離，根據臨床癥狀進行對癥治療，以防止繼發感染。蚊蟲既是日本乙型腦炎病毒的傳播媒介，也是病毒的貯存宿主，因此可通過殺滅蚊蟲來阻斷其傳播途徑進行該病的預防。加強飼養管理，保持豬場的環境衛生，疏通溝渠，及時排除積水和污水，消除蚊蟲孳生地，定期消毒等。另外，給豬群定期免疫接種可有效預防和控制該病。一般對后備公豬和母豬在當地乙型腦炎流行季節前1～2個月，按量接種日本乙型腦炎病毒弱毒疫苗，接種后1個月可產生免疫保護力。以后則按常規每年注射1次，有較好的預防效果。

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1004-5090（2017）08-0045-01

2017-06-11）