氨基糖苷類藥物耳毒性機(jī)制研究

何 強(qiáng)，張 穎(綜述)，任秀敏(審校)

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050000)

·綜述·

氨基糖苷類藥物耳毒性機(jī)制研究

何 強(qiáng)，張 穎(綜述)，任秀敏(審校)

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050000)

氨基糖苷類；藥物毒性；藥理作用分子作用機(jī)制

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.031

自氨基糖苷類抗生素(aminoglycoside antibiotic,AmAn)廣泛應(yīng)用于臨床以來，由AmAn致聾的病例時(shí)有發(fā)生。AmAn是化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有氨基糖分子的一類抗生素，較主要的有鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素和新霉素等。AmAn主要作用于革蘭陰性菌，抗菌作用原理是阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)的生物合成。這類藥物可能會(huì)對(duì)腎臟、前庭和耳蝸造成不同程度的損傷[1]。近年來，對(duì)AmAn的耳蝸毒性機(jī)制[2]進(jìn)行了深入細(xì)致的研究，形成了許多種學(xué)說，但這些學(xué)說并不能完全解釋這類藥物耳毒性的機(jī)制，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，從分子水平上對(duì)AmAn耳毒性機(jī)制的研究進(jìn)一步深入，取得了一定的突破，并在藥物治療AmAn所致耳蝸毒性和預(yù)防耳蝸損傷上有所進(jìn)展,現(xiàn)綜述如下。

1 氧自由基與氨基糖苷類藥物耳毒性

1.1耳蝸氧自由基形成 自由基是指帶有不成對(duì)電子的分子、原子、原子團(tuán)或離子。氧自由基是生物體內(nèi)有氧代謝產(chǎn)生的含氧的自由基，包括羥自由基OH、超氧陰離子O2-、烷氧自由基RO及烷過氧自由基等。對(duì)氧自由基檢測可采用電子順磁共振法。氧自由基對(duì)生物大分子具有很強(qiáng)的損傷作用，可造成細(xì)胞的多種功能紊亂，特別是可引發(fā)線粒體損傷。氧的利用率高，是氧自由基的一個(gè)重要來源。耳蝸線粒體的DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)可編碼呼吸鏈細(xì)胞色素b，細(xì)胞色素c氧化酶亞單位CoⅠ、CoⅡ、CoⅢ，ATP合成酶6，ATP合成酶8。mtDNA損傷常造成這些酶的活性部分或全部喪失[2]，而這些酶是線粒體呼吸鏈的重要組分，活性喪失使呼吸鏈氧化磷酸化功能出現(xiàn)異常，線粒體電子漏增多，從而改變了電子載體的氧化還原電位，O2-和OH自由基明顯增多。有研究報(bào)道，AmAn在耳蝸毛細(xì)胞積累的主要部位是線粒體，可刺激氧自由基產(chǎn)生[3]。推測是AmAn可與鐵通過鐵-AmAn復(fù)合物的形成[4]，誘發(fā)谷氨酸興奮毒性作用[5-6]和細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+增多[7]的原因。

1.2耳蝸內(nèi)的抗氧化系統(tǒng) 在耳蝸的細(xì)胞中存在著各種各樣的氧自由基清除劑，如維生素C、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)等。耳蝸的抗氧化防御系統(tǒng)主要存在于Corti′s器和血管紋[7]。SOD是一種金屬酶，可分為CuZn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD 3種。已有研究發(fā)現(xiàn)在耳蝸中也有SOD的分布[8]，而且它在耳蝸內(nèi)的活性較強(qiáng)，由于金屬離子的存在，使超氧陰離子更易接近SOD的活性中心，發(fā)生催化反應(yīng)，達(dá)到清除O2-自由基的目的。GSH是細(xì)胞內(nèi)另外一種重要的抗氧化劑，為氧化還原反應(yīng)提供了大量的還原力。GSH的濃度在血管紋的基底細(xì)胞和中間細(xì)胞內(nèi)尤為豐富，在內(nèi)外毛細(xì)胞和支持細(xì)胞內(nèi)有少量存在。而且發(fā)現(xiàn)在耳蝸聽神經(jīng)上皮、聽神經(jīng)、外壁組織和血管組織也有GSH和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的表達(dá)。

1.3氧自由基與氨基糖苷類藥物耳毒性 Park等[9]用慶大霉素氧化花生四烯酸的實(shí)驗(yàn)來測定其誘發(fā)生成氧自由基的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慶大霉素單獨(dú)在0.05～10 mmol/L范圍內(nèi)，并不能使花生四烯酸形成過氧化脂質(zhì)，而在存在鐵鹽的條件下可生成氧自由基。慶大霉素是一個(gè)鐵離子的螯合劑，鐵離子-慶大霉素復(fù)合物的生成是氧自由基產(chǎn)生的催化劑。Zholudeva等[10]用去鐵胺和新霉素同時(shí)給豚鼠注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鐵離子螯合劑去鐵胺可明顯拮抗新霉素的耳毒性。Park等[9]的進(jìn)一步研究表明，2，3-二羥基苯甲酸鹽與甘露醇的聯(lián)合使用在聽功能及形態(tài)學(xué)指標(biāo)上可以完全拮抗慶大霉素的耳毒性，氧自由基清除劑和鐵離子螯合劑的合用對(duì)于慶大霉素血藥濃度及其抗菌活性均不影響。當(dāng)慶大霉素達(dá)一定劑量后，慶大霉素會(huì)導(dǎo)致耳蝸氧自由基的產(chǎn)生大大超過耳蝸組織的抗氧化能力，使聽覺系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)行性損害。所以，慶大霉素的耳毒性作用要有一個(gè)級(jí)聯(lián)激活過程，這種激活經(jīng)過一個(gè)氧化還原反應(yīng)，即鐵與慶大霉素復(fù)合物的形成，可在體外促發(fā)氧自由基的產(chǎn)生。慶大霉素與多磷酸肌醇的親和力也與其耳毒性密切相關(guān)。在機(jī)體內(nèi)耳和腎組織中的多磷酸肌醇的含量相對(duì)較高，易使慶大霉素與磷脂結(jié)合而中毒。而在pH值適合的細(xì)胞溶酶體內(nèi)，聚DL-天冬氨酸的濃度足夠時(shí)其可從磷脂中置換出慶大霉素，從而可延緩溶酶體磷脂沉積病態(tài)發(fā)展，抑制溶酶體因?yàn)槌?fù)荷而破裂使細(xì)胞壞死的一系列中毒過程的發(fā)生，能起到一定的拮抗作用。水楊酸即鄰羥基苯甲酸，可與氧自由基反應(yīng)生成2,3-二羥基苯甲酸,這是慶大霉素耳毒性的拮抗劑。所以，水楊酸可通過直接和間接的雙重作用清除慶大霉素誘發(fā)產(chǎn)生的氧自由基,而且作用部位準(zhǔn)確。另外的實(shí)驗(yàn)研究表明， 川芎嗪也可有效減輕慶大霉素耳毒性損傷[11]，且與川芎嗪具有抗氧化作用有關(guān)，對(duì)離體鼠耳蝸神經(jīng)組織分析，得出其為慶大霉素耳毒性拮抗劑[12-13]，但尚不明確其確切的抗氧化機(jī)制。

2 細(xì)胞凋亡與氨基糖苷類藥物耳毒性

2.1細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制 細(xì)胞凋亡亦稱程序性細(xì)胞死亡，是生理狀態(tài)下發(fā)生的細(xì)胞自殺過程，在機(jī)體中具有重要的生物學(xué)意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各種研究表明特異性蛋白酶的酶學(xué)變化是細(xì)胞死亡機(jī)制的核心成分，從分子水平看凋亡實(shí)質(zhì)上是蛋白酶一系列級(jí)聯(lián)切割的過程，故抑制蛋白酶活性的因素也就可以抑制凋亡的發(fā)生。細(xì)胞凋亡是一個(gè)很復(fù)雜的生理和病理過程，很多因素均可影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生。某些因素可特異性地誘導(dǎo)某種或某類細(xì)胞發(fā)生凋亡，如某些生長因子依賴性細(xì)胞，當(dāng)撤除生長因子時(shí)則發(fā)生凋亡；而某些基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞凋亡具有明顯的促進(jìn)或抑制作用。細(xì)胞凋亡的激發(fā)和抑制是受遺傳因素影響的，有多種基因參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)控制。而在細(xì)胞凋亡中，并非存在一成不變的代謝途徑。細(xì)胞凋亡對(duì)細(xì)胞增殖、器官發(fā)生、器官自身平衡的維持有重要意義，是很重要的細(xì)胞分子生物學(xué)事件。

2.2耳蝸細(xì)胞凋亡與氨基糖苷類藥物 損傷聽力的各種因素，一般均會(huì)造成耳蝸毛細(xì)胞的損傷，大量毛細(xì)胞的急性損傷會(huì)破壞感覺上皮結(jié)構(gòu)的完整性，這將對(duì)毛細(xì)胞損傷后的修復(fù)造成很大的影響[14]。細(xì)胞凋亡是一個(gè)重要過程,其對(duì)內(nèi)耳的正常發(fā)育以及去除氧化應(yīng)激所致的感覺細(xì)胞損傷同等重要。AmAn對(duì)耳蝸的損傷與耳蝸老化的病理改變很相似。AmAn損傷耳蝸感覺上皮，損傷毛細(xì)胞的胞體在上皮內(nèi)變性，即發(fā)生細(xì)胞凋亡，這一過程表明毛細(xì)胞對(duì)組織損傷過程的自我控制和自我保護(hù)，與感覺上皮損傷后的修復(fù)過程有重要聯(lián)系。

3 一氧化氮(nitric oxide,NO)與氨基糖苷類藥物耳毒性

3.1NO的性質(zhì)及生物合成 NO是一種無機(jī)小分子化合物，在很早就為人們所熟知。近年來對(duì)NO的生物學(xué)作用取得進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，NO有第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)的功能，故它是一種細(xì)胞信息傳遞的重要載體，廣泛參與了各種生理功能的調(diào)節(jié)。NO的化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，半衰期很短，僅為5 s左右，而且可被血紅蛋白、氧自由基、氫醌等迅速滅活。NO極易與氧發(fā)生反應(yīng)生成NO2-，之后在中性體液中迅速轉(zhuǎn)化為NO3-而喪失其生物學(xué)活性，這可能是NO失活的生理機(jī)制。上世紀(jì)80年代研究發(fā)現(xiàn)了硝酸甘油類的擴(kuò)血管作用來源于其活性代謝產(chǎn)物NO，后又證實(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在NO作用。

3.2一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)的催化作用 NOS是NO生物合成的關(guān)鍵因素，一般NOS可分成神經(jīng)元型內(nèi)皮型一氧化碳合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、神經(jīng)型一氧化氮合酶(nerves of nitric oxide synthase,nNOS)和誘生型一氧化氮合酶(induce nitric oxide synthase，iNOS)。其中nNOS和eNOS依賴于Ca2+/CaM(鈣蛋白)，不受內(nèi)毒素等誘導(dǎo)，統(tǒng)稱為原生型酶( constitutive nitric oxide synthase,cNOS)，而iNOS不依賴于Ca2+/CaM，可由內(nèi)毒素等誘導(dǎo)產(chǎn)生。為闡明NOS的催化過程和調(diào)節(jié)因子，利用雙重聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，證明了NOS具有催化L-精氨酸合成NO的活性。NOS蛋白質(zhì)上有潛在磷酸化位點(diǎn)，因此酶的磷酸化必然影響酶的活力。蛋白激酶A、蛋白激酶G、蛋白激酶Ⅱ、磷酯酶C和磷酯酶A2均參加了NOS的調(diào)節(jié)過程，有的使酶活力增加，有的使酶活力降低。而且，控制mRNA半衰期是許多因子影響NOS基因表達(dá)的共同途徑。

3.3NO的生物學(xué)作用 NO具有強(qiáng)大的松弛血管平滑肌作用、抑制血小板聚集、神經(jīng)傳導(dǎo)功能、免疫功能及細(xì)胞毒性等。NO的細(xì)胞毒性作用是非特異性宿主防御反應(yīng)的組成部分。人體免疫系統(tǒng)的重要成員成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞均可釋放內(nèi)源性NO殺死外來的病原體。另外，NO也在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮細(xì)胞間信息傳遞的作用。在腦細(xì)胞中，NO的小量釋放可作為信號(hào)分子傳遞信息，而大量釋放時(shí)可殺死腦細(xì)胞。從耳蝸鼓階灌注NO供體硝普鈉會(huì)產(chǎn)生聽力損失及耳蝸毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷[15-16]。

3.4NO與氨基糖苷類藥物耳毒性 Takumida等[17]發(fā)現(xiàn)豚鼠螺旋器感覺細(xì)胞受到AmAn刺激時(shí)會(huì)表達(dá)iNOS，生成大量的NO，也同時(shí)產(chǎn)生大量活性氧，二者對(duì)細(xì)胞均有破壞作用，而且NO與活性氧發(fā)生反應(yīng)可生成氮的過氧化物，它對(duì)細(xì)胞也有較強(qiáng)的毒性作用。Inai等[18]證實(shí)經(jīng)靜脈給予NOS競爭性抑制劑或NOS的天然底物L(fēng)-精氨酸，則能降低或提高耳蝸血流。Takumida等[17,19]給豚鼠聽泡內(nèi)注射慶大霉素或生理鹽水，即分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，豚鼠的螺旋器和前庭終器的iNOS采用免疫組織化學(xué)的方法檢測，豚鼠聽泡內(nèi)先注射N-硝基-L-甲基-精氨酸(即NOS的拮抗劑)和ebselen (氮的過氧化物清除劑)，再給予慶大霉素，形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，暴露于慶大霉素的豚鼠螺旋器和前庭器的感覺細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，但經(jīng)N-硝基-L-甲基-精氨酸及ebselen預(yù)處理的豚鼠感覺細(xì)胞破壞程度較前者輕。

4 耳蝸微循環(huán)與氨基糖苷類藥物耳毒性

4.1內(nèi)皮舒張因子與耳蝸微循環(huán) 內(nèi)皮依賴性舒張因子是由血管內(nèi)皮細(xì)胞利用L-精氨酸合成的內(nèi)源性硝基血管擴(kuò)張劑,它的實(shí)質(zhì)為NO[20]。在基礎(chǔ)狀態(tài)下,血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)釋放NO,有舒張血管、抗血小板和粒細(xì)胞黏附、聚集等作用。如NO合成及作用障礙，較易致血管收縮和形成血栓，導(dǎo)致微循環(huán)障礙。內(nèi)耳微循環(huán)非常特殊，與其他臟器微循環(huán)具有不同的解剖結(jié)構(gòu)，因而具有不同的剪切應(yīng)力。耳蝸的彈簧樣結(jié)構(gòu)使其血管受到血液流動(dòng)的切變應(yīng)力降低，這是促使內(nèi)皮依賴性舒張因子釋放的因素之一。其次在內(nèi)耳血管壁內(nèi)皮細(xì)胞中含有大量的內(nèi)皮依賴性舒張因子合成酶，該部位有合成更多內(nèi)皮依賴性舒張因子的生理基礎(chǔ)。

4.2血管紋黑色素與氨基糖苷類藥物 研究表明，在人和雜色動(dòng)物的內(nèi)耳中分布有黑色素，AmAn作用于內(nèi)耳后黑色素含量明顯增加,證明黑色素與AmAn耳毒性有關(guān)[21]。AmAn作用于內(nèi)耳后，血管紋細(xì)胞出現(xiàn)變性改變，如線粒體嵴斷裂并腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等，不過黑素體結(jié)構(gòu)并無明顯改變，但中間細(xì)胞內(nèi)的黑素體數(shù)目明顯增多。AmAn的耳毒性與其誘導(dǎo)耳蝸產(chǎn)生自由基有關(guān)，黑色素是一種穩(wěn)定的自由基捕獲劑，可防止自由基的損害作用，如自由基造成的細(xì)胞DNA鏈斷裂、堿基破壞以及形成DNA-蛋白變聯(lián)等。通過以上作用，黑色素可減輕AmAn類藥物的耳毒性作用。

5 能量代謝與氨基糖苷類藥物

耳蝸細(xì)胞的正常生理功能有賴于能量的充足供應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)能量代謝的正常進(jìn)行。三羧酸循環(huán)在細(xì)胞能量代謝中非常重要，而以琥珀酸脫氫酶和乳酸脫氨酶為指標(biāo)，可了解AmAn對(duì)糖有氧氧化和糖酵解的作用。實(shí)驗(yàn)證明，AmAn可使琥珀酸脫氫酶的活性受到明顯抑制，細(xì)胞能量代謝降低，細(xì)胞的能量供應(yīng)下降[22]，開始表現(xiàn)為毛細(xì)胞功能障礙，后出現(xiàn)毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變。同時(shí)，毛細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶活性也明顯被抑制，該酶活性被抑制的程度以基底周外毛細(xì)胞顯著，與毛細(xì)胞的病理損害過程一致。AmAn中毒后干擾和降低了毛細(xì)胞的糖酵解過程，進(jìn)一步加重了能量供給的不足，使毛細(xì)胞內(nèi)能量代謝出現(xiàn)紊亂。

6 Ca2+與氨基糖苷類藥物

近年來對(duì)Ca2+的研究表明，Ca2+的生理學(xué)功能很重要而且很復(fù)雜[7]。Ca2+在細(xì)胞膜上是以磷酸肌醇酯和蛋白質(zhì)相結(jié)合的狀態(tài)存在。AmAn與毛細(xì)胞接觸首先是與其細(xì)胞膜上的磷酸肌醇酯相結(jié)合，而當(dāng)AmAn濃度在一定比例關(guān)系時(shí)AmAn和Ca2+可以競爭性地與磷酸肌醇酯相結(jié)合，也即二者有競爭抑制作用。當(dāng)AmAn與磷酸肌醇酯結(jié)合以后，可以使Ca2+釋放出來，這樣可以改變細(xì)胞膜上的離子通道，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。

7 鐵離子與氨基糖苷類藥物

Ezraty等[5]提出慶大霉素耳毒性可能是由于慶大霉素在體內(nèi)形成慶大霉素-鐵復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物的生成可催化產(chǎn)生自由基而損傷毛細(xì)胞。鐵螯合劑甲磺酸去鐵胺可與鐵離子或三價(jià)鋁離子形成復(fù)合物，形成的復(fù)合物通過膽汁和尿液可完全排泄，從而可減少鐵或鋁在器官的病理性沉積。Polony等[4]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，應(yīng)用甲磺酸去鐵胺組聽反應(yīng)閾在實(shí)驗(yàn)過程中保持穩(wěn)定，表明其安全而無毒性；慶大霉素+甲磺酸去鐵胺組聽反應(yīng)閾平均較慶大霉素組明顯降低，耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷與聽反應(yīng)閾升高的程度相平行。鐵離子提供電子產(chǎn)生羥自由基，是機(jī)體內(nèi)的氧自由基由酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)產(chǎn)生某些復(fù)合物催化的Haber-Weiss反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)。

8 氨基糖苷類藥物耳毒性的防治進(jìn)展

AmAn造成耳中毒過程中，自由基的作用非常重要，應(yīng)用自由基清除劑可拮抗AmAn耳毒性。聚天冬氨酸對(duì)慶大霉素所致耳蝸組織自由基的產(chǎn)生有抑制作用，并且隨著用藥時(shí)間的延長這種抑制作用越來越明顯，提示聚天冬氨酸對(duì)慶大霉素耳毒性拮抗作用與聚天冬氨酸抑制慶大霉素致耳蝸組織自由基的產(chǎn)生密切相關(guān)。近期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)耳毛細(xì)胞突觸可能是氨基苷類藥物耳毒性的作用靶點(diǎn)，為經(jīng)典的耳聾發(fā)病機(jī)制的研究和干預(yù)策略的制定提供了更新的思路[23-24]。由于NO與AmAn耳毒性的密切關(guān)系，可應(yīng)用NO拮抗劑治療和預(yù)防AmAn耳毒性。在應(yīng)用藥物治療中，要注意體內(nèi)NO的水平，在保證其生理作用的前提下，適量減少NO的濃度。聯(lián)合使用利尿劑等藥物以進(jìn)一步增強(qiáng)藥物的耳毒性，因而這種誘導(dǎo)條件下，產(chǎn)生的耳蝸損害常十分嚴(yán)重[25]。N-硝基-L-甲基-精氨酸作為一種NOS的競爭性抑制劑可抑制AmAn的耳毒性，作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，鐵離子螯合劑甲磺酸去鐵胺等抗氧化劑也有拮抗AmAn耳毒性的作用。水楊酸制劑可以在安全范圍內(nèi)有效預(yù)防AmAn耳毒性作用。川芎嗪等中藥有活血化瘀、改善內(nèi)耳微循環(huán)等作用，同時(shí)作為氧自由基的清除劑，通過對(duì)超氧陰離子的清除阻止了細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，在預(yù)防和治療AmAn耳毒性中起一定作用。基因治療是通過直接抑制有害基因的表達(dá),或者通過過表達(dá)和插入缺失或下調(diào)的基因,直接在靶細(xì)胞進(jìn)行基因操作[26-27]。12S rRNA是線粒體的一個(gè)熱點(diǎn)突變，近年的研究發(fā)現(xiàn)很多與氨基糖苷類抗生素耳毒性相關(guān)的12S rRNA突變位點(diǎn)[28-31]，因而基因治療在氨基糖甙類藥物耳毒性的防治中顯示出明顯的應(yīng)用前景。

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2017-06-16；

2017-08-07

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(20170085)

何強(qiáng)(1968-)，男，北京人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事耳疾病基礎(chǔ)與臨床研究。

R978.12

A

1007-3205(2017)12-1484-05

許卓文)