喹諾酮類耐藥福氏志賀菌的相關耐藥基因研究

張雯霞， 張 玨， 陳洪友， 屠麗紅， 陳 敏

·論著·

喹諾酮類耐藥福氏志賀菌的相關耐藥基因研究

張雯霞1， 張 玨1， 陳洪友2， 屠麗紅2， 陳 敏2

目的 了解2010－2014年上海市各區縣醫院139株福氏志賀菌的耐藥性，探討福氏志賀菌對喹諾酮類藥物的耐藥機制。方法 用紙片擴散法測定菌株對14種抗菌藥物的敏感性，用環丙沙星E試驗條測定其最低抑菌濃度；采用PCR法檢測DNA旋轉酶A亞單位（gyrA）、拓撲異構酶Ⅳ C亞單位（parC）基因的喹諾酮類藥物耐藥決定區（QRDR），同時對質粒介導喹諾酮類耐藥（PMQR）基因qnrA、qnrB、qnrS和氨基糖苷乙酰轉移酶變異基因aac（6'） -Ib-cr進行篩選。擴增產物進行DNA測序。結果 福氏志賀菌對氨芐西林、鏈霉素、四環素、萘啶酸的耐藥率都達到了90 %以上，對環丙沙星的耐藥率達到了40.3 %，同時有30.2 %菌株對頭孢吡肟產生了耐藥。gyrA和parC基因的突變率分別為98.6 %和97.8 %。gyrA基因存在Ser83、Asp87和His211 3個位點的突變，parC基因只檢測到Ser80 1個位點的突變；共檢測到9株qnrS和6株aac（6'） -Ib-cr喹諾酮耐藥質粒。結論 上海地區福氏志賀菌耐藥情況嚴重。QRDR相關基因突變率高，Asp87的突變對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥起著主導作用，而耐藥質粒起著重要的輔助作用。

志賀菌； 喹諾酮類； 耐藥基因

細菌性痢疾是全世界范圍內流行的最常見的腹瀉性疾病之一，亞洲每年感染志賀菌的患者約

1.25 億例，死亡人數達1.4萬例[1]。合理的抗菌治療可有效減輕癥狀，降低并發癥發生的風險。氟喹諾酮類藥物一直是臨床治療細菌性痢疾的一線抗菌藥物。然而隨著此類藥物的廣泛應用，志賀菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性不斷增加，特別是福氏志賀菌的耐藥情況更加嚴重。為了解福氏志賀菌的耐藥情況和對喹諾酮藥物的耐藥機制，本研究對2010―2014年從上海各區縣醫院臨床分離的139株福氏志賀菌進行了抗菌藥物敏感性試驗，并對喹諾酮類藥物耐藥決定區（QRDR）相關基因，即DNA旋轉酶A亞單位（gyrA）、拓撲異構酶ⅣC亞單位（parC）進行檢測，對質粒介導喹諾酮耐藥（PMQR）基因qnrA、qnrB、qnrS和aac（6'） -Ib-cr進行篩選。現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集上海市各區縣醫院2010－2014年從門診腹瀉患者中分離得到139株福氏志賀菌，經法國生物梅里埃VITEK2生化鑒定儀鑒定，并用日本Denka Seiken生研公司的志賀菌診斷血清進行血清學確認。PMQR基因PCR篩選的qnrA、qnrB、qnrS和aac （6'） -Ib-cr陽性對照株均由復旦大學附屬華山醫院抗生素研究所贈送。

1.1.2 儀器和試劑 藥敏紙片、MH瓊脂、E試驗條購自英國OXOID公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司； TaKaRa ExTaq DNA聚合酶、TaKaRa DL2000 DNA Maker、Agarose瓊脂糖購自寶生物工程（大連）有限公司；溴化乙錠（EB）購自美國Sigma公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。主要儀器包括PCR基因擴增儀（Bio-Rad DNA Engine Dyad）、脈沖場凝膠電泳儀（Bio-Rad CHEF Mapper）、凝膠成像系統（Bio-Rad GEL Doc2000）。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性試驗 藥物敏感性試驗采用改良的紙片擴散法和最低抑菌濃度法。抗菌藥物包括氨芐西林、環丙沙星、頭孢噻肟、頭孢吡肟、甲氧芐啶-磺胺甲唑、左氧氟沙星、阿莫西林-克拉維酸、氯霉素、頭孢西丁、萘啶酸、諾氟沙星、鏈霉素、四環素、磺胺復合物等14種。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，結果判斷參照2015年美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）標準[2]。

1.2.2 PCR擴增試驗 細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，PCR法檢測QRDR相關基因gyrA、parC和PMQR基因qnrA、qnrB、qnrS、aac（ 6'） -Ib-cr。引物序列長度及退火溫度見表1[3-8]，擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃ 1 min，54～61 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃，4 min。PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳，EB染液染色，在紫外燈下觀察結果，且采用GEL Doc 2000凝膠成像系統凝膠成像，出現與陽性對照相當的目的條帶即判為陽性。

1.2.3 DNA測序 PCR擴增產物原液送上海邁浦生物科技有限公司雙向測序。測序結果經拼接后在GenBank中經BLAST進行比對分析。gyrA、parC以福氏志賀菌F2a 301（GenBank中的參比號為AE005674）作為參比菌株。

2 結果

2.1 藥物敏感性試驗

139株福氏志賀菌對14種抗菌藥物的敏感性試驗結果顯示志賀菌的耐藥情況嚴重，對氨芐西林、鏈霉素、四環素、萘啶酸的耐藥率在90 %以上，分別為94.2 %、95.0 %、93.5 %和98.6 %。對喹諾酮類抗菌藥物環丙沙星的耐藥率達到了40.3 %，同時有30.2 %菌株對第四代頭孢菌素頭孢吡肟產生了耐藥，見表2。

2.2 QRDR相關基因的突變分析

139株福氏志賀菌中， 137株菌株發生了gyrA基因的突變，突變率達到了98.6 %；有136株菌株發生了parC基因的突變，突變率達到了97.8 %。gyrA基因檢測到Ser83、Asp87和His211這3個位點的點突變，其中Ser83→Leu位點突變的有137株，Asp87→Asn位點突變有48株，Asp87→Gly位點突變有15株，His211→Tyr位點突變有131株。ParC基因只檢測到Ser80這一個位點的點突變，其中有132株表現為Ser80→Ile位點突變，4株表現為Ser80→Arg的位點突變。

139株菌株中，僅有2株未檢測到QRDR任何氨基酸的突變，其環丙沙星的MIC分別為0.006和0.016 mg/L，見表3。發生氨基酸突變的137株福氏志賀菌中有136株呈現出gyrA和parC 2個亞基的同時突變，僅有1株只表現為gyrA基因的突變。其中有45株菌株有gyrA基因的Ser83、Asp87、His211 3個位點和parC基因Ser80位點的同時突變，占32.4 %，其環丙沙星的MIC為2～24 mg/L；最為普遍的是gyrA基因的Ser83、His211和parC基因Ser80這3個位點的突變，占50.4 %（70/139），其環丙沙星的MIC為0.19～32 mg/L。

56株環丙沙星耐藥的福氏志賀菌中，有44株表現為Ser83、Asp87、His211和Ser80這4個位點的同時突變，占81.5 %，而在環丙沙星敏感菌株中沒有出現4個位點的同時突變。64株環丙沙星敏感的福氏志賀菌中，有90.6 %的菌株表現為Ser83、His211和Ser80這3個位點的同時突變。所有環丙沙星敏感的菌株均未出現gyrA基因的Asp87位點的突變。

表1 喹諾酮類耐藥相關基因引物序列Table 1 Primer sequences for amplifying the genes related to quinolone resistance

表2 139株福氏志賀菌對14種抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 2 Susceptibility of 139 strains of Shigella f exneri to 14 antimicrobial agents（%）

表3 志賀菌QRDR氨基酸突變和喹諾酮類藥物耐藥性關系Table 3 Relationship of amino acid mutations in QRDR and resistance to quinolones

2.3 喹諾酮耐藥質粒的鑒定

139株福氏志賀菌中，檢測到9株qnrS和6株aac （6'） -Ib-cr喹諾酮耐藥質粒，分別占6.5 %和

4.3 %，見表4，未檢測到qnrA和qnrB基因。qnrS測序結果在NCBI GenBank上進行同源性比對，其基因核苷酸序列均與注冊號為KP773319的qnrS1基因序列號同源性為100 %。攜帶有PMQR基因的菌株，其環丙沙星的MIC為0.5～32 mg/L，同時均伴有gyrA基因的Ser83、His211和parC基因Ser80這3個位點的突變，除了菌株SH12-13和SH12-33同時伴有gyrA基因的Ser83、Asp87、His211 3個位點和parC基因Ser80位點的突變。

3 討論

氟喹諾酮類一直是臨床治療細菌性痢疾的常用抗菌藥物，隨著氟喹諾酮類藥物在臨床以及農業、畜牧業的長期使用，其耐藥率近年來有明顯的上升趨勢。最近美國CDC通過對2014年5月到2015年2月的宋內志賀菌進行分析，發現其對環丙沙星的耐藥率達到了87 %[9]。本研究顯示，福氏志賀菌對環丙沙星、諾氟沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別達到了40.3 %、27.3 %和11.5 %。這就提示我們有必要對志賀菌進行長期的耐藥監測，以指導臨床進行有效用藥。

氟喹諾酮類的耐藥主要是DNA旋轉酶和拓撲異構酶Ⅳ的QRDR發生突變所致[10-11]，通常在gyrA基因的Ser83和Asp87氨基酸殘基突變的基礎上，進一步發生parC基因的Ser80和Glu84氨基酸殘基的替換才會導致腸桿菌科細菌對喹諾酮類藥物高水平耐藥[12]。本研究對139株福氏志賀菌的研究發現，所有菌株gyrA基因的83位絲氨酸都被亮氨酸所替換，并且同時存在其他位點的突變，除了SH10-35和SH14-1這2株未檢測到QRDR任何氨基酸的突變，其環丙沙星的MIC分別為0.006和0.016 mg/L。gyrA基因除了Ser83和Asp87這2個位點突變之外，同時檢測到His211這個位點的突變，其突變率達到了94.2 %（131/139）。His211→Tyr的氨基酸改變是新發現的突變位點，烏拉圭于2014年在福氏志賀菌中最新檢測到這個位點的突變[13]，在國內未曾有過報道。可見，上海地區福氏志賀菌在QRDR區氨基酸的突變率極高。

64株環丙沙星敏感菌株中，均未檢測到gyrA基因Asp87這個位點的突變；56株環丙沙星耐藥菌株中，只有9株未檢測到Asp87的突變。可見Asp87這個位點的突變對喹諾酮類的耐藥起著主導作用。首先是gyrA基因Ser83發生突變，如果聯合His211或/和parC基因Ser80的突變，菌株對于喹諾酮類的敏感率就會下降。一旦發生gyrA基因Asp87的突變就很有可能導致菌株對喹諾酮類的耐藥。之前的研究表明gyrA基因中Ser83和Asp87的雙重突變與福氏志賀菌對喹諾酮類的耐藥密切相關[14]，我們的結論與之相符。本研究中發現，64株環丙沙星敏感的福氏志賀菌中，有90.6 %的菌株表現為Ser83、His211和Ser80這3個位點的同時突變，如果再合并Asp87氨基酸的突變，那就會導致菌株對喹諾酮類的耐藥。

PMQR是近10年來新發現的細菌耐藥機制，耐藥質粒是染色體之外，具有獨立自主遺傳功能的雙鏈DNA，通過接合轉移、轉化、轉導、轉座及整合等方式進行水平傳播，并可編碼一種或多種抗菌藥物的耐藥性，從而傳播耐藥性。目前已報道的PMQR包括qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、aac（6'）-Ib-cr和qepA。其中攜帶qnr基因的喹諾酮耐藥質粒在世界范圍流行。在杭州，15株喹諾酮耐藥的志賀菌中檢測到5株攜帶qnrS耐藥質粒，2株攜帶aac（6'）-Ib-cr耐藥質粒[10]。在安徽，53.8 %（14/26）志賀菌檢測到喹諾酮耐藥質粒，其中qnrA1、qnrS1、qnrS2、aac（6'） -Ib-cr和qepA分別占30.8 %、11.5 %、3.8 %、19.2 %和11.5 %[15]。在河南，293株志賀菌中檢測到6株攜帶有qepA基因，19株攜帶有aac（6'）-Ib-cr基因，分別占2.05 %和6.48 %[3]。本研究中，139株福氏志賀菌中檢測到qnrS基因和aac（6'）-Ib-cr各9和6株，分別占6.5 %和4.3 %，未檢測到qnrA和qnrB基因。可見，攜帶有喹諾酮類耐藥質粒的志賀菌在中國存在的年代已久，因其能夠進行水平傳播，故質粒所介導的耐藥菌株在不斷的擴散和蔓延。同時，PMQR基因對染色體介導的喹諾酮類耐藥起重要的輔助作用，使細菌更容易發生高水平的耐藥[16]。在本研究中，9株87位沒有氨基酸改變卻對環丙沙星耐藥的菌株中有7株攜帶有喹諾酮耐藥質粒aac（6'）-Ib-cr或qnrS1，更加證實了這一結論。也有研究表明，在各耐藥質粒中，qnrS基因在菌株的耐藥中起到主導作用[17-18]。我們的試驗結果也與之相符：9株攜帶有qnrS耐藥質粒的菌株其環丙沙星的MIC均要高于攜帶有aac（6'）-Ib-cr耐藥質粒的菌株，除了有1株菌株SH10-48，其環丙沙星的MIC達到了32 mg/L，而其攜帶的是aac（6'）-Ib-cr耐藥質粒，可能是這株菌株同時存在著其他耐藥機制，導致對喹諾酮類藥物的高度耐藥，值得我們進一步去研究和探討。

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Genes conferring quinolone resistance in Shigella f exneri

ZHANG Wenxia, ZHANG Jue, CHEN Hongyou, TU Lihong, CHEN Min. （Department of Clinical Laboratry, Shanghai Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditionaly Chinese Medicine, Shanghai 201203, China）

Objective To investigate the antimicrobial resistance prof le of Shigella f exneri in Shanghai from 2010 to 2014 and examine the mechanism of f uoroquinolone resistance. Methods Kirby-Bauer method was used to determine the susceptibility of the S. f exneri strains to 14 antibiotics. The minimum inhibitory concentration (MIC) of ciprof oxacin was tested by E-test. Mutations within quinolone resistance determining regions (QRDR) of gyrA and parC and plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) genes, qnrA, qnrB, qnrS and aac(6')-Ib-cr were identif ed by polymerase chain reaction (PCR). All the products were subjected to sequencing analysis. Results More than 90 % of the 139 S. f exneri isolates were resistant to ampicillin, streptomycin, tetracycline, and nalidixic acid, 40.3 % to ciprof oxacin and 30.2 % to cefepime, respectively. Genetic mutation of gyrA and parC was found in 98.6 % and 97.8 % of the strains, respectively. Three point mutations (Ser83, Asp87 and His211) were detected in gene gyrA and one point mutation (Ser80) was found in in gene parC. Plasmid-mediated resistant gene qnrS was found in 9 strains and aac(6')-Ib-cr in 6 strains. Conclusions The antibiotic resistance of S. f exneri is serious in Shanghai. The mutation rate within QRDR is high. Point mutation in Asp87 of gyrA is the main mechanism of quinolone resistance. The plasmid-mediated quinolone-resistant genes also play an important supplementary role.

Shigella; quinolone; resistant gene

R378.22

A

1009-7708 ( 2017 ) 01-0046-06

10.16718/j.1009-7708.2017.01.009

2016-01-15

2016-02-19

上海市公共衛生重點學科衛生微生物學（12GWZX 0801）。

1. 上海中醫藥大學附屬曙光醫院檢驗科，上海 201203；2. 上海市疾病預防控制中心細菌檢測實驗室。

張雯霞（1981—），女，碩士，主管技師，主要從事腸道致病菌耐藥機制研究。

陳敏，E-mail：chenmin@scdc.sh.cn。