流感病毒兩種快速抗原檢測(cè)方法的對(duì)比分析

陳 晨 ， 范清琪， 陳 剛， 朱夢(mèng)琪， 吳 晶， 張文宏， 金嘉琳

·論著·

流感病毒兩種快速抗原檢測(cè)方法的對(duì)比分析

陳 晨 ， 范清琪， 陳 剛， 朱夢(mèng)琪， 吳 晶， 張文宏， 金嘉琳

目的 分析比較兩種流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金免疫層析法）檢測(cè)的一致性，評(píng)價(jià)新型的基于銀鹽擴(kuò)增技術(shù)的流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒在臨床中的應(yīng)用。方法 選擇2015年1月1日―2月28日在復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院就診的體溫＞37.5℃，且具有流感樣癥狀的患者，同時(shí)采集雙份鼻拭子標(biāo)本。采用IMMUNO AG Cartridge Flu AB試劑盒（簡稱AG1法）與甲型/乙型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒（簡稱CV法）同時(shí)檢測(cè)，并作PCR檢測(cè)以確證。結(jié)果 共檢測(cè)患者91例，AG1法測(cè)定甲型流感病毒陽性7例，乙型流感病毒陽性53例；CV法測(cè)定甲型流感病毒陽性7例，其中弱陽性3例，乙型流感病毒陽性50例，其中弱陽性4例；PCR法檢測(cè)甲型流感病毒陽性8例，乙型流感病毒陽性60例。AG1法檢測(cè)甲型流感病毒靈敏度87.5 %，特異度100 %，乙型流感病毒靈敏度88.3 %，特異度100 %。CV法檢測(cè)甲型流感病毒靈敏度87.5 %，特異度100 %，乙型流感病毒靈敏度83.3 %，特異度100 %。AG1法與CV法兩種抗原快速檢測(cè)甲型流感病毒檢測(cè)的陽性符合率100 %，乙型流感病毒的陽性符合率94.3 %。結(jié)論 兩種流感病毒快速抗原檢測(cè)方法一致性較好，AG1檢測(cè)法可以減少針對(duì)弱陽性標(biāo)本的人為判讀誤差，可應(yīng)用于流感早期診斷。

流感； 快速抗原檢測(cè)； 免疫層析法

近年來流感的疫情頻繁出現(xiàn)，2005年H5N1人禽流感，2009年新甲型H1N1流感，2013年的H7N9禽流感疫情，引起了人們對(duì)流感更多的認(rèn)識(shí)與關(guān)注。流感流行對(duì)社會(huì)穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成很大影響，根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心數(shù)據(jù)，2014年我國報(bào)告流行性感冒病例21萬例，死亡43例。雖然目前尚無特效藥物可以完全治愈流感，但是早期應(yīng)用合適的抗病毒治療可縮短疾病的持續(xù)時(shí)間，減輕癥狀的嚴(yán)重程度，減少并發(fā)癥的發(fā)生[1-2]，并采取適當(dāng)隔離防護(hù)措施，為阻斷病毒在人群流行提供幫助。鑒于流感臨床癥狀的非特異性，迫切需要一種準(zhǔn)確的早期診斷方法，以期能早期應(yīng)用抗病毒藥物，及時(shí)控制病情。本研究通過比較兩種流感病毒抗原檢測(cè)方法試劑盒（膠體金免疫層析法）檢測(cè)的一致性，以PCR核酸檢測(cè)作為確證依據(jù)，評(píng)價(jià)富士醫(yī)療器械（中國）投資公司提供的流感病毒抗原檢測(cè)方法試劑盒（膠體金免疫層析法）在臨床驗(yàn)證中的效能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 2015年1月1日至2月28日，于復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院就診，符合體溫＞37.5 ℃，并伴有以下癥狀之一：頭痛、關(guān)節(jié)疼痛、肌肉痛、咳嗽、喉嚨痛、流涕乏力等全身癥狀的患者，所有患者均簽署知情同意書。總共91例患者，其中男44例，女47例，年齡17～83歲，平均47歲。

1.1.2 試劑與儀器 富士醫(yī)療器械（中國）投資公司提供的IMMUNO AG Cartridge Flu AB試劑盒和FUJI DRI-CHEM IMMUNO AG1分析儀（AG1法）；Clearview甲型/乙型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）（CV法），生產(chǎn)廠家為艾博生物醫(yī)藥（杭州）公司； 甲型和乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法) ，生產(chǎn)廠家為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，PCR分析儀廠家為ABI公司，型號(hào)：VII 7。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與處理 由經(jīng)過培訓(xùn)的醫(yī)務(wù)人員用2支滅菌棉棒同時(shí)采取患者同一側(cè)鼻拭子樣本，分別按照兩個(gè)抗原快速檢測(cè)試劑盒說明書操作，將上述兩份檢測(cè)標(biāo)本的殘余液混合后行PCR檢測(cè)。

1.2.2 AGI法操作流程 將棉棒放入含有抽取液的軟管中，從軟管外側(cè)用手指擠壓棉棒數(shù)次，然后絞干拔出棉棒，換裝滴注頭，向AG1試劑盒滴注4滴，將試劑盒插入FUJI DRI-CHEM IMMUNO AG1分析儀，蓋上盒蓋后檢測(cè)自動(dòng)開始，15 min后儀器自動(dòng)判讀并打印報(bào)告。

1.2.3 CV法操作流程 向軟管內(nèi)滴6滴抽取液，將1支棉棒放入后，旋轉(zhuǎn)擠壓棉頭，拔出棉棒，將檢測(cè)試劑條放入軟管，15 min后醫(yī)務(wù)人員根據(jù)條帶判讀結(jié)果。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)（RT-Realtime）PCR檢測(cè)流感病毒核酸 將上述兩種抗原檢測(cè)的剩余液各留取一部分混合后用于RT-Realtime PCR檢測(cè)。 采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的甲型和乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR- 熒光探針法），ABI公司VII7型PCR分析儀，嚴(yán)格按照說明書操作。利用RT-Realtime PCR檢測(cè)技術(shù)，采用一對(duì)針對(duì)甲型或乙型流感病毒核蛋白（NP）基因的特異性引物和一條特異性TagMan熒光探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中流感病毒的定性檢測(cè)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用State 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，以RT-Realtime PCR法為參照評(píng)價(jià)兩種快速抗原檢測(cè)的診斷價(jià)值，陽性率比較采用卡方檢驗(yàn)，并作靈敏度和特異度分析，兩種快速抗原檢測(cè)結(jié)果的一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 抗原快速檢測(cè)與PCR核酸檢測(cè)結(jié)果

在91例發(fā)熱伴流感樣癥狀患者鼻拭子標(biāo)本中，PCR法檢測(cè)出甲型流感病毒陽性8例，陽性率8.8 %，乙型流感病毒陽性60例，陽性率

65.9 %，其中有1例甲型流感病毒與乙型流感病毒均為陽性。AG1法檢測(cè)出甲型流感病毒陽性7例，陽性率7.7 %，乙型流感病毒陽性53例，陽性率

58.2 %；CV法檢測(cè)出甲型流感病毒陽性7例，陽性率7.7 %，其中弱陽性3例，乙型流感病毒陽性50例，陽性率54.9 %，其中弱陽性4例，見表1。AG1法與PCR核酸檢測(cè)甲型流感的陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.072 7，P=0.788），CV法與PCR核酸檢測(cè)甲型流感的陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.072 7，P=0.788），AG1法與PCR核酸檢測(cè)乙型流感的陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.143 8，P=0.285），CV法與PCR核酸檢測(cè)乙型流感的陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.298 0，P=0.130），AG1法與CV法檢測(cè)甲型流感的陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.000，P=1.000）， AG1法與 CV法檢測(cè)乙型流感的陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.201 3，P=0.654）。

表1 抗原快速檢測(cè)與PCR結(jié)果比較Table 1 Comparison between rapid antigen assays and PCR

2.2 兩種快速檢測(cè)法結(jié)果比較

AG1法與CV法兩種抗原快速檢測(cè)的一致性較好，甲型流感病毒檢測(cè)的陽性符合率100 %，乙型流感病毒的陽性符合率94.3 %，見表2。兩種快速抗原檢測(cè)的臨床效能比較見表3，兩種抗原快速檢測(cè)法對(duì)于甲型和乙型流感病毒檢測(cè)陽性預(yù)測(cè)值均為100 %，AG1法對(duì)于甲型和乙型流感病毒檢測(cè)陰性預(yù)測(cè)值分別為98.8 %和81.6 %，CV法對(duì)于甲型和乙型流感病毒檢測(cè)陰性預(yù)測(cè)值分別為

98.8 %和75.6 %。

表2 AG1法與CV法一致性比較Table 2 Consistency between IMMUNO AG Cartridge Flu AB kit and Clearview exact Inf uenza A&B system in identifying Inf uenza

表3 兩種抗原快速檢測(cè)的靈敏度和特異度Table 3 Sensitivity and specif city of IMMUNO AG Cartridge Flu AB kit versus Clearview exact Inf uenza A&B system in diagnosis of Inf uenza

3 討論

目前用于流感病毒的檢測(cè)技術(shù)主要包括病毒分離培養(yǎng)法，免疫熒光技術(shù)（IFA），酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)，膠體金免疫層析技術(shù)，RT-PCR等。流感病毒分離培養(yǎng)是流感病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞培養(yǎng)逐漸發(fā)展取代傳統(tǒng)雞胚培養(yǎng)，RT-PCR有很高的靈敏度，兩者可用于病毒亞型的鑒定和抗原變異分析，但是兩者操作技術(shù)要求高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

基于膠體金免疫層析技術(shù)的流感抗原快速檢測(cè)已有商品化試劑盒，操作簡便，雖不能作亞型鑒定，但優(yōu)勢(shì)在于能在短短數(shù)分鐘時(shí)間內(nèi)快速作出定性診斷，陽性者可以進(jìn)一步通過PCR法或病毒分離培養(yǎng)行亞型鑒定。一方面在流感早期診斷中起了重要的作用，早期使用神經(jīng)氨酸酶抑制劑，控制病情發(fā)展，緩解癥狀，而對(duì)于檢測(cè)陰性者可以避免過度治療。另一方面，在流感流行季節(jié)也是疫情檢測(cè)調(diào)查的有效手段，可以及時(shí)與普通上呼吸道感染等區(qū)分鑒別，采取隔離措施，同病種隔離，能夠有效阻斷流感播散，避免疫情擴(kuò)大。根據(jù)此次篩查監(jiān)測(cè)結(jié)果，2015年1月至2月間，來本院就診的季節(jié)性流感以乙型流感為主。

一般情況下快速檢測(cè)的特異度超過90 %，靈敏度在10 %～90 %，靈敏度的差異受拭子材料、患者年齡、病程、呼吸道標(biāo)本種類等影響[3]。為了提高檢測(cè)效能，人們嘗試了一些新的技術(shù)，例如采用鉑代替膠體金[4]、酶免疫測(cè)定[5]。新型的富士醫(yī)療器械（中國）投資公司提供的流感病毒抗原檢測(cè)方法試劑盒（膠體金免疫層析法），使用銀鹽增幅照相技術(shù)，自動(dòng)放大洗凈功能[6]，比普通免疫層析法靈敏度更高。本研究結(jié)果顯示AG1法乙型流感的檢出靈敏度（88.3 %）高于現(xiàn)有的商品化試劑盒（83.3 %），特異度達(dá)到100 %，考慮需要更大樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)一步評(píng)價(jià)。這種新的檢測(cè)方法更多的優(yōu)勢(shì)是配合FUJI DRI-CHEM IMMUNO AG1分析儀，能夠檢測(cè)自動(dòng)判讀，降低人為誤差。在本試驗(yàn)中有4例乙型及3例甲型流感患者，CV法肉眼判讀為弱陽性，若在欠經(jīng)驗(yàn)操作者手中存在判讀為陰性的可能而造成漏診；判讀標(biāo)本結(jié)果需要15 min，時(shí)間過長或過短都可能造成錯(cuò)誤判斷，傳統(tǒng)的試劑盒必須人為計(jì)時(shí)，而機(jī)器自動(dòng)操作無需時(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，提高工作效率。綜上所述，該試劑盒可以作為初步篩查和診斷參考。

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A new silver amplification immunochromatography system compared with conventional rapid antigen assay for the diagnosis of inf uenza A and B

CHEN Chen, FAN Qingqi, CHEN Gang, ZHU Mengqi, WU Jing, ZHANG Wenhong, JIN Jialin. （Department of Infectious Diseases, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China）

Objective To analyze the consistency of two rapid antigen assays for the diagnosis of inf uenza A and B. We evaluated the clinical usefulness of silver amplif cation immunochromatography inf uenza virus detection kit. Methods Nasopharyngeal swab samples were collected from patients who were suspected of inf uenza at Huashan Hospital between January and February 2015. Two samples were collected from the same one patient. The samples were tested simultaneously by using IMMUNO AG Cartridge Flu AB kit (AG1) and commercial immunochromatographic assay kit, Clearview exact inf uenza A&B (CV). PCR method was used as reference. Results A total of 91 samples were tested, of which 7 were positive for inf uenza A and 53 positive for inf uenza B by AG1 system; 7 positive for inf uenza A and 50 positive for inf uenza B by CV system; and 8 positive for inf uenza A and 60 positive for inf uenza B by PCR. The sensitivity and specif city of the AG1 system were 87.5 % and 100 % for inf uenza A, and 88.3 % and 100 % for inf uenza B; while the CV system showed sensitivity and specif city of 87.5 % and 100 % for inf uenza A, 83.3 % and 100 % for inf uenza B. The AG1 system was 100 % consistent with the CV system in the positive rate of inf uenza A, and 94.3 % consistent with the CV system in the positive rate of inf uenza B. Conclusions The AG1 system is well consistent with the conventional immunochromatography-based diagnostic tests in diagnosis of inf uenza. The AG1 system is useful in earlier diagnosis of inf uenza due to fewer human error in result interpretation.

influenza; rapid antigen assay; immunochromatographic system

R373.13

A

1009-7708 ( 2017 ) 01-0029-04

10.16718/j.1009-7708.2017.01.005

2016-02-04

2016-07-07

上海市級(jí)醫(yī)院新興前沿技術(shù)項(xiàng)目（SHDC12014104）。

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科，上海 200040。

陳晨（1981—）女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事感染性疾病的臨床診療。

金嘉琳，E-mail：jinjialin@fudan.edu.cn。