JNK信號通路受抑制的人白血病K562/ADR細胞對尼洛替尼敏感性

嚴婧，何志旭，欒佐

(1貴州醫(yī)科大學，貴陽550004；2北京海軍總醫(yī)院)

JNK信號通路受抑制的人白血病K562/ADR細胞對尼洛替尼敏感性

嚴婧1，何志旭1，欒佐2

(1貴州醫(yī)科大學，貴陽550004；2北京海軍總醫(yī)院)

目的 觀察JNK信號通路受到抑制的人白血病K562/ADR細胞對尼洛替尼的敏感性。方法 培養(yǎng)人白血病敏感細胞株K562和耐阿霉素細胞株K562/ADR，采用CCK-8法測算尼洛替尼對細胞的半抑制濃度(IC50)及耐藥指數(shù)。用4 μg/mL的SP600125抑制K562/ADR細胞JNK信號通路后進行尼洛替尼處理，CCK-8法測算細胞尼洛替尼IC50。將K562/ADR細胞分為對照組、尼洛替尼組、聯(lián)合組，對照組未處理，尼洛替尼組采用20 μmol/L尼洛替尼處理，聯(lián)合組先用4 μg/mL SP600125預處理2 h，再用20 μmol/L尼洛替尼處理，熒光定量PCR檢測各組細胞內MDR1基因，Western blot法檢測各組細胞內P-糖蛋白(P-gp)。結果 K562/ADR細胞對尼洛替尼的耐藥指數(shù)為K562細胞的19.58倍。抑制JNK信號通路后，尼洛替尼對K562/ADR細胞的IC50由(12.53±0.11)μmol/L下降到(6.77±0.24)μmol/L(P<0.05)。對照組、尼洛替尼組、聯(lián)合組K562/ADR細胞MDR1 mRNA相對表達量分別為0.967 8±0.006 2、0.513 6±0.012 4、0.267 1±0.008 7，P-gp相對表達量分別為1.007 4±0.004 1、0.596 1±0.013 6、0.363 7±0.006 9，兩兩組間比較，P均<0.05。結論 JNK信號通路受抑制的人白血病K562/ADR細胞對尼洛替尼敏感性增加，這與抑制JNK信號通路可降低K562/ADR細胞中MDR1基因的表達有關。

白血?。欢嗨幠退?基因；JNK信號通路；SP600125；尼洛替尼

慢性粒細胞白血病是一種起源于造血干細胞的惡性增殖性疾病。臨床上以化療為主要治療手段，在化療過程中細胞多藥耐藥(MDR)的產(chǎn)生是治療時遇到的主要障礙[1]。因此如何提高化療敏感性和減少耐藥的發(fā)生已成為白血病臨床治療急需解決的問題之一。MDR的產(chǎn)生主要是由于MDR1基因編碼的P-糖蛋白(P-gp)表達增加。MDR1基因的過表達使化療藥物從細胞內泵出到細胞外，從而減少細胞內藥物的聚集量和細胞毒作用，誘導耐藥發(fā)生，進而阻礙化療藥物的有效治療[2]。尼洛替尼是第二代酪氨酸激酶抑制劑，是目前臨床治療慢性粒細胞白血病耐藥的首選化療藥物之一[3]。人慢性粒細胞白血病耐阿霉素細胞株K562/ADR對與阿霉素化學結構和作用機制不同的化療藥物具有交叉耐藥性且過表達P-gp[4]。目前大量研究[5～8]證實,JNK信號通路具有調控MDR1基因表達的作用。但目前對JNK信號通路和MDR逆轉之間的關系仍研究較少，尼洛替尼調節(jié)MDR1逆轉MDR的過程是否涉及JNK信號通路的調節(jié)仍不清楚。本實驗通過檢測JNK通路受到抑制的K562/ADR細胞對尼洛替尼的敏感性以及細胞內MDR1、P-gp的表達水平，進一步探究JNK信號通路與MDR的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 人白血病細胞株K562來自貴州醫(yī)科大學干細胞中心實驗室細胞庫；耐阿霉素細胞株K562/ADR購自中國江蘇凱基生物技術股份有限公司；RPMI1640購自美國Gibco公司；胎牛血清購自以色列BI公司；青鏈霉素混合液購自美國Hyclone公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學公司；尼洛替尼、SP600125購自中國大連美侖生物技術有限公司；MDR1和GAPDH上下游引物由中國上海捷瑞生物工程有限公司合成；TRIzol Reagent購自美國Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人白血病敏感細胞株K562和耐阿霉素細胞株K562/ADR用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。K562/ADR細胞加入終濃度為1 μg/mL的阿霉素以維持耐藥性，細胞呈懸浮生長，待細胞長到培養(yǎng)瓶的70%～80%時傳代，K562/ADR在無藥培養(yǎng)液中培養(yǎng)兩周后進行實驗。

1.2.2 K562/ADR細胞對尼洛替尼耐藥性觀察 采用CCK-8法。取對數(shù)生長期人白血病敏感細胞株K562和耐阿霉素細胞株K562/ADR，在96孔板中配置100 μL的細胞懸液，每孔5 000個細胞，在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，除對照組外，各自加入不同濃度(0、5、10、20 μmol/L)的尼洛替尼，每組設4個復孔，培養(yǎng)24 h后每孔加入10% CCK-8溶液，在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，用酶標儀檢測450 nm波長處光密度值(OD值)。實驗重復3次。使用下列公式計算細胞的生長抑制率和耐藥指數(shù)(RF)：生長抑制率(%)=(1-OD實驗組/OD對照組)×100%，RF=藥物對抗藥性細胞的半抑制濃度(IC50)/藥物對敏感性細胞的IC50，用中效方程式計算IC50。0、5、10、20 μmol/L尼洛替尼處理的K562細胞的生長抑制率分別為11.14%±2.57%、53.08%±1.35%、62.39%±2.14%、71.03%±1.74%，處理的K562/ADR細胞的生長抑制率分別為3.18%±1.51%、20.05%±2.75%、38.47%±1.67%、46.53%±2.58%。尼洛替尼對K562、K562/ADR細胞的IC50分別為(0.64±0.08)、(12.53±0.11)μmol/L，RF為19.58。

1.2.3 JNK信號通路受抑制的K562/ADR細胞對尼洛替尼敏感性觀察 將K562/ADR細胞分為尼洛替尼組和尼洛替尼+SP600125組。尼洛替尼組使用0、5、10、20 μmol/L尼洛替尼處理24 h，每組設3個平行孔。尼洛替尼+SP600125組先用4 μg/mL SP600125預處理2 h，再用0、5、10、20 μmol/L尼洛替尼處理24 h，每組設3個平行孔。取兩組對數(shù)生長期細胞進行細胞耐藥性檢測，檢測方法同“1.2.2”。

1.2.4 K562/ADR細胞MDR1 mRNA表達檢測 采用熒光定量PCR法。將K562/ADR細胞分為對照組、尼洛替尼組、聯(lián)合組，對照組未處理，尼洛替尼組采用20 μmol/L尼洛替尼處理，聯(lián)合組先用4 μg/mL SP600125預處理2 h，再用20 μmol/L尼洛替尼處理。分別檢測各組細胞中MDR1 mRNA的表達量，內參基因為GAPDH。用TRIzol試劑提取不同藥物濃度處理24 h后的K562/ADR細胞總RNA，測定并調整總RNA質量濃度為1 μg/μL。RNA產(chǎn)物置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。將RNA按First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒逆轉錄為cDNA，置于-20 ℃保存。MDR1和GAPDH引物序列：MDR1上游引物為5′-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，下游引物為5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′，GAPDH上游引物為5′-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3′，下游引物為5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′，按IQTMSYBR Green Supermix試劑盒反應體系進行擴增。熒光定量PCR反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，39個循環(huán)。以GAPDH作為內參照，以2-ΔCt法計算各組細胞中MDR1 mRNA相對表達量。

1.2.5 K562/ADR細胞P-gp表達檢測 采用Western blot法。細胞分組同“1.2.4”，分別檢測各組細胞中的P-gp。用PBS處理細胞，提取蛋白并定量，上樣、電泳及轉膜，膜的封閉及抗體孵育，顯色。用化學發(fā)光分析儀分析各條帶吸光度值。以GAPDH為內參基因，計算各組細胞P-gp相對表達量。

2 結果

2.1 JNK信號通路受抑制的K562/ADR細胞對尼洛替尼敏感性 尼洛替尼+SP600125組中尼洛替尼對K562/ADR細胞的IC50為(6.77±0.24)μmol/L，較尼洛替尼組低(P<0.05)。

2.2 各組K562/ADR細胞MDR1 mRNA表達比較 對照組、尼洛替尼組、聯(lián)合組K562/ADR細胞MDR1 mRNA相對表達量分別為0.967 8±0.006 2、0.513 6±0.012 4、0.267 1±0.008 7，兩兩組間比較，P均<0.05。

2.3 各組K562/ADR細胞P-gp表達比較 對照組、尼洛替尼組、聯(lián)合組K562/ADR細胞P-gp相對表達量分別為1.007 4±0.004 1、0.596 1±0.013 6、0.363 7±0.006 9，兩兩組間比較，P均<0.05。

3 討論

MDR是指細胞對多種化學結構和作用機制完全不同的化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥的復雜生物學過程[9]，是目前臨床上抗腫瘤治療的一大難題。超過90%的腫瘤患者死亡原因被認為與MDR的發(fā)生有關[10]。腫瘤細胞MDR的發(fā)生機制十分復雜，涉及藥物外排、藥物代謝、細胞周期改變和細胞凋亡、遷移等。目前認為MDR的產(chǎn)生通常是由于ATP依賴型轉運體(ABC)的過表達，ABC轉運體是廣泛存在于細胞膜表面的轉運體家族。P-gp或MDR1或ABCB1是由人類MDR1基因編碼的蛋白，且研究表明MDR1基因編碼的P-gp的表達水平增加在MDR形成中發(fā)揮最主要的作用[11]。腫瘤耐藥細胞中P-gp的主要功能是依賴ATP能將抗腫瘤藥物及其他外源物質排出細胞外，導致細胞內藥物含量的降低。已有研究證實，白血病、多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌、大腸癌等多種腫瘤的MDR形成與P-gp的過表達有著密切聯(lián)系。研究者針對腫瘤MDR細胞的分子途徑研制新的靶向藥物，即MDR1抑制劑，包括孕烷X受體、酪氨酸激酶等[12～16]。

慢性粒細胞白血病的遺傳學特征是出現(xiàn)Ph染色體，即以t(9,22)(q34；q21)染色體易位形成的BCR-ABL融合基因為主要標志，其編碼的融合型蛋白P210為一種活性酪氨酸激酶，能導致髓系造血發(fā)生異常克隆性增殖，是導致慢性粒細胞白血病的根本原因。BCR-ABL基因在95%的慢性粒細胞白血病患者的腫瘤細胞中表達，故采用特異性BCR-ABL激酶抑制劑能有效治療慢性粒細胞白血病。尼洛替尼是第二代酪氨酸激酶抑制劑，是目前臨床治療慢性粒細胞白血病耐藥的首選藥物之一，通過抑制酪氨酸激酶活性，從而抑制細胞增殖，誘導凋亡。尼洛替尼與ABCB1和ABCG2轉運體蛋白密切相關，可選擇性調節(jié)MDR轉運蛋白的活性，抑制其將藥物泵出細胞外的能力，且有研究發(fā)現(xiàn)尼洛替尼能抑制ABCB1向細胞外轉運物質的功能[17]。

研究表明，MDR1基因表達的調節(jié)可能涉及應激反應和信號傳導途徑，比如JNK信號通路。JNK是一種應激性的蛋白激酶，可以因炎性因子、內毒素、滲透休克、紫外輻射等被激活。以c-Jun為中心的c-Jun氨基末端激酶是促分裂原激活的蛋白激酶信號通路(MAPK)眾多通路中的一個，MAPK是細胞生長和分化的重要環(huán)節(jié)，是信號從細胞表面轉導到細胞核內的重要傳遞者。由JNK介導的信號通路通過c-Jun調節(jié)細胞增殖、凋亡、胚胎發(fā)育和腫瘤形成等細胞學行為。目前越來越多研究證實了JNK信號通路具有調控MDR基因表達的作用，且c-Jun還可以在轉錄水平上調節(jié)MDR1基因[18]。本實驗目的是探討尼洛替尼逆轉K562/ADR MDR的信號傳導機制，以及在尼洛替尼作用下的K562/ADR細胞內JNK信號通路與MDR1的關系和可能的作用機制。

K562/ADR細胞具有Ph染色體和BCR-ABL融合基因特征性標志，其高表達P210，對多種凋亡誘導劑呈現(xiàn)特殊的耐受性。K562/ADR細胞是K562細胞經(jīng)阿霉素誘導產(chǎn)生的多藥耐藥株，其保持K562細胞的基本表型，且過表達P-gp。本實驗中，K562/ADR細胞對尼洛替尼的RF是K562細胞的19.58倍。說明K562/ADR對尼洛替尼也具有一定的耐藥性，即K562/ADR對與阿霉素化學結構和作用機制不同的化療藥物具有交叉耐藥性，表現(xiàn)出MDR細胞的特點[19]。

SP600125是一種可逆的ATP競爭性JNK選擇性抑制劑，可顯著抑制JNK介導的MAPK活性[20]。為探討在K562/ADR細胞中JNK與MDR1表達的關系，本實驗用SP600125來抑制JNK的表達從而探討尼洛替尼逆轉K562/ADR MDR中JNK與MDR1表達的關系。有實驗表明4 μg/mL的SP600125可阻斷JNK信號通路的磷酸化，但該濃度對K562/ADR細胞幾乎無毒性作用[21]。本實驗結果顯示在尼洛替尼與SP600125共同處理K562/ADR細胞后，對細胞的IC50降低、MDR1 mRNA的表達量降低，P-gp表達降低，表明尼洛替尼作用下K562/ADR細胞內MDR1 mRNA表達水平的下調與JNK信號通路的抑制有關。因此阻斷JNK信號通路為慢性粒細胞白血病提供了新的治療靶點。

JNK信號通路在MDR形成中所起的作用存在雙重性[22]，有研究發(fā)現(xiàn)JNK的活化與MDR1/P-gp的表達有關[23]，而在對阿霉素耐藥的白血病細胞株HL-60/ADR中發(fā)現(xiàn)JNK的持續(xù)激活和c-Jun的過度表達與耐藥性存在正相關，抑制JNK的活性可以降低MDR1蛋白表達，增強細胞對藥物的敏感性。本研究結果顯示，抑制JNK能下調腫瘤細胞中MDR1/P-gp的表達。JNK信號通路在MDR1表達過程中如何發(fā)揮作用還需進一步研究證明。

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Sensitivity of human leukemia K562/ADR cells with inhibited JNK signaling pathway to nilotinib

YANJing1,HEZhixu,LUANZuo

(1GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To observe the influence of inhibiting JNK signaling pathway on the sensitivity of K562/ADR cells to nilotinib.Methods The inhibitory concentration (IC50) and resistance index of K562 cells and K562/ADR cells to nilotinib was measured by CCK-8 assay. K562/ADR cells were exposed to nilotinib after JNK signaling pathway was inhibited by 4 μg/mL SP600125. CCK-8 assay was used to detect the IC50. K562/ADR cells were divided into the control group, nilotinib group and the combination group. The control group was not treated, nilotinib group was treated with 20 μmol/L nilotinib, and the combination group was first treated with 4 μg/mL SP600125 for 2 h, and then treated with 20 μmol/L nilotinib. The MDR1 gene was detected by real-time PCR. The P-glycoprotein (P-gp) was detected by Western blotting.Results The resistance index of K562/ADR cells to nilotinib was 19.58 times higher than that of K562 cells. The IC50of K562/ADR cells to nilotinib decreased from (12.53±0.11) μmol/L to (6.77±0.24) μmol/L after inhibition of JNK signaling pathway (P<0.05). The relative expression of MDR1 mRNA in K562/ADR cells was 0.967 8±0.006 2, 0.513 6±0.012 4, and 0.267 1±0.008 7 in the control group, nilotinib group and the combination group; the relative expression of P-gp was 1.007 4±0.004 1, 0.596 1±0.013 6, and 0.363 7±0.006 9, respectively; and significant difference was found between every two groups (allP<0.05).Conclusion The sensitivity of human leukemia K562/ADR cells with inhibited JNK signaling pathway to nilotinib is increased, which is associated with that the inhibition of JNK signaling pathway can decrease the expression of MDR1 gene in K562/ADR cells.

leukemia; multidrug resistance 1 gene; c-Jun N-terminal kinase; SP600125; nilotinib

嚴婧(1991-)，女，碩士研究生，住院醫(yī)師，主要研究方向為血液腫瘤與造血干細胞的研究。E-mail: 1013449116@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.02.004

R733.72；R551.3

A

1002-266X(2017)02-0014-04

2016-09-23)