和痹方灌胃對類風濕關節炎大鼠的治療作用及機制探討

張艷艷，邢潔，龐愛梅，姜萍

(1山東中醫藥大學，濟南250014；2山東中醫藥大學附屬醫院)

和痹方灌胃對類風濕關節炎大鼠的治療作用及機制探討

張艷艷1，2，邢潔1，龐愛梅2，姜萍1

(1山東中醫藥大學，濟南250014；2山東中醫藥大學附屬醫院)

目的 觀察和痹方(HBR)對類風濕關節炎(RA)的治療作用，并探討其機制。方法 將50只8周齡Wistar雄性大鼠隨機分為空白組、模型組、甲氨蝶呤(MTX)組、HBR組、HBR+MTX組各10只，空白組在大鼠尾根部及脊背部多點注射生理鹽水，其余各組大鼠尾根部及脊背部多點注射CⅡ型膠原乳化液制備RA大鼠模型。造模成功后MTX組、HBR組、HBR+MTX組分別以MTX 0.7 mg/kg(1次/周)、HBR 3 g/kg(1次/d)、MTX 0.7 mg/kg(1次/周)+HBR 3 g/kg(1次/d)灌胃，空白組和模型組以等體積生理鹽水灌胃。干預第60天心臟取血并留取膝關節，行膝關節HE染色評價軟骨破壞程度，Western blot法檢測滑膜組織轉錄因子-κB(NF-κB)p65，ELISA法檢測血清高遷移率組蛋白1(HMGB1)。結果 空白組軟骨形態及骨細胞排列正常,潮線完整。模型組軟骨面破壞，出現較多裂隙，軟骨變薄，細胞排列紊亂,潮線部分區域模糊；軟骨下骨質結構改變，炎性細胞浸潤。MTX組、HBR組、HBR+MTX組個別軟骨表面有少許表淺裂隙及局部表層缺失,軟骨細胞排列較整齊,潮線尚完整；軟骨下骨質中有少許炎性細胞浸潤。各組軟骨破壞評分、滑膜組織NF-κB p65蛋白表達及血清HMGB1水平比較,空白組

類風濕關節炎；和痹方；中藥；高遷移率組蛋白1；轉錄因子κB；甲氨蝶呤

有關的關節破壞因素中起關鍵的調控作用[1]。促炎因子高遷移率族蛋白1(HMGB1)在RA發病過程中發揮重要作用[2],并受NF-κB的調控。目前，RA的治療藥物主要包括非甾體抗炎藥、改善病情的抗風濕藥、糖皮質激素和生物制劑，常因藥物的不良反應或價格昂貴，患者難以堅持長期治療。因此，尋找不良反應小、經濟有效的藥物具有重要意義。本課題組前期研究發現，肝脾失調、內生風濕是RA，尤其是早期RA的主要內在發病機制[3]，以“舒肝理脾，祛風除濕，消腫止痛”為治法的和痹方(HBR)能夠有效改善早期RA臨床癥狀、減輕關節損傷[4]。2012年6月～2015年6月，我們觀察了HBR對RA的治療作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡Wistar雄性大鼠50只，體質量130～170 g，SPF級，購自山東大學醫學院實驗動物中心，動物質量合格許可證號:SCXK(魯)20140009。購進大鼠后供給充足的水和飼料，預飼養7 d。實驗試劑及藥品：CⅡ型膠原試劑、完全弗氏佐劑(FCA)購于美國SIGMA公司。HMGB1檢測試劑盒購于Bio Swamp公司，NF-κB兔多克隆抗體、山羊抗兔二抗購于Proteintech公司。和痹方濃縮劑(組成：當歸20 g、白芍30 g、白術15 g、蒼術15 g、川芎20 g、 防風9 g、青風藤20 g、腫節風30 g、生甘草6 g)由山東中醫藥大學附屬醫院制劑室提供，每毫升含生藥1 g，經高溫消毒后封瓶，4 ℃冰箱中保存備用。甲氨蝶呤(MTX)為上海醫藥集團有限公司信誼制藥總廠產品，用蒸餾水配成濃度為0.05 mg/mL的溶液，4 ℃冰箱保存備用。儀器：全波長酶標儀(Thermo Fisher 1510)，洗板機(FCC Compliance 76883)，酶標儀(BIO-RAD iMARK)，電泳儀(BIO-RAD Power pac)，顯影儀(SAGECREATION Minichemi 420-k4)等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與造模處理 將50只Wistar雄性大鼠隨機分成5組，分別為空白組、模型組、MTX組、HBR組、HBR+MTX組，每組10只。空白組在大鼠尾根部及脊背部多點注射生理鹽水，其余各組根據文獻[5]在大鼠尾根部及脊背部多點注射CⅡ型膠原乳化液制備RA大鼠模型。造模成功后MTX組、HBR組、HBR+MTX組分別以MTX 0.7 mg/kg(1次/周)、HBR 3 g/kg(1次/d)、MTX 0.7 mg/kg(1次/周)+HBR 3 g/kg(1次/d)灌胃，空白組和模型組以等體積生理鹽水灌胃。給藥第60天，在10%水合氯醛麻醉下行心臟取血[6]5 mL，分離血清備測；處死動物，截取膝關節，取膝關節滑膜，用生理鹽水清洗，-80 ℃冰箱保存。同時將剩余膝關節用中性甲醛浸泡固定后冷凍保存，留待進行病理切片。

1.2.2 關節軟骨破壞情況觀察 去除膝關節周圍組織，進行脫鈣、脫水；石蠟包埋后切片，HE染色，顯微鏡下觀察。根據軟骨破壞評分標準[7]進行評分 ，按嚴重程度分為0～5分。

1.2.3 滑膜組織NF-κB p65檢測 采用Western blot法。常規方法提取滑膜組織總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，行SDS-PAGE電泳，轉膜；一抗孵育，4 ℃過夜；漂洗后，二抗室溫孵育1 h。漂洗后滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統中進行灰度掃描，以相應蛋白條帶與內參光密度值比值來表示NF-κB p65的相對表達量。

1.2.4 血清HMGB1檢測 采用ELISA法檢測血清HMGB1，按照試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 各組關節內軟骨破壞程度比較 空白組:軟骨表面平滑，結構清晰，軟骨細胞排列呈柱狀,無軟骨細胞簇出現,潮線完整。模型組:軟骨面破壞，出現較多裂隙，軟骨變薄，細胞排列紊亂,潮線部分區域模糊；軟骨下骨質結構改變，炎性細胞浸潤。MTX組、HBR組、HBR+MTX組：個別軟骨表面有少許表淺裂隙及局部表層缺失,軟骨細胞排列較整齊,潮線尚完整；軟骨下骨質中有少許炎性細胞浸潤。各組軟骨破壞評分比較見表1。

2.2 各組滑膜組織NF-κB p65蛋白表達及血清HMGB1水平比較 見表1。

表1 各組軟骨破壞評分、滑膜組織NF-κB p65蛋白表達及血清HMGB1水平比較

注：與空白組比較，aP<0.05,bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01；與MTX組比較，eP<0.05,fP<0.01；與HBR組比較，gP<0.05，hP<0.01。

3 討論

RA的病因及發病機制至今尚未能完全闡明,一般認為炎癥細胞因子介導的體液免疫機制是RA炎癥反應的重要因素。研究[8]發現，NF-κB信號轉導通路是與RA進程密切相關的信號通路，通過抑制NF-κB通路可在一定程度上達到治療RA的目的。NF-κB為多種炎性因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1(IL-1)、HMGB1等信號通路的轉錄因子，調控炎性因子的活化；受到炎癥刺激后NF-κB發生活化，導致大量炎癥細胞和炎癥介質的合成與釋放。有研究[9]發現，細胞外HMGB1能與纖維蛋白溶酶原活化作用系統的多個組件結合，從而催化纖維蛋白溶酶原活化物和基質金屬蛋白酶(MMP)的活性，加速軟骨和骨的破壞；同時HMGB1是破骨細胞激活劑，對軟骨及軟骨下骨有直接的破壞作用[10]。另外，HMGB1可促進炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6等的生成與釋放，提高血管內皮生長因子水平，刺激成纖維樣滑膜細胞增殖和破骨細胞活化，參與血管翳的形成；同時，IL-6也可以促進MMPs的生成，對關節造成破壞。而TNF-α、IL-1、IL-6等炎性因子又可促進HMGB1的分泌[11～13]，這樣就形成了一個正反饋環路，從而使炎癥不斷得以放大，加快關節破壞。

RA屬中醫學痹證范疇，發病之初與肝脾功能失常密切相關。肝主筋，主疏泄，條暢氣機；脾主四肢，主運化，疏布精微。肝失疏泄，或脾失健運，氣機失暢，內生諸邪，或因虛外邪內侵，停于四肢末節，造成關節腫痛。日久影響氣血津液運行，留痰成瘀，由初期關節局部的滑膜組織炎癥逐漸發展到軟骨、骨質侵蝕和破壞，最終形成關節畸形，乃至全身性損害。故擬定HBR治療RA。方中當歸、白術為君藥，養血疏肝理脾；蒼術、白芍為臣藥，燥濕健脾，柔肝止痛。青風藤、腫節風祛風除濕，調通經絡；防風祛風勝濕止痛；川芎活血行氣，祛風止痛，共為佐藥。甘草既與白芍相配，酸甘化陰，養陰除痹，緩急止痛，又調和藥性，為使藥。全方補肝血疏肝用健脾除濕，祛風消腫定痛，標本同治，共奏舒肝理脾、祛風除濕、消腫止痛之功效[4]。

MTX是目前公認的治療RA的首選藥物。本課題組前期研究表明，MTX與HBR均可降低RA患者血清中IL-6、IL-17水平，升高血清IL-10水平，從而抑制RA的炎癥反應，并能夠調節與RA關節軟骨及骨質破壞密切相關的血清MMP-3、 NF-κB受體活化因子配基(RANKL)、骨保護素(OPG)水平，控制RA的骨破壞，而且HBR與MTX聯合用藥效果更顯著[14～16]。本研究結果顯示，HBR、MTX及兩者聯合應用，均可減少滑膜組織中NF-κB p65表達，降低血清HMGB1水平，減輕關節軟骨的破壞程度；并且，MTX與HBR聯用優于MTX、HBR單獨使用。因此，我們認為HBR能夠減輕關節軟骨破壞，與MTX聯用效果更好；該作用與其抑制滑膜組織NF-κB信號通路，降低血清HMGB1水平有關，可為HBR的臨床應用提供理論依據。

綜上所述，肝脾失調是早期RA的重要內在病機，HBR能夠抑制NF-κB信號通路，從而抑制其下游HMGB1等促炎性因子的生成，從而抑制RA的炎性反應，改善RA的關節軟骨破壞。

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(收稿日期：2016-10-23)

山東省科技發展計劃項目(2014GSF119017)；山東省中醫藥科技發展計劃項目(2015-101)。

姜萍(E-mail： lmdlmd6617@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.02.011

R255.6

A

1002-266X(2017)02-0037-03

2016-08-29)

類風濕關節炎(RA)是一種以侵蝕性關節炎為

主要臨床表現的自身免疫性疾病，致殘率較高。其病理表現為關節滑膜的慢性炎癥、血管翳的形成，并出現關節的軟骨和骨破壞，最終導致關節畸形和功能喪失。研究表明，轉錄因子-κB(NF-κB)在與RA