間歇低氧后正常氧培養(yǎng)不同時間胎鼠海馬神經(jīng)元HMGB1、NMDA表達變化

孫文文，吳丹，韓笑，宋毅軍，馮靖，曹潔

(1天津醫(yī)科大學研究生院，天津 300070；2天津醫(yī)科大學總醫(yī)院神經(jīng)病研究所；3天津醫(yī)科大學總醫(yī)院)

·基礎研究·

間歇低氧后正常氧培養(yǎng)不同時間胎鼠海馬神經(jīng)元HMGB1、NMDA表達變化

孫文文1，吳丹2，韓笑2，宋毅軍2，馮靖3，曹潔3

(1天津醫(yī)科大學研究生院，天津 300070；2天津醫(yī)科大學總醫(yī)院神經(jīng)病研究所；3天津醫(yī)科大學總醫(yī)院)

目的 觀察間歇低氧后正常氧培養(yǎng)不同時間胎鼠海馬神經(jīng)元高遷移率族蛋白1(HMGB1)、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)表達變化。方法 孕16～18 d的SD大鼠，取其胎鼠海馬神經(jīng)元細胞培養(yǎng)至第7天，將細胞隨機分為對照組、低氧組。低氧組細胞以低氧5 min/常氧5 min進行暴露，頻率為6次/h，持續(xù)暴露時間為4 h。對照組細胞持續(xù)暴露于正常氧4 h。暴露結(jié)束后兩組細胞放入標準細胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)2、4、6、8 h。采用實時熒光定量PCR檢測兩組胎鼠海馬神經(jīng)元HMGB1、NMDA mRNA。結(jié)果 低氧組常氧培養(yǎng)2、4、6、8 h時海馬神經(jīng)元HMGB1 mRNA相對表達量分別為0.004 7±0.001 13、0.013 5±0.00 10、0.001 1±0.000 15、0.000 6±0.000 12，與對照組(0.001 7±0.000 16)相比P均<0.05，4 h時與其他各時點相比P均<0.05。低氧組常氧培養(yǎng)2、4、6、8 h時海馬神經(jīng)元NMDA mRNA相對表達量分別為0.025 7±0.002 2、0.032 2±0.001 5、0.044 3±0.011 7、0.058 3±0.009 9，與對照組(0.017 4±0.002 7)相比P均<0.05，8 h時與其他各時點相比P均<0.05。結(jié)論 胎鼠海馬神經(jīng)元間歇低氧后正常氧培養(yǎng)2、4 h時HMGB1 mRNA表達升高，6、8 h時表達降低；NMDA mRNA表達隨正常氧培養(yǎng)時間(2～8 h)延長而增加。

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征；間歇低氧；海馬神經(jīng)元；高遷移率族蛋白1；N-甲基-D-天冬氨酸；胎鼠

間歇低氧是阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSA)的重要病理生理特征之一[1]，引起的神經(jīng)病理學改變包括神經(jīng)元死亡、認知功能障礙、情感障礙，認知功能障礙主要是由海馬CA1區(qū)域神經(jīng)元的凋亡引起[2,3]。從死亡或瀕臨死亡的細胞中釋放出來的分子可引起無菌炎癥，這些分子也被稱為損傷相關(guān)分子模式(DAMP)，常見的DAMP包括熱休克蛋白、高遷移率族蛋白1(HMGB1)。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體是一種廣泛分布于神經(jīng)突觸后膜的谷氨酸受體，其異常激活引起神經(jīng)興奮毒性，在多種神經(jīng)退行性疾病如缺血缺氧性腦損傷、阿爾茨海默病的認知損害中均有報道[4]。已有小鼠體外模型證明，慢性間歇低氧認知功能障礙與NMDA受體的過度激活、海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣超載有關(guān)[5]，癲癇、神經(jīng)創(chuàng)傷等腦損傷中HMGB1可促進NMDA引起的神經(jīng)元死亡[6]。間歇低氧停止后，其誘發(fā)的神經(jīng)炎癥是否還會繼續(xù)造成神經(jīng)元損傷尚不明確。2015年12月～2016年9月，本研究觀察了胎鼠海馬神經(jīng)元間歇低氧后正常氧培養(yǎng)不同時間HMGB1、NMDA表達變化，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和儀器 健康SD大鼠購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。0.25%胰酶、胎牛血清、DMEM-F12培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、B27均購自美國Gibco公司；多聚賴氨酸、谷氨酰胺購自美國Sigma公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；HMGB1、NMDA引物合成及測序于上海生工生物公司完成；PCR試劑購自北京普凱瑞公司；混合氣購自天津泰亞氣體公司；日本Olympus光學倒置顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)；美國Bio-Rad熒光定量PCR儀。

1.2 胎鼠海馬神經(jīng)元獲取及培養(yǎng) 腹腔麻醉孕16～18 d的SD大鼠，無菌條件下取出胎鼠，并快速分離海馬組織，用眼科剪將組織剪成1 mm3的碎片，將碎片用0.125%的胰酶在37 ℃消化15 min。隨后用1∶1的種植培養(yǎng)基(1%青霉素-鏈霉素、20%胎牛血清、1%谷氨酰胺、78%DMEM/F12)終止消化。用吸管吹打制成單細胞懸液，將細胞接種到提前用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中。4 h后將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基(2%B27、1%谷氨酰胺、1%青霉素-鏈霉素，96% neurobasal培養(yǎng)基)，每2～3 d半量換液。海馬神經(jīng)元在37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)7 d。剛接種的神經(jīng)元在鏡下呈圓形，海馬神經(jīng)元培養(yǎng)4 h后細胞突起數(shù)增多，折光性很強。24 h后，大部分細胞長出3～4個突起，長度較長，有少數(shù)細胞聚合。培養(yǎng)2 d后，神經(jīng)元突起增多并延長，胞體逐漸變大。培養(yǎng)5 d后，神經(jīng)元胞體逐漸生長，突起逐漸延長，形成較密的網(wǎng)絡。培養(yǎng)7 d后，神經(jīng)元細胞生長良好，胞體清晰較大，呈三角線、圓形、棱形或多邊形，突起飽滿并形成稠密的神經(jīng)網(wǎng)絡。

1.3 胎鼠海馬神經(jīng)元分組及間歇低氧處理 采用天津醫(yī)科大學總醫(yī)院呼吸科仿真系統(tǒng)1.0設置低氧/再氧合循環(huán)模式[7]。低氧混合氣含1.5% O2、93.5% N2、5% CO2,正常氧混合氣含21% O2、74% N2、5% CO2。自行設計制作細胞培養(yǎng)艙，采用溫控器、加熱濕化器和微孔濾膜使培養(yǎng)艙中為無菌環(huán)境，溫度為37 ℃，濕度在45%～70%。海馬神經(jīng)元培養(yǎng)7 d后隨機分為低氧組和對照組。參照文獻[8]，將低氧組和對照組細胞培養(yǎng)皿放在上述自制培養(yǎng)艙內(nèi)，分別暴露于間歇低氧和正常氧的環(huán)境中。低氧組細胞以低氧5 min/常氧5 min進行暴露，頻率為6次/h，持續(xù)暴露時間為4 h。對照組細胞持續(xù)暴露時間是4 h。暴露結(jié)束后兩組細胞放入標準細胞孵育箱(37 ℃，5% CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)2、4、6、8 h。

1.4 胎鼠海馬神經(jīng)元HMGB1、NMDA mRNA檢測方法 培養(yǎng)2、4、6、8 h后，棄上清，用TRIzol法提取海馬神經(jīng)元細胞總RNA(1 mL/孔)。以適量DEPC水溶解RNA，并取一部分用紫外分光光度儀測算OD260與OD280比值，并根據(jù)OD260值推算其濃度。待確定純度符合要求后，將RNA采用一步法進行real-time PCR法測定HMGB1、NMDA mRNA。HMGB1、NMDA和β-actin的基因序列均查自Gene Bank,引物序列由專業(yè)軟件Primer5.0設計。HMGB1上游引物序列:5′-ATGGGCAAAGGAGATCCTA-3′，下游引物序列:5′-ATTCATCATCATCATCTTCT-3′；NMDA上游引物序列:5′-TATGTGTGGCCTCGGATGTGT-3′，下游引物序列:5′-TCTTCCCGTGCTTGCCATT-3′；β-actin上游引物序列:5′-GAAATCGTGCGTGACATTA-3′，下游引物序列:5′-TAGGAGCCAGGGCAGTAA-3′。總反應體系20 μL，在熒光定量PCR儀(Bio-rad,美國)設定PCR循環(huán)參數(shù)：42 ℃ 5 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 3 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 10 s，共40個循環(huán)。實驗結(jié)果數(shù)值以Ct值表示，每組細胞重復檢測3次，取平均值作為該組細胞的Ct值。以β-actin為內(nèi)參，應用2-ΔCt法計算HMGB1、NMDA mRNA相對表達量。

2 結(jié)果

兩組胎鼠海馬神經(jīng)元HMGB1、NMDA mRNA相對表達量比較見表1。

表1 兩組胎鼠海馬神經(jīng)元HMGB1、NMDA mRNA相對表達量比較±s)

注：與對照組相比，aP<0.05；與同組2 h時相比，bP<0.05；與同組4 h時相比，cP<0.05；與同組6 h時相比，dP<0.05。

3 討論

OSA患者的神經(jīng)認知功能隨著夜間低氧的損害程度而加重。海馬是學習記憶的主要功能腦區(qū)，其中CA1區(qū)最易受缺氧損傷，間歇低氧會導致神經(jīng)元凋亡[3,9]。HMGB1是一種高度保守、分布廣泛的非組織胺DNA結(jié)合蛋白，參與多種細胞的生理功能，在細胞核調(diào)節(jié)眾多轉(zhuǎn)錄因子和DNA的相互作用。

近年來，HMGB1被定義為一種重要的促炎細胞因子，其促炎作用是在細胞外發(fā)揮的。機體受到不同因素刺激時，活化的免疫細胞主動分泌或從壞死、損傷細胞中釋放HMGB1誘發(fā)炎癥反應、缺血、免疫疾病和神經(jīng)退行性病變。HMGB1廣泛表達于不同組織，包括腦、腎等。在腦組織中，HMGB1主要分布在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和垂體后葉細胞，而神經(jīng)元是缺血性腦損傷釋放HMGB1的主要來源[10]，可見HMGB1參與神經(jīng)炎癥反應[11]。一些酶如NADPH氧化酶、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧化酶2(COX-2)分別通過產(chǎn)生活性氧簇、活性氮簇和前列腺素引起炎癥反應。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，iNOS和COX-2分別通過產(chǎn)生活性氮簇和前列腺素引起神經(jīng)元的損傷。而在腦缺血模型中給予外源性的HMGB1可增加炎癥因子TNF-α和iNOS合成。Kim等[12]研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后HMGB1作為促炎因子連接興奮中毒引起的急性損傷過程和延遲的炎癥過程。也有報道神經(jīng)元釋放的HMGB1在如癲癇、酗酒等情況下介導神經(jīng)炎癥[13]。細胞外HMGB1作為炎癥因子通過激活小膠質(zhì)細胞刺激其他炎癥因子的分泌，并促進與其表面受體結(jié)合，如Toll-like受體(TLR)、NF-κB受體，從而加重腦損傷，在損傷或凋亡的神經(jīng)元附近可發(fā)現(xiàn)HMGB1的累積[14,15]。在創(chuàng)傷性腦損傷中，HMGB1由損傷的神經(jīng)元細胞釋放到細胞外并激活小膠質(zhì)細胞表面的TLR4受體誘發(fā)神經(jīng)炎癥從而引起神經(jīng)元的損傷[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，胎鼠海馬神經(jīng)元間歇低氧后正常氧培養(yǎng)2、4 h海馬神經(jīng)元分泌的HMGB1 mRNA水平升高，6、8 h時表達水平降低。4 h后神經(jīng)炎癥因子分泌達到高峰并加重神經(jīng)元炎性損傷，引起神經(jīng)元死亡或凋亡數(shù)量增加，細胞分泌的HMGB1逐漸減少。表明即使間歇低氧暴露撤除，神經(jīng)元的損傷也持續(xù)存在，間歇低氧不是維持神經(jīng)炎癥的必備條件。急性損傷，例如缺氧，可以直接引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元損傷。受損傷的神經(jīng)元通過產(chǎn)生許多有毒的內(nèi)源性物質(zhì)，例如HMGB1釋放到細胞外和膠質(zhì)細胞表面的模式識別受體結(jié)合激活小膠質(zhì)細胞，激活的小膠質(zhì)細胞分泌許多炎癥和毒性因子加重神經(jīng)元損傷[17]。而在腦缺血模型中，給予HMGB1中和抗體可抑制缺血后炎癥反應，減輕腦缺血損傷程度，改善腦組織功能[18]。

NMDA組成亞基有三種，NR2亞單位上有與谷氨酸結(jié)合位點，NR2B主要位于前腦和海馬區(qū)，在學習和認知功能中發(fā)揮重要作用。在缺血或缺氧、神經(jīng)變性等病理生理情況下，過度激活NR2B可以引起興奮性毒性并導致神經(jīng)元死亡。間歇低氧炎癥可激活iNOS，該酶僅在炎癥情況下表達在小膠質(zhì)細胞上。iNOS可以引起神經(jīng)元去極化和谷氨酸釋放，激活NMDA受體。有研究報道，海馬神經(jīng)元釋放的HMGB1可促進NMDA受體的興奮毒性和功能[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，胎鼠海馬神經(jīng)元間歇低氧后正常氧培養(yǎng)，其HMGB1表達先升高后降低，NMDA表達隨培養(yǎng)時間延長而增加，推測NMDA和HMGB1可能發(fā)揮協(xié)同作用引起神經(jīng)元凋亡和功能障礙。

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國家自然科學基金資助項目(81570084)。

馮靖(E-mail: tjzyyfj@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.02.009

R364.4

A

1002-266X(2017)02-0032-03

2016-09-27)