大豆異黃酮對家兔健康性能的影響試驗

肖琛聞，金妙仁，劉 燕，韋 強，季權安，李 科，趙 劍，鮑國連*

（1.浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所，浙江杭州 310021；2.杭州啟明星生物營養有限公司，浙江杭州 310021）

大豆異黃酮對家兔健康性能的影響試驗

肖琛聞1，金妙仁2，劉 燕1，韋 強1，季權安1，李 科1，趙 劍1，鮑國連1*

（1.浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所，浙江杭州 310021；2.杭州啟明星生物營養有限公司，浙江杭州 310021）

選用健康7周齡新西蘭肉兔96只，分為4個處理組，每組24只，分別用4種含不同劑量大豆異黃酮的大豆蛋白飼料飼喂。在連續飼喂3周、5周后進行血清SOD活性、MDA含量測定，IgG和IgA水平測定，IL-4和IL-6測定，以及淋巴細胞增殖試驗。結果大豆異黃酮可以顯著提高家兔SOD水平，顯著降低MDA水平和細胞免疫水平，提高細胞因子IL-4的表達，提高IgA水平，說明大豆異黃酮能夠提高家兔免疫健康狀態。

大豆異黃酮；家兔；健康性能

隨著畜禽業的集約化發展，對飼料原料要求越來越高。大豆是重要的植物蛋白質和油脂來源，具有極高的營養價值，但是大豆中含有一些抗營養因子如血球凝集素、脲酶、胰蛋白酶抑制因子等，制約了其在畜禽飼料中的利用。但這些抗營養因子不耐熱，擠壓膨化處理后的全脂膨化大豆可通過淀粉糊化、蛋白質變性等途徑破壞抗營養因子，提高大豆蛋白質的消化率。近年來，全脂膨化大豆作為高能、高蛋白飼料資源應用于畜禽飼料中，效果顯著，可降低成本，提高效益。

與傳統飼料生產模式相比，全脂膨化大豆具有更高的優越性，不僅使其添加油脂等工藝與設備復雜性的缺點得到改善，而且除了脂肪以外，還產生對動物營養有益的如脂質，包括磷脂等物質。大豆異黃酮（soybean isoflavones，SI）是一種從大豆中提取的具有弱雌激素作用的化合物，可以作為雌激素受體的激動劑或拮抗劑發揮作用，SI具有多種生物活性，能促進動物的生長，提高其繁殖性能，促進動物乳腺的發育，增加泌乳量，同時具有無毒性、無藥物殘留和添加劑量小等優點，與雌激素具有相同的性能而又完全符合畜產品安全生產的需要，極具作為新一代飼料添加劑的潛質［1］。本實驗以大豆活性因子大豆異黃酮飼料為實驗材料，以含膨化大豆成分的常規飼料為對比飼喂家兔，檢測家兔的生長性能以及相關免疫指標，探討含大豆異黃酮的膨化大豆飼料作為家兔生產的可行性，為生產實踐中的應用提供理論依據和指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥品

大豆異黃酮（SI）購自上海邁瑞爾，編號486-66-8，膨化大豆由杭州啟明星有限公司提供。SOD、MDA試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司。IgG、IgA測定試劑盒，兔白介素-4（IL-4）、兔白介素-6（IL-6）購自上海西唐生物科技有限公司。

1.1.2 試驗日糧

全價日糧（不含抗生素和抗球蟲藥）由本所兔場提供。飼料配方為玉米12.00%、麩皮18.00%、膨化大豆8.00%、草粉30.67%、麥芽根10.00%、大糠16.00%、石粉0.83%、食鹽0.50%、添加劑4.00%。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組和處理

選用健康7周齡新西蘭肉兔96只，由浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所試驗兔場提供。將兔分為4個處理組，每組24只。分別用4種不同日糧飼喂，其中包括對照組、大豆異黃酮低劑量組（SI：0.001 5%）、中劑量組（SI：0.003 0%）和高劑量組（SI：0.006 0%）。分別在試驗開始后第0天、第14天和第28天稱量每個重復的兔子體質量和飼料消耗；在連續飼喂飼料3周、5周進行SOD、MDA測定、血清IL-4和IL-6測定；在連續飼喂飼料2周、5周進行IgG、IgA測定。在飼喂6周結束時進行活體質量和胴體質量測定。計算平均日增重、平均日采食量和飼料增重比。

1.2.2 血清SOD活性和MDA含量測定

試驗開始后第3周、第5周每個試驗組采6只兔子耳緣靜脈血，凝固后1 500 g，離心10 min取血清。按試劑盒說明檢測。

超氧化物歧化酶（SOD）測定。將血清用生理鹽水稀釋成不同濃度進行預實驗，確定最佳稀釋倍數。按試劑盒說明檢測。

丙二醛（MDA）測定。按試劑盒說明檢測。漩渦混勻器混勻，試管口用封口膜扎緊，用針刺一小孔，95℃水浴40 min，后取出流水冷卻，然后1 500 g，離心10 min。去上清，532 nm處，1 cm光徑，雙蒸水調零，測各管吸光度（D）值。血清MDA含量/（nmol·m L-1）=（測定管D-對照管D）/（標準管D-空白管D）×標準品濃度×樣本稀釋倍數。

1.2.3 血清IgG、IgA測定

在連續飼喂2周、5周結束時采集血液，分離血清。10×標本稀釋液用蒸餾水1：10倍稀釋。加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100μL，將反應板充分混勻后置37℃，40 m in。洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4次，在濾紙上印干。每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50μL（空白除外）。將反應板充分混勻后置37℃20 m in。洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4次，在濾紙上印干。每孔加入酶標抗體工作液100μL，將反應板置37℃，10 min。洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4次，在濾紙上印干。每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗反應15 min。每孔加入終止液100μL混勻。30 min內用酶標儀450 nm處測吸光度值。

1.2.4 血清IL-4和IL-6測定

在連續飼喂3周、5周結束時采集血液，分離血清，測定細胞因子。標準品液配置。加樣：每孔加入標準品或待測樣品100μL，將反應板充分混勻后置37℃10 min。洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4次，在濾紙上印干。每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50μL（空白除外）。將反應板充分混勻后置37℃20 m in。洗板：同前。每孔加酶標抗體工作液100μL。將反應板置37℃10 min。洗板：同前。每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗處反應15 min。每孔加入100μL終止液混勻。30 min內用酶標儀在450 nm處測吸光值。

1.2.5 家兔淋巴細胞轉化試驗

在連續飼喂飼料3周后進行測定，同時取少量血液進行血液細胞分類測定。無菌心臟采集抗凝血，5 m L·只-1，加等量PBS稀釋；取稀釋好的9 m L血樣輕輕加到3 m L淋巴細胞分離液上方（每管3 mL稀釋后的血樣），550 g，19℃，離心20 min；吸取中間云霧狀白細胞層，加入2 mL PBS，550 g，4℃，20 min離心；棄上清，加PBS，550 g，4℃，20 min離心洗滌細胞2次；進行細胞數量的計數。棄上清，加入完全培養基RPM I1640（10%小牛血清）重懸細胞，將細胞濃度調整為1×106個· m L-1；將細胞加入24孔板，每孔0.5 m L，每孔再加入0.5 m L脂多糖（LPS）或刀豆素A（ConA），濃度分別為5μg·mL-1、12.5μg·mL-1。每個樣品重復2孔，然后置37℃、5%CO2培養箱中培養48 h，在48 h以后，每孔取出200μL的細胞上清液，-20℃凍存備用（測細胞因子）。每孔加2 mg·m L-1的MTT 50μL，繼續培養4 h后，棄去上清液，每孔加酸化異丙醇150μL，用槍將細胞板孔內的MTT反復抽吸，使沉淀完全溶解，從24孔中，每孔取出100μL加入到96孔板上，在酶標儀檢測D570值。

1.3 數據統計與分析

用SPSS 17.0軟件進行數據統計和One-way ANOVA單因素方差分析，Tukey’s HSD方法進行組間多重比較和顯著性檢驗，數據以平均值±標準差的形式表示。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 活體質量和胴體質量

從圖1中可以看出，添加了大豆異黃酮的兔飼料能夠顯著提高家兔體質量和胴體質量。

2.2 血清中SOD活性和M DA含量

從圖2中A可見，大豆異黃酮能夠顯著提高家兔SOD水平，在連續飼喂3周以后，中劑量組顯著高于其他各組；在連續飼喂5周以后，高劑量組顯著高于對照組和低劑量組。從圖2中B可見，大豆異黃酮能夠顯著降低家兔MDA水平，在連續飼喂3周以后，各劑量組MDA含量均顯著低于對照組；在連續飼喂5周以后，雖無顯著性差異，但各劑量組仍能降低血清中MDA含量。

圖1 家兔體質量和胴體質量

圖2 家兔血清SOD活性（A）和MDA（B）含量

2.3 血清IgG、IgA水平

從圖3中A可見，在飼喂大豆異黃酮2周或5周，血清中IgG水平各組之間無顯著性差異。從圖3中B可見，飼喂大豆異黃酮5周后，低劑量組IgA含量顯著高于其余各組。雖然各組的IgG均與對照組無顯著性差異，但是在連續飼喂5周以后，添加大豆異黃酮組IgG平均值均高于對照組。IgA在連續飼喂5周以后，低劑量組顯著高于其余各組。

2.4 血清IL-4和IL-6

從圖4中A可見，細胞因子IL-4在不同刺激物下，各組的刺激指數均有差異。其中在LPS刺激下，中劑量組的IL-4顯著高于對照組；在ConA刺激下，高、中、低劑量組IL-4均顯著高于對照組；在沒有刺激物刺激下，中劑量組和高劑量組IL-4顯著高于對照組。從圖4中B可見，細胞因子IL-6在不同刺激物下，各組的刺激指數均無差異。但是高、中、低劑量組IL-6平均值均高于對照組。

圖3 血清IgG（A）和IgA（B）水平

圖4 家兔血清IL-4（A）和IL-6（B）含量

2.5 淋巴細胞轉化試驗

LPS主要是刺激B淋巴細胞增殖，B細胞在體液免疫反應中起主要作用，ConA主要是刺激T細胞增殖，T細胞主要在細胞免疫反應中起主要作用。從圖5可見，高劑量大豆異黃酮能夠顯著提高家兔體液免疫（P＜0.05）和細胞免疫（P＜0.01）反應，說明大豆異黃酮能夠顯著提高提高家兔的免疫機能。

圖5 家兔外周血淋巴細胞增殖指數

3 討論

本研究得出，家兔日糧中添加大豆異黃酮，可以提高家兔的活體質量和胴體質量。大豆異黃酮（SI）主要活性成分有染料木黃酮（GEN），大豆黃素（DAI），黃豆黃素（GLY）等，大部分與糖結合以糖苷形式存在。大豆異黃酮可發揮間接抗氧化作用抑制促氧化酶如還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶（NOX）的活性，增加抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）的活性等［2］。本研究中試驗組的SOD顯著提高，表明膨化大豆蛋白飼料中添加大豆異黃酮起到了上調SOD的效果。丙二醛（MDA）是膜脂質過氧化的終產物之一，其含量高低可以作為考察細胞受到脅迫嚴重程度的指標之一，它的主要傷害是導致膜脂質過氧化，損傷生物膜結構，主要是細胞質膜，使得細胞膜結構和功能上受到損傷，改變膜的通透性，從而影響一系列生理生化反應的正常進行。本研究中各試驗組血清MDA含量均顯著低于對照組，說明大豆異黃酮能顯著抑制機體MDA的產生，從而起到保護細胞的作用。

IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，占血清免疫球蛋白的70%～75%，在疾病免疫中起重要作用。本研究中各試驗組在飼喂大豆異黃酮飼料5周后，IgG平均值高于對照組，雖然無顯著性差異，但仍能說明大豆異黃酮具有促進機體免疫功能的作用，是一種良好的植物性免疫促進劑［3］。分泌型IgA是機體黏膜局部抗感染的主要抗體。故又稱黏膜局部抗體。在飼喂5周后，低劑量試驗組IgA顯著高于對照組，說明大豆異黃酮能夠提高家兔體內黏膜局部抗體，保護家兔免受病原微生物特別是呼吸道黏膜或者消化道黏膜易感菌的侵染［4］。

IL-4的生物作用包括刺激和活化B細胞，促進體液免疫應答，刺激Th0細胞增殖并朝Th2型細胞分化以及促進IgE分泌型B細胞轉化與增殖等，故對嗜酸性粒細胞有募集、趨化、浸潤等作用［5］。IL-6是炎癥起始階段的一個重要致炎因子，它通過誘導多種細胞合成和分泌多種急性期蛋白，促進感染時PMN（中性粒細胞）產生、活化、促進B細胞增殖、分化及產生免疫球蛋白、促進T細胞增殖、分化等，在急性期炎癥反應中扮演著十分重要的角色［6］。從結果分析，細胞因子IL-4在不同刺激物下，各組的刺激指數均有差異。其中在LPS刺激下，中劑量組的IL-4顯著高于對照組；在ConA刺激下，高、中、低劑量組IL-4均顯著高于對照組；在沒有刺激物刺激下，中劑量組和高劑量組IL-4顯著高于對照組。可見大豆異黃酮能夠提高動物分泌IL-4的水平，從而達到提高動物免疫力的效果。各組IL-6均未顯著高于對照組，說明大豆異黃酮并未對IL-6起顯著提高的作用。淋巴細胞增殖試驗結果表明，大豆異黃酮能夠顯著提高家兔T、B淋巴細胞反應水平，提高家兔免疫機能。

4 小結

大豆異黃酮能夠可以提高家兔細胞免疫的水平，提高細胞因子表達，以及動物抗氧化能力的提高。大豆異黃酮能夠為家兔健康養殖提供有力保障。

［1］ 李方方，朱濤濤，張勇，等.大豆異黃酮對哺乳母豬生產性能、血液生理生化指標和糞便微生物菌群的影響［J］.動物營養學報，2015，27（9）：2803-2810.

［2］ 王龍梓.大豆異黃酮抗氧化作用與腦缺血防治［J］.中國老年學雜志，2015（15）：4385-4386.

［3］ 王利華，王光，王麗云，等.大豆異黃酮對肉仔雞免疫功能的影響［J］.山東畜牧獸醫，2008，29（10）：9-10.

［4］ 張志軍，馮霞，蔣娟，等.茯苓多糖對小鼠血清IgA、IgG和IgM生物合成水平的影響［J］.中國免疫學雜志，2013，29（11）：1213-1215.

［5］ 莫麗亞，鄧永超，黃彩芝，等.維生素D與IL-4及IL-12因子在兒童喘息性疾病中的表達及意義［J］.實用預防醫學，2015，22（9）：1053-1055.

［6］ 李昕，劉佳佳.IL-6對中性粒細胞在炎癥中作用的影響［J］.國際免疫學雜志，2005，28（5）：277-280.

（責任編輯：盧福莊）

S829.1；S816.42

A

0528-9017（2017）01-0139-04

文獻著錄格式：肖琛聞，金妙人，劉燕，等.大豆異黃酮對家兔健康性能的影響試驗［J］.浙江農業科學，2017，58（1）：139-142.

10.16178/j.issn.0528-9017.20170145

2016-09-26

杭州市重大科技創新專項（20142012A34）

肖琛聞（1979-），浙江杭州人，副研究員，從事家畜疾病防控工作。

鮑國連，E-mail：baoguolian@163.com。