ITP小鼠外周血CD4+T細胞PD-1表達及血清IFN-γ、IL-10水平觀察

張穎，王蕾，龐楠楠，王秀娟，劉穎，王新有，孫明玲，哈力達·亞森，馬秀敏，郭新紅

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，新疆維吾爾自治區(qū)血液病研究所，烏魯木齊 830000)

ITP小鼠外周血CD4+T細胞PD-1表達及血清IFN-γ、IL-10水平觀察

張穎，王蕾，龐楠楠，王秀娟，劉穎，王新有，孫明玲，哈力達·亞森，馬秀敏，郭新紅

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，新疆維吾爾自治區(qū)血液病研究所，烏魯木齊 830000)

目的 觀察原發(fā)免疫性血小板減少癥(ITP)小鼠外周血CD4+T細胞程序性死亡分子1(PD-1)表達及血清IFN-γ、IL-10水平情況。方法 20只Balb/c小鼠隨機分為正常組、模型組各10只。正常組不做特殊處理，模型組隔日給予腹腔注射豚鼠抗小鼠血小板抗血清(GP-APS)100 μL/20 g，建立ITP模型，造模成功后繼續(xù)隔日注射GP-APS，連續(xù)7 d。第8天取兩組小鼠外周血，流式細胞術(shù)檢測CD4+T細胞表面PD-1的表達，同時分離血清，用CBA法檢測IFN-γ、IL-10水平。結(jié)果 模型組、正常組小鼠外周血CD4+T細胞PD-1表達率分別為8.16%±1.03%、6.82%±0.38%，兩組相比P<0.05。模型組、正常組小鼠血清IFN-γ水平分別為(3.58±0.68)、(1.42±0.61)pg/mL，IL-10水平分別為(18.25±1.94)、(27.66±4.98)pg/mL，兩組相比P均<0.05。結(jié)論 ITP小鼠外周血CD4+T細胞表面PD-1表達增高，血清IFN-γ水平升高，血清IL-10水平降低。ITP疾病中存在Th1/Th2失衡。

原發(fā)性血小板減少癥；程序性死亡分子1；干擾素γ；白細胞介素10

原發(fā)免疫性血小板減少癥(ITP)是一種復雜的、多種免疫機制共同參與的獲得性自身免疫性出血性疾病。大量研究[1～3]表明ITP患者存在T細胞免疫失耐受及Th細胞亞群漂移。機體免疫應答過程中T細胞的活化、增殖需要共刺激分子的參與。程序性死亡分子1(PD-1)是免疫應答的負性共刺激分子，主要表達于CD4+T細胞等成熟T細胞表面，與其配體PD-L1結(jié)合后通過其胞質(zhì)尾部的免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)傳入抑制性刺激信號，協(xié)同促進Th0細胞向Th2分化，從而抑制Th0細胞向Th1細胞分化，影響IFN-γ、IL-10等細胞因子的分泌，在免疫應答中發(fā)揮負性調(diào)控作用[4]。因此，PD-1表達異常可導致PD-1/PD-L1抑制通路發(fā)生改變，進而引起機體免疫功能紊亂，導致疾病的發(fā)生。目前PD-1/PD-L1信號通路在部分免疫性及腫瘤性疾病領(lǐng)域得到廣泛研究，但其在ITP方面的研究仍較少。2014年5月～2015年9月，本研究觀察了ITP小鼠外周血CD4+T細胞PD-1的表達水平及其對細胞因子(IFN-γ、IL-10)分泌的影響，以探討PD-1在ITP疾病中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器及試劑 40只雌性SPF級Balb/c小鼠(體質(zhì)量18～22 g，8周齡)、6只雌性3月齡豚鼠，均購于新疆醫(yī)科大學實驗動物飼養(yǎng)繁殖中心，許可證號：SCXK(新)2010-0001。動物飼養(yǎng)和實驗均在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院動物實驗中心進行，許可證號：SYXK(新)2010-0001。完全弗氏佐劑(FCA)和不完全弗氏佐劑(FICA)購自Sigma公司；辣過氧化物酶標記重組蛋白A(Protein A/HRP)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；大鼠抗小鼠CD3-PerCP、CD4-FITC、PD-1-PE熒光標記抗體、紅細胞裂解液、小鼠CBA試劑盒購自BD公司。FACSAria Ⅱ流式細胞儀購自BD公司；BC-5300Vet全自動血細胞計數(shù)儀購自美國mindray公司。

1.2 方法

1.2.1 ITP模型建立、動物分組及干預方法 取20只Balb/c小鼠摘眼球取全血EDTA-Na2抗凝，離心分離血小板調(diào)整密度至5×109/L。取血小板懸液分別與等量FCA和FICA混合，取FCA抗原1 mL于第1周注射于豚鼠背部皮下及腹股溝；取FICA抗原1 mL于第2、3、5周注射于豚鼠，每次至少5點。第6周5%水合氯醛麻醉豚鼠，腹主靜脈取不抗凝全血，離心分離血清即為豚鼠抗小鼠血小板抗血清(GP-APS)。ELISA法檢測GP-APS效價，設陰性對照，Protein A/HRP標記抗體，檢測在450 nm處測吸光度(A)值，A值大于或等于陰性對照孔A值的2倍即為GP-APS陽性。將GP-APS從-20 ℃取出，56 ℃水浴30 min滅活補體，0.9% NaCl稀釋成1∶2濃度待用。將剩余20只Balb/c小鼠隨機分為正常組10只，模型組10只。正常組正常飼養(yǎng)，不做特殊處理。模型組參照國內(nèi)造模方法[5]并進行改進，分別于第1、3、5、7天向小鼠腹腔注射GP-APS，每次100 μL/20 g，隔日檢測血小板計數(shù)，若血小板在7 d內(nèi)維持原水平的11%～25%，則造模成功，繼續(xù)隔日注射GP-APS，連續(xù)7 d。第8天取小鼠外周血檢測CD4+T細胞表面PD-1及IFN-γ、IL-10細胞因子水平。

1.2.2 CD4+T細胞PD-1表達檢測 采用流式細胞術(shù)。各標記試管分別加入新鮮抗凝全血100 μL，向試驗管中分別加入CD3-PerCP、CD4-FITC、PD-1-PE抗體各5 μL，充分混勻，室溫避光20 min。向各試管中分別加入500 μL紅細胞裂解液，混勻后室溫避光10 min，1 000 r/min離心5 min，棄去上清加1 mL的PBS洗滌離心棄去上清。用400 μL的PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。以SSC-FSC設門，調(diào)節(jié)熒光補償后計數(shù)10 000個淋巴細胞，觀察CD4+PD-1+T細胞的表達情況。

1.2.3 血清IFN-γ、IL-10水平檢測 按CBA試劑盒說明書進行操作：取9支試管并編號，分別標記為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256，每管加入稀釋液300 μL。第1管加入標準品300 μL，混勻后吸出300 μL移至第2管；如此反復稀釋至第8管，混勻后吸出300 μL棄去，第9管做空白對照。向各標記試管中分別加入微球混合液、小鼠血清、PE抗體各35 μL，渦旋混勻后室溫避光2 h。加入1 mL洗滌液以200 g/min離心5min，棄去上清。各試管加至300 μL重懸，流式細胞儀檢測后采用CBA分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠外周血CD4+T細胞PD-1表達率比較 模型組、正常組小鼠外周血CD4+T細胞PD-1表達率分別為8.16%±1.03%、6.82%±0.38%，兩組相比P<0.05。

2.2 兩組小鼠血清IFN-γ、IL-10水平比較 結(jié)果見表1。

表1 兩組小鼠血清IFN-γ、IL-10水平比較

注：與正常組相比，aP<0.05。

3 討論

PD-1是共刺激分子CD28超家族成員，是一種55 kD的Ⅰ型糖蛋白及細胞表面單體。PD-1與配體PD-L1結(jié)合后，能夠達到抑制T細胞活化、增殖及細胞因子分泌的免疫負性調(diào)控作用[6]。因此PD-1/PD-L1通路在維持外周免疫耐受中有重要作用。近年來，在自身免疫性糖尿病、自身免疫性腦脊髓膜炎、重癥肌無力和干燥綜合征等自身免疫性疾病中有大量關(guān)于PD-1的研究報道[7～10]，該類患者體內(nèi)PD-1呈高表達。動物實驗干預PD-1信號后可促進疾病進展。在腫瘤、感染等疾病的研究中也相繼發(fā)現(xiàn)，T細胞表面PD-1表達明顯上調(diào)[11,12]。目前已有抗人PD-1單抗用于腫瘤和傳染病等方面的臨床治療研究[13]。ITP是一種復雜的自身免疫性疾病，與其他自身免疫性疾病相同，都存在著T細胞免疫失耐受。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠外周血CD4+T細胞PD-1表達升高，與上述研究結(jié)果相同。

CD4+Th0細胞可分化為Th1、Th2細胞亞群，Th1細胞主要分泌IFN-γ、IL-2等細胞因子，Th2細胞主要分泌IL-4、IL-10等細胞因子，二者因分泌細胞因子的不同而發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用，共同維持機體免疫狀態(tài)的穩(wěn)定。生理條件下，機體Th1/Th2細胞的免疫功能處于動態(tài)平衡，在不同因素的作用下，Th0選擇性向Th1或Th2細胞偏移、分化。一旦這種比例失衡，機體就會趨向疾病狀態(tài)。我們前期的研究表明，CD4+T細胞亞群與ITP的發(fā)生密切相關(guān)，且呈Th1細胞優(yōu)勢狀態(tài)，推測可通過調(diào)節(jié)細胞因子來改善ITP患者病情[3]。本研究與既往研究結(jié)果相同，ITP小鼠Th1型細胞因子(IFN-γ)水平明顯升高，Th2型細胞因子(IL-10)水平降低，且IFN-γ/IL-10增高，從而再次證實ITP疾病中存在Th1/Th2失衡。PD-1/PD-L1信號通路具有抑制性調(diào)控作用，但本研究中表達增高的PD-1卻沒發(fā)揮阻斷T細胞過度免疫應答、抑制IFN-γ等Th1型細胞因子的分泌、扭轉(zhuǎn)ITP中Th細胞亞群漂移的作用。對此，我們推測PD-L1可能存在非PD-1的其他受體，在特定情況下，PD-L1與其結(jié)合阻斷了PD-1/PD-L1信號傳導，使活化的T細胞不能及時獲得足夠強度的抑制性調(diào)控信號，導致T細胞過度活化、增殖，造成機體持續(xù)性自身免疫反應。我們需進一步通過體外PD-1阻斷試驗來闡述PD-1/PD-L1在ITP中作用方式及途徑。

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新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金資助項目(2014211C043)。

郭新紅(E-mail： guoxinhong222@sina.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.02.010

R558

A

1002-266X(2017)02-0035-03