上皮性卵巢癌組織中TGF-β1、FOXQ1、VEGF、E-cad、N-cad的表達(dá)及意義

李紅雨，余亞南，胡曉靜，劉琰，劉星爍，張敏

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州 450052)

上皮性卵巢癌組織中TGF-β1、FOXQ1、VEGF、E-cad、N-cad的表達(dá)及意義

李紅雨，余亞南，胡曉靜，劉琰，劉星爍，張敏

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州 450052)

目的 觀察轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、叉頭框蛋白Q1(FoxQ1)、E-鈣黏蛋白(E-cad)和N-鈣黏蛋白(N-cad)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在上皮性卵巢癌卵巢上皮組織中的表達(dá)，并探討其意義。方法 上皮性卵巢癌40例(惡性組)、良性上皮性卵巢腫瘤39例(良性組)、正常卵巢38例(正常組)，手術(shù)切取卵巢上皮組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)法分別檢測各組卵巢上皮組織中TGF-β1、FOXQ1、E-cad、N-cad、VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)。采用Spearman相關(guān)分析法分析上述各指標(biāo)之間的相關(guān)性。結(jié)果 惡性組TGF-β1、FOXQ1、N-cad、VEGF mRNA、蛋白表達(dá)高于正常組和良性組，E-cadmRNA、蛋白表達(dá)低于正常組、良性組(P均<0.05)。上皮性卵巢癌中TGF-β1、FOXQ1、E-cad、N-cad、VEGF表達(dá)與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。上皮性卵巢癌中TGF-β1與FOXQ1、E-cad、N-cad呈正相關(guān)(r分別為0.335、0.123、0.411,P分別為0.003、0.002、0.000)；FOXQ1與E-cad呈正相關(guān)(r=0.321，P=0.000)；E-cad與N-cad、VEGF呈正相關(guān)(r分別為0.433、0.283，P分別為0.000、0.010)。結(jié)論 上皮性卵巢癌卵巢上皮組織中TGF-β1、FOXQ1、VEGF、N-cad表達(dá)升高，E-cad表達(dá)降低，共同參與上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移。

卵巢腫瘤；上皮性卵巢癌；上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化；E-鈣黏蛋白；N-鈣黏蛋白；轉(zhuǎn)化生長因子β1；叉頭框蛋白Q1；血管內(nèi)皮生長因子

卵巢癌是女性生殖器官三大惡性腫瘤之一[1]，嚴(yán)重威脅女性生命健康。卵巢癌早期缺乏癥狀，不易被發(fā)現(xiàn)，臨床上70%的患者確診時(shí)已為晚期，5年生存率僅為20%～25%[2]。因此，探索卵巢癌發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及其相關(guān)機(jī)制成為研究熱點(diǎn)。上皮性卵巢癌為卵巢癌的常見類型。最新研究[3]表明，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在上皮性腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志是上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白(E-cad)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣黏蛋白(N-cad)下調(diào)。E-cad是鈣依賴性跨膜黏附因子，可以抑制上皮腫瘤基因的表達(dá)。N-cad屬于鈣黏蛋白超家族，是一類鈣依賴性跨膜糖蛋白，主要參與鈣的調(diào)節(jié)與介導(dǎo)。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是一組新近發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的蛋白因子，屬于TGF-β超家族[4]。叉頭框蛋白Q1(FoxQ1)是FOX基因家族新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子之一，受TGF-β1調(diào)節(jié)，并作用于下游基因影響E-cad和N-cad的表達(dá)[5]，進(jìn)而使上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化獲得遷移和侵襲能力。TGF-β1/FOXQ1/E-cad/EMT可能作為一個新的致癌信號通路參與多種上皮性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但其在上皮性卵巢癌中的作用尚不清楚。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種高度特異性的促血管生成因子，通過影響腫瘤血管生成的途徑調(diào)控實(shí)體腫瘤的發(fā)展，也參與EMT調(diào)控[6]。本研究觀察了TGF-β1、FOXQ1、E-cad、N-cad、VEGF在上皮性卵巢癌卵巢上皮組織中的表達(dá)，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2013年1月～2015年12月鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的117例患者的卵巢上皮組織，117例患者年齡17～76歲、平均48.3歲。其中，上皮性卵巢癌患者40例(惡性組)、良性上皮性卵巢腫瘤患者39例(良性組)、因良性子宮病變行卵巢切除的患者38例(正常組)。良性組、惡性組患者術(shù)前未行化療、放療等輔助治療。按FIGO(2000年)分期標(biāo)準(zhǔn)，惡性組Ⅰ、Ⅱ期14例，Ⅲ、Ⅳ期26例；低分化21例，高、中分化19例；漿液性囊腺癌19例，黏液性囊腺癌16例；子宮內(nèi)膜樣癌5例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。所有病例均經(jīng)手術(shù)和病理證實(shí)。其余用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，用于免疫組化檢測。

1.2 TGF-β1、FOXQ1、E-cad、N-cad、VEGF mRNA表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取少量卵巢上皮組織，參照Zhang等[7]的方法及TRIzol?Reagent試劑說明書提取總RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with cDNA Eraser試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物的基本信息見表1。采用SYBR?Primer Ex TaqⅡ推薦的20 μL體系：10 μL SYBR?Primer Ex TaqTMⅡ qPCR，0.4 μL 10 μmol/L PCR上游和下游引物，2 μL cDNA模板和7.2 μL雙蒸水。在95 ℃、預(yù)變性30 s；95 ℃、變性20 s，60 ℃、退火30 s，72 ℃、延伸20 s，共40個循環(huán)；溶解曲線55～99 ℃，于LightCycler?96中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算TGF-β1、FOXQ1、E-cad、N-cad、VEGF mRNA的相對表達(dá)量。

表1 TGF-β1、FOXQ1、E-cad、N-cad、VEGF的引物序列

1.3 TGF-β1、FOXQ1、E-cad、N-cad、VEGF蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化染色。取卵巢上皮組織，石蠟包埋后按免疫組織化學(xué)SP法試劑盒說明書進(jìn)行操作，抗體稀釋濃度為1∶100～1∶400，以PBS為一抗設(shè)置陰性對照，DAB染色，用Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察切片，所有操作均在同一條件下進(jìn)行。染色判斷標(biāo)準(zhǔn)采用半定量計(jì)數(shù)法，在高倍(×400)視野下隨機(jī)選取5個視野(每個視野觀察不少于100個細(xì)胞)，按陽性細(xì)胞所占的百分比和著色強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)果判定。按著色強(qiáng)度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞數(shù)的百分比評分：陰性為0分，≤25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%～100%為4分。取著色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞數(shù)百分比評分的乘積作為總積分，以0～1為陰性、≥2為陽性。所有結(jié)果均為兩位病理科醫(yī)師在雙盲情況下進(jìn)行計(jì)分。

2 結(jié)果

2.1 三組TGF-β1、FOXQ1、E-cad、N-cad、VEGF mRNA表達(dá)比較 見表1。

表1 三組TGF-β1、FOXQ1、E-cad、N-cad、VEGF mRNA表達(dá)比較

注：與惡性組相比，*P<0.05。

2.2 三組TGF-β1、FOXQ1、E-cad、N-cad、VEGF蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2 三組TGF-β1、FOXQ1、E-cad、N-cad、VEGF蛋白表達(dá)陽性率比較(%)

注：與惡性組相比，*P<0.05。

2.3 不同臨床病理特征的上皮性卵巢癌組織中TGF-β1、FOXQ1、E-cad、N-cad、VEGF表達(dá)比較 見表3。

2.4 上皮性卵巢癌組織中TGF-β1、FOXQ1、E-cad、N-cad、VEGF表達(dá)的關(guān)系 上皮性卵巢癌組織中TGF-β1與FOXQ1、E-cad、N-cad呈正相關(guān)(r分別為0.335、0.123、0.411,P分別為0.003、0.002、0.000)，與VEGF無相關(guān)性(r=-0.198，P=0.070)；FOXQ1與E-cad呈正相關(guān)(r=0.321，P=0.000)，與N-cad、VEGF無相關(guān)性(r分別為-0.156、-0.111,P分別為0.060、0.800)；E-cad與N-cad、VEGF呈正相關(guān)(r分別為0.433、0.283,P分別為0.000、0.010)；N-cad與VEGF無相關(guān)性(r=-0.221，P=0.431)。

3 討論

2002年，Thiery[8]提出良性腫瘤通過EMT獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力，引發(fā)惡性腫瘤。在特定生理和病理情況下，EMT使上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化，增加細(xì)胞的遷移和運(yùn)動，使細(xì)胞失去極性，導(dǎo)致其黏附能力下降，從原位脫落，而發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞獲得與成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮的異質(zhì)性黏附增強(qiáng)，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力[9]。EMT主要特征是上皮細(xì)胞喪失極性而獲得間質(zhì)特性，典型標(biāo)志是上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cad增強(qiáng)。正常生理?xiàng)l件下，E-cad表達(dá)于各類正常上皮細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間緊密連接，在維持細(xì)胞的極性和組織結(jié)構(gòu)的完整性中起重要作用。E-cad表達(dá)降低或缺失是EMT最顯著的特征，同時(shí)也是多種腫瘤不良預(yù)后及轉(zhuǎn)移的臨床預(yù)后指標(biāo)[10,11]。1989年，Hashimoto等[12]報(bào)道E-cad在卵巢癌細(xì)胞的表達(dá)顯著降低，從而減弱了細(xì)胞之間的黏附能力，促使腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示惡性組E-cad mRNA和蛋白表達(dá)低于正常組和良性組，且與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。N-cad通過鈣介導(dǎo)同類細(xì)胞的黏附，在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和細(xì)胞識別過程中起重要作用。N-cad的高表達(dá)與E-cad的作用相反，具有增強(qiáng)從原發(fā)部位脫離的腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮或基質(zhì)的黏附作用，使上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞具有侵襲性表型并且易于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[13]。本研究結(jié)果顯示，惡性組N-cad mRNA和蛋白表達(dá)高于正常組和良性組，且與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與報(bào)道相一致。

表3 不同臨床病理特征的上皮性卵巢癌組織中TGF-β1、FOXQ1、E-cad、N-cad、VEGF mRNA表達(dá)比較

注：Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相比，*P<0.05。

TGF-β1能促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲，能促進(jìn)新生血管生成和抑制宿主抗腫瘤效應(yīng)，在癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中是一把雙刃劍[14]。Nakajima等[15]對胰腺癌細(xì)胞及組織的研究報(bào)道顯示，TGF-β1促進(jìn)N-cad的表達(dá)，同時(shí)減弱E-cad的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，惡性組TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)高于正常組和良性組，且與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。FoxQ1來源于Fox基因家族，是新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子之一，在多個信號通路交匯處發(fā)揮生物學(xué)作用，主要通過EMT在腫瘤和癌細(xì)胞產(chǎn)生惡性生物學(xué)作用。由于FoxQ1在多種腫瘤異常表達(dá)，現(xiàn)已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，如FoxQ1在肺癌中下調(diào)E-cad的表達(dá)，引起肺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，最終導(dǎo)致肺癌發(fā)生[5]。另外，F(xiàn)an等[16]研究報(bào)道，TGF-β1直接調(diào)控FoxQ1蛋白的表達(dá)，而FoxQ1又能直接與E-cad基因啟動子區(qū)域結(jié)合，抑制E-cad的表達(dá)，繼而啟動EMT的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示惡性組FoxQ1 mRNA和蛋白表達(dá)高于正常組和良性組，且與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。另外本研究發(fā)現(xiàn)，惡性組VEGF mRNA和蛋白表達(dá)高于正常組和良性組，且與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這與Li等[17]研究結(jié)果一致。但有研究報(bào)道，VEGF的表達(dá)可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT[18]，但具體機(jī)制尚不明確。本研究相關(guān)性分析顯示，上皮性卵巢癌中TGF-β1與FOXQ1、E-cad、N-cad呈正相關(guān)，F(xiàn)OXQ1與E-cad呈正相關(guān)，E-cad與N-cad、VEGF呈正相關(guān)，提示各指標(biāo)在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過程中，存在直接或間接的相互調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，上皮性卵巢癌卵巢上皮組織中TGF-β1、FOXQ1、VEGF、N-cad表達(dá)升高，E-cad表達(dá)降低，共同參與上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移。

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