多索茶堿緩釋片在Beagle犬體內藥代動力學研究

郭泉

摘要：目的 進行受試制劑多索茶堿緩釋片與參比制劑多索茶堿片在Beagle犬體內的藥代動力學研究，明確其是否具有緩釋特征，為臨床研究提供依據。方法 采用兩制劑兩周期交叉試驗方法，12只Beagle犬分別經口給予受試制劑和參比制劑400 mg，采用LC-MS法測定各時間點血漿中多索茶堿的濃度，藥代動力學參數經DAS 2.0 統計軟件計算獲得。結果 受試制劑與參比制劑藥代動力學參數：Cmax分別為（4.9±0.6） 和（8.4±2.1）μg/mL，Tmax分別為（2.5±0.5）和（1.7±0.4）h，T1/2分別為（1.4±0.4）和（1.0±0.3）h，AUC0-12分別為（14.0±1.7）和（14.4±2.9）μg/mL×h。受試制劑在達峰濃度上明顯小于參比制劑，達峰時間延遲，半衰期延長，具有緩釋制劑特征。結論 受試制劑多索茶堿緩釋片具有緩釋特征。

關鍵詞：多索茶堿；Beagle犬；藥代動力學；緩釋；液相色譜-串聯質譜

Pharmacokinetic Studies of Doxofylline Sustained Release Tablets in Beagles

GUO Quan

（The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233004，Anhui，China）

Abstract：Objective To study the pharmacokinetics of Doxofylline Sustained Release Tablets and Doxofylline Tablet in Beagles. Methods A total of 12 male Beagles were randomly divided into two groups. They were assigned to receive Doxofylline Sustained Release Tablets （trial preparation） and Doxofylline Tablets （reference preparation） respectively. The plasma of Doxofylline were detected by LC-MS method after oral administration of 400mg. The pharmacokinetic parameters were calculated by the procedure of DAS 2.0. Results The Cmax of the two preparations were （4.9±0.6） and （8.4±2.1）μg/mL， Tmax were （2.5±0.5） and （1.7±0.4）h， T1/2 were （1.4±0.4） and （.0±0.3）h， AUC0-12 were （14.0±1.7） and （14.4±2.9）μg/mL*h. Trial preparation was significantly less than reference preparation in the peak concentration， while tmax and half-life was prolonged. Conclusion Doxofylline Sustained Release Tablets （trial preparation） was characterized by slow drug releasing.

Key words：Doxofylline； Beagles； pharmacokinetics； Sustained Release Tablet； LC-MS

多索茶堿（doxofylline）是一種新型平喘鎮咳藥，直接作用于支氣管和肺血管平滑肌，擴張支氣管和肺血管。多索茶堿通過抑制平滑肌細胞內磷酸二酯酶起作用，增加細胞內cAMP水平，從而松弛平滑肌。高濃度多索茶堿可抑制細胞內組胺的釋放。與傳統藥物茶堿和氨茶堿相比，療效高且毒性低，治療效果是氨茶堿的10～15倍[1-2]。多索茶堿國內現有劑型有片劑、膠囊劑和注射劑，均為速釋型制劑，未見緩釋制劑上市，本品多索茶堿緩釋片采用親水凝膠骨架技術，延緩多索茶堿的釋放，延長多索茶堿在體內的半衰期，從而達到給藥期間有效保持有效血藥濃度，減小血藥濃度峰谷波動，增加治療指數的目的。

該研究參照《化學藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則》[3]要求，通過LC-MS法觀察多索茶堿緩釋片在Beagle犬體內藥代動力學情況，以了解多索茶堿緩釋片在Beagle犬體內吸收規律，為其進一步研究與開發提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1實驗動物 Beagle犬普通級，10.0～12.0 kg，共12只，雄性，購于蘇州工業園區愛爾麥特科技有限公司。

1.2儀器與試劑 LC/MS-2010EV液相質譜聯用儀（日本島津公司）；XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；XS105分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Milli-Q Academic純水機（上海密理博貿易有限公司）；KQ-250E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HGC-24型氮吹儀（北京瑞邦興業科技有限公司）；16K平衡離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）。

多索茶堿緩釋片（規格：400 mg/片，批號：20090406，合肥合源藥業有限公司）；多索茶堿片（規格：200 mg/片，批號：081201，黑龍江福和華星制藥集團股份有限公司）；多索茶堿標準品（批號：100625-200301，中國藥品生物制品檢定所購買）；內標卡馬西平標準品（批號：100142-199503，中國藥品生物制品檢定所購買）；甲醇（色譜純，Merck公司）、乙腈（色譜純，Merck公司）；乙酸乙酯（分析純，廣東汕頭市西隴化工廠）；水為自制純化水。

1.3方法

1.3.1色譜與質譜條件 色譜條件：色譜柱：Phenomenex Syneryi 4μ POLAR-RP 150×2.0 mm；流動相：甲醇∶水（0.1%甲酸）=72∶28（V∶V），流速：0.2 ml/min，柱溫：35℃；進樣量：10 μl。質譜條件：ESI離子源；CDL Temperature 250℃，Heat Block Temperature 200℃，Detector Voltage 1.7 KV；正離子方式檢測，掃描方式為選擇離子檢測（SIM），用于定量的離子分別為多索茶堿m/z：267.0；內標卡馬西平m/z：237.2，掃描時間：1.00 s。

1.3.2試驗設計 12只Beagle犬隨機分為兩組，采用雙周期兩制劑雙交叉試驗設計，第一組先服用受試制劑后服用參比制劑，第二組先服用參比制劑后服用受試制劑。服藥前禁食過夜（12 h以上），于給藥當日清晨空腹經口給予受試制劑多索茶堿緩釋片1片或參比制劑多索茶堿片2片，并用100 ml溫開水灌送，分別于給藥前（0 h）和給藥后10 min、20 min、 30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、 10 h、12 h從犬后肢靜脈取血2 ml，放入試管中，靜置30 min左右，3000 rpm離心15 min，取血漿于離心管中，-70℃冷凍待測。服藥后2 h可飲水；間隔1 w兩組交叉服藥，第二周期采血時間點與第一周期相同。

1.3.3樣品處理方法 精密量取血漿100 μl置于空白離心管中，加入內標卡馬西平溶液（1.515 μg/ml）10 μl，渦旋30 s，再加入1 ml乙酸乙酯，渦旋3 min，14000 rpm離心10 min，提取有機層，N2下吹干，500 μl流動相復溶，10 μl進樣。

1.4統計學處理 標準曲線采用線性回歸分析，藥代動力學參數采用DAS 2.0軟件計算。

2 結果

2.1方法學驗證

2.1.1專屬性 取空白血漿，除不加內標外，按1.3.3項下操作，獲得空白樣品色譜圖；將一定濃度多索茶堿標準溶液和內標溶液加入Beagle犬空白血漿中，同法操作，獲得相應的色譜圖；同法得到Beagle犬給藥后血漿樣品色譜圖。多索茶堿保留時間為4.7 min，內標卡馬西平保留時間為4.5 min。在色譜條件下，Beagle犬組織勻漿中內源性物質不干擾多索茶堿及內標的測定。血漿典型色譜圖，見圖1。

2.1.2標準曲線 精密吸取不同濃度的多索茶堿及內標工作液各10 μl，加入不同體積空白血漿，混勻，按1.3.3項下方法處理制備標準曲線。以血漿濃度（Y）為縱坐標，以樣品峰面積與內標峰面積的比值（X）作為橫坐標，用加權最小二乘法（W=1/X2）進行線性回歸運算，在0.026～13.312 μg/ml線性范圍內，回歸方程為Y=0.99X+0.003，r=0.99（n=3），定量下限為0.026 μg/ml。

2.1.3 精密度 按1.3.3 項下方法處理制備高、中、低3個濃度（分別為0.052，0.416和6.656 μg/ml）的多索茶堿樣品，平行操作6份，于同1 d內測定3次，計算日內精密度；連續測定3 d，計算日間精密度。不同濃度多索茶堿日內精密度RSD分別為0.81%～6.30%；日間精密度RSD分別為3.19%～7.12%，符合要求。

2.1.4 提取回收率與基質效應 按1.3.3 項下方法處理制備高、中、低3個濃度的多索茶堿樣品，平行操作3份，以處理后的樣品色譜峰面積與相應濃度的未經處理的樣品色譜峰面積之比，考察方法的提取回收率；以空白血漿處理后再加入標準溶液所得色譜峰面積與相應濃度的未經處理的樣品色譜峰面積之比考察基質效應。結果顯示多索茶堿及內標提取回收率分別為80.25%～86.67%、81.07%～86.54%，基質效應分別為80.78%～99.23%、86.20%～96.57%；RSD值均<10%，符合要求。

2.1.5穩定性 按1.3.3項下方法處理制備高、中、低3個濃度的多索茶堿樣品，平行操作，分別考察在室溫放置24 h、室溫放置8 h再處理、反復凍融3次、長期冷凍66 d條件下的穩定性。結果顯示RSD值均<10%，樣品在上述條件下均穩定。

2.1.6樣品測定過程中的隨行標準曲線及質量控制 為減少系統誤差，在進行樣品分析時，每個分析批均建立隨行標準曲線計算血藥濃度，并測定質控樣品（分別為0.052，0.416和6.656 μg/ml），質控樣本數不低于待測樣本的5%，確保計算得到的藥物濃度準確可靠。

2.2 Beagle犬藥代動力學研究 Beagle犬經口給予多索茶堿后，受試制劑多索茶堿緩釋片和參比制劑多索茶堿片后的平均血藥濃度-時間曲線圖，見圖2，多索茶堿血藥濃度用DAS 2.0軟件統計相應藥代動力學參數結果，見表1。

血藥濃度-時間曲線圖（n=12）

注：T：受試制劑多索茶堿緩釋片平均血藥濃度-時間曲線；R：參比制劑多索茶堿片平均血藥濃度-時間曲線。

受試制劑和參比制劑的ln（AUC0-12）經方差分析表明兩制劑間無顯著性差異，經雙向單側t檢驗，兩制劑的[1-2α]置信區間為87.9%～110.2%，表明多索茶堿緩釋片在吸收程度上具有生物等效性；受試制劑和參比制劑ln（Cmax）經方差分析，P<0.05，說明兩制劑間存在顯著性差異，經雙向單側t檢驗，兩制劑的[1-2α]置信區間為51.9%～68.0%，表明多索茶堿緩釋片在達峰濃度上明顯小于普通片；受試制劑和參比制劑ln（MRT）經方差分析，P<0.05，說明兩制劑間存在顯著性差異，受試制劑MRT較參比制劑延長。Tmax經非參數檢驗，P<0.05，表明兩制劑間存在顯著性差異，符合藥物制劑的特點，受試制劑與參比制劑比較，具有緩釋特征。

3 討論

支氣管哮喘屬于變態反應性疾病，屬于呼吸內科常見病、多發病，尤其在冬春季節高發，嚴重影響患者呼吸功能呈現晝輕夜重的表現，而對于支氣管哮喘臨床常用方法就是應用支氣管擴張劑，擴張支氣管以減輕哮喘癥狀[2-3]。近年來，隨著多索茶堿的臨床應用，發現多索茶堿對于支氣管哮喘患者來說，患者反應療效更好。多索茶堿是茶堿的衍生物，為新型的非腺苷阻斷性支氣管擴張劑，大量臨床前藥理毒理試驗表明，多索茶堿抗支氣管痙攣作用明顯強于茶堿，心血管系統、消化系統及其它系統的藥理作用明顯低于茶堿[4]。

患者服用多索茶堿普通口服制劑后，多索茶堿口服吸收快[7]，患者體內血藥快速上升，經體內代謝后血藥濃度又快速下降，造成血藥濃度波動大，出現明顯的血藥濃度“峰谷”現象，從而影響安全性和療效；必須對制劑的釋藥速度進行控制，否則無法保證治療期間維持有效血藥濃度。在多索茶堿一日總劑量相同的情況下，多索茶堿緩釋片的給藥方案較普通片更易達到穩態血藥濃度；緩慢釋藥使血藥濃度更加平穩，有效血藥濃度持續時間長，從而避免了普通制劑的“峰谷”現象。同時多索茶堿緩釋片的開發減少了患者的給藥次數，能明顯提高患者的順應性，特別適用于需長期用藥的慢性疾病患者。

多索茶堿普通制劑檢測多采用液相法[5-6]，在檢測限方面有一定局限性。本研究采用LC-MS測定Beagle犬血漿濃度，靈敏度高，最低檢測濃度可至0.026 μg/ml。文獻中生物樣品預處理方法多使用二氯甲烷、氯仿提取，毒性大，且氯仿萃取過程中容易發生乳化。本研究采用乙酸乙酯萃取，降低了有機試劑的毒性。

本研究中受試制劑多索茶堿緩釋片在Beagle犬體內藥代動力學試驗研究表明受試制劑有一定的緩釋特征，其動物體內藥動學參數為后續臨床研究提供了參考依據，有一定的研究價值。

參考文獻：

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編輯/肖慧