萜類化合物的合成生物學研究進展

孫麗超 李淑英 王鳳忠 辛鳳姣（中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193）

萜類化合物的合成生物學研究進展

孫麗超 李淑英 王鳳忠 辛鳳姣
（中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193）

萜類化合物是種類最多的一類天然產物，具有抗癌、抗過敏等多種生物活性，在食品、日化、醫療等領域受到廣泛關注，展現了巨大的應用潛力和廣闊的市場前景。近年來，研究人員采用功能基因組學和代謝組學技術對不同萜類的合成途徑進行了深入研究，為萜類的合成生物學研究提供了大量的數據支撐。目前，已經通過合成生物學方法構建出萜類高產的酵母工程菌株，實現了多種目標產物的高效生產，有效提高了萜類的總體生產水平。因此，采用合成生物學策略合成萜類化合物，有望成為植物源萜類生產的有效技術手段。首先介紹了合成生物學概念，進而總結了植物源萜類的重要功能和應用領域，并簡述了不同萜類的合成途徑，歸納了現有的萜類生產方式，然后深入探討了萜類生物合成的設計策略，最后以幾種常見的萜類為例，詳細論述了不同萜類的合成生物學的研究進展。

萜類化合物；生物合成；萜類合成設計；合成生物學進展

合成生物學是21世紀新興的一門學科，結合了傳統的代謝工程和系統生物學概念，旨在建立人工生物系統，將基因連接成網絡，使微生物底盤細胞完成設計人員設想的各種任務，具體過程包括底盤細胞的構建、合成元件的挖掘、合成途徑的設計以及細胞合成工廠的創建［1］。微生物具有生長代謝速率高、培養條件封閉易控制、多種營養缺陷型選擇標記便于基因編輯操作、可通過生化反應器放大規模等諸多特點，選擇其作為底盤細胞具有獨特的優勢。目前通常采用質譜、LC-MS、GC-MS及核磁共振技術，通過將合成產物與天然產物進行比較的方法，檢測合成產物的質量。采用合成生物學技術生產目的產物具有穩定、高效、經濟、環境友好等一系列優點，因此，該技術既被用來模擬已有生物元件及合成途徑生產天然產物，也被用于生產制造各種化學品和燃料，甚至還被用于設計、合成新型非天然藥物。

近年來，國家對生物制造業給予了大力支持，我國合成生物學的發展如火如荼。以中國科學院天津工業生物技術研究所馬延和為首席的“人工合成細胞工廠”“973項目”，圍繞著大腸桿菌及光合藍細菌進行了大量研究，通過光合模塊和CO2固定實現了從CO2到酮、醇及酸等化學品的生物合成［2］。北京化工大學袁其朋團隊以大腸桿菌作為底盤細胞，經莽草酸途徑合成了3-苯基丙酸、3-（4-）羥基丙酸以及4-羥基香豆素等多種芳香族化合物［3］。以清華大學陳國強為首席的“973項目”則以嗜鹽單胞菌為對象，實現了聚羥基脂肪酸（polyhydroxyalkanoates，PHA）等高分子材料、化學品和燃料的生物制造［4，5］。以中國科學院微生物研究所張立新為首席的“合成微生物體系的適配性研究”“973項目”，則以大腸桿菌和鏈霉菌作為底盤細胞，生產微生物藥物阿維菌素、聚酮類藥物及核苷肽類藥物等［6］。上海交通大學許平團隊則開展了大量關于天然食品添加劑的生物合成學研究，采用自養光合菌如假單胞菌合成多元醇類生物香料、利用藍藻生產乳酸、通過聚球藻生產苯丙烷類等高值化合物，實現了多種天然生物香料和藥用谷氨酰胺的產業化生產［7，8］。中國科學院院士鄧子新提倡挖掘基因組“Dark holes”，帶領團隊以深海、極地等極端環境微生物以及動植物共生生物為研究對象，克隆鑒定多種抗生素基因簇，開展關于非天然抗生素藥物的合成生物學研究，獲得了大量新型抗生素衍生物，顯著推動了我國微生物藥物生物合成領域的發展［9］。隨著合成生物學的不斷發展和完善，該學科將為能源、材料、醫藥、食品、日化等行業提供更多的產品支撐。

1 萜類化合物的合成生物學研究

1.1 萜類化合物的種類及其應用

萜類化合物是自然界廣泛存在的一大類異戊二烯衍生物（isoprenoids），主要從植物、微生物及海洋生物中分離得到。萜類通式是（C5H8）n（n是異戊二烯的單元數）。根據n的數目，萜類化合物可分為半萜（C5）、單萜（C10）、倍半萜（C15）、二萜（C20）、二倍半萜（C25）、三萜（C30）、四萜（C40）和多萜（n＞C40）［10］。目前發現的萜類超過5萬多種，常見的有單萜薄荷醇（menthol）、倍半萜青蒿素（artemisinin）、二萜紫杉醇（taxol）、三萜人參皂苷（ginsenoside）、四萜類胡蘿卜素化合物（carotenoids）等。

萜類有著重要的生物學功能和應用價值，見表1。現代醫學研究發現，很多萜類都具有廣泛的抗癌功效［11］。來源于真菌屬月光菌的倍半萜隱杯傘素S（illudin S）及其類似物伊洛福芬（irufloven）能夠有效抑制轉移性腎癌中的DNA合成［12］。紅豆杉屬植物中的三環二萜化合物紫杉醇對卵巢癌和乳腺癌有明顯的療效［13］。葫蘆科來源的三萜化合物葫蘆素（cucurbitacin）能夠抑制癌細胞的生長，可與其他抗癌藥物一起用于癌癥治療。其中，葫蘆素E具有抑制癌細胞增殖的功能，該結果已在膀胱癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌及白血病中得到證實［14，15］。葫蘆素B除了被證實具有抑菌和消炎活性，還能夠抑制人類惡性腫瘤細胞的生長，包括乳癌細胞、頭頸部鱗癌、胰腺癌、肝癌、骨肉瘤和骨髓性白血病［16-18］。截至目前，已有多種葫蘆科植物來源的葫蘆素及葫蘆素衍生物被分離出來［19］。

萜類還具有消炎、降糖等廣泛的藥理作用。研究發現，三萜皂苷類能夠消炎、抗過敏、治療白血病、抗病毒、降血糖以及防治心腦血管疾病等［20］。2013年，人參皂苷化合物K（compound K，CK）被我國藥監局批準為防治關節炎的臨床用藥（CDEL20130379）。Yan等［21］發現CK是三萜皂苷在哺乳動物血液和器官中發揮消炎、保肝、降糖及抗癌等功效的主要組分。來源于菊科植物（俗稱青蒿）的倍半萜內酯衍生物青蒿素不僅能夠抗癌、消炎，還被發現是一種非常強大的抗瘧疾藥物，且不與其他抗瘧藥產生交叉耐藥性［22］。四萜化合物番茄紅素（lycopene）是類胡蘿卜素的一種，存在于番茄、西瓜、葡萄柚等的果實中，是一種很強的食用抗氧化劑，能夠有效抑制脂質的氧化，清除羥自由基。流行病學及臨床醫學實驗發現，食用番茄紅素不僅能夠防治前列腺癌、乳腺癌、子宮癌、肺癌、膀胱癌、口腔癌、食道癌、胃癌、直腸癌及胰腺癌，還具有預防心腦血管疾病、延緩衰老等功效［23，24］。

此外，很多植物源萜類化合物是芳香性揮發性物質，因此被廣泛應用于香料、香水、調味劑及化妝品等行業［25］。諾卡酮（nootkatone）、紫蘇醇（sclareol）、薄荷醇（menthol）及芳樟醇（linalool）等芳香萜類是植物性精油的重要組成成分，也是果實芳香和植物花香等的氣味來源，因此是芳香食品和精油類化妝品中常用的香料［26］。

很多萜類是植物與昆蟲協同進化過程中所產生的次生代謝產物，能夠吸引傳粉動物輔助植物授粉，抑或對昆蟲有拒食作用，幫助植物抵御蟲害和病原微生物，因此常被用于農藥中［27］。一些單萜如檸檬烯（limonene）和香葉烯（myrcene）均有很好的殺蟲性，一些單萜烯類的衍生物如除蟲菊酯（pyrethrin）則是非常高效的植物性殺蟲劑［28］。一些三萜如檸檬苦素類化合物（limonoids）也是很強的昆蟲防御劑，被用作農作物的防蟲害劑。其他三萜類化合物，如葫蘆素C、二萜水蓼二醛（polygodial）均參與了植物的抗蟲功能［29，30］。

萜類結構的多樣性還使得其成為汽油、柴油等燃料的高級替代物。事實上，倍半萜法尼烯（farnesene）和紅沒藥烯（bisabolene），單萜蒎烯（pinene）和檸檬烯，半萜異戊烯醇（isopentenol）和異戊醇（isopentanol）均是公認的燃料及燃料的前體物［31］。

表1 萜類化合物的功能與應用

1.2 萜類化合物的合成

1.2.1 萜類的生物合成途徑 植物源萜類化合物是植物中結構變化種類最多的一類天然產物，其在生物體中的合成可以由異戊二烯首尾相接，也可以通過異戊二烯成環形成［32］。異戊二烯首先需要通過活化轉化成異戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和二甲基丙烯基二磷酸（dimethylallylpyrophosphate，DMAPP）。生物體內IPP和DMAPP的合成存在兩種途徑：由3個乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）形成的甲羥戊酸（mevalonate acid-dependent，MEV）途徑以及由丙酮酸（pyruvate）或3-磷酸甘油醛（glyceraldehyde 3-phosphate，G-3-P）縮合形成的甲基赤蘚醇（2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP/deoxyxylulose 5-phosphate，DXP）途徑，不同途徑的選擇取決于生物的種類以及合成產物的亞細胞空間位置［33］。植物采用MEV和MEP/ DXP兩種途徑來合成IPP和DMAPP（圖1）。其中，MEV途徑主要用于植物細胞質中的倍半萜、三萜及多萜的合成，MEP/DXP途徑主要用于植物質體中的單萜、二萜和四萜的合成［34，35］。除了植物以外的其他真核生物均采用MEV合成IPP，并在IPP異構酶的作用下生成DMAPP。原核生物則主要通過MEP/DXP途徑將G-3-P轉變成IPP和DMAPP［36］。

圖1 植物源萜類的生物合成途徑

IPP和DMAPP是所有萜類的共同前體，一分子DMAPP和不同分子數的IPP在異戊烯轉移酶（prenyltransferase）的作用下會進一步生成不同的萜類前體［37］。這些前體在各種萜類合酶（terpene synthases，TPS）的作用下會被合成種類各異的萜類骨架，因此，萜類合酶是不同萜類合成過程中的關鍵因子［38］。不同萜類的合成途徑如圖1所示，具體如下：（1）單萜：一分子IPP和一分子DMAPP能夠生成牻牛兒基焦磷酸（greanyl diphosphate，GPP）或橙花基焦磷酸（neryl diphosphate，NPP），GPP是無環單萜前體，NPP是單環單萜前體，它們在單萜合酶的催化下合成不同的單萜，如GPP在香葉醇合成酶的催化下能夠產生無環單萜香葉醇（geraniol）；NPP在檸檬烯合酶（limonene synthase，LS）的催化下則會合成單環單萜骨架檸檬烯（limonene），并進一步經過氧化還原作用等反應合成單萜薄荷醇。（2）倍半萜：兩分子IPP和一分子DMAPP生成倍半萜前體法呢基焦磷酸（fanesyl diphosphate，FPP），其在倍半萜合酶如紫穗槐-4，11-二烯合酶（amorpha-4，11-diene synthase，ADS）的催化下生成青蒿素的前體紫穗槐二烯（amorphadiene）。（3）二萜：三分子IPP和一分子DMAPP產生二萜的前體牻牛兒牻牛兒基焦磷酸（greanylgeranyl diphosphate，GGPP），其在二萜合酶如紫杉烯合酶（taxadiene synthase，TXS）的催化下能夠合成紫杉醇的前體紫杉-4（5），11（12）-二烯（taxadiene）；（4）三萜：倍半萜前體FPP在鯊烯合酶（squalene synthase，SQS）的催化下合成鯊烯（squalene），鯊烯經鯊烯環氧酶（squalene epoxidase，SQE）催化加氧轉變成2，3-氧化鯊烯（2，3-oxidosqualene），并在不同的鯊烯環化酶（oxidosqulene cyclase，OSCs）的作用下環化形成三萜骨架，如β-香樹素（β-amyrin）、羽扇豆醇（Lupeol）、葫蘆二烯醇（Cucurbitadienol）等。因此，不同種類三萜的合成取決于鯊烯環化酶的種類。萜類骨架在細胞色素P450單加氧酶（cytochrome P450，CYP450）、CYP450輔 酶（CYP reductase，CPR）、 脫 氫 酶（dehydrogenases）、 糖基轉移酶（glycosyltransferase，GT）和酰基轉移酶（acyltransferase，ACT）的作用下會進一步進行氧化、糖基化和酰基化等化學修飾，最終獲得不同的萜類化合物，如膜甾醇、油菜素內酯、人參皂苷等［11］。1.2.2 萜類的生產方法 近年來，萜類化合物的合成研究成為了生物學領域的熱點之一。大規模生產高價值的萜類化合物是科研工作者和企業的共同目標。目前萜類的生產方法主要有3種：植物提取法、化學合成法和生物合成法（表2）。2015年諾貝爾生理學或醫學獎得主、中國中醫科學院首席科學家屠呦呦［39］及其同事通過不斷改進提取方法，最終于1972年從青蒿中提取到了微量的新型抗瘧藥——青蒿素。但是，萜類在植物中的含量通常很低，且植物提取法還存在野生資源稀缺、分離效果不佳、產量極低的問題。中國科學院院士涂永強課題組［40］則通過建立仿生合成路線，對具有生物活性萜類抗癌藥物的合成進行了大量系統性的化學合成研究。化學合成法雖解決了植物提取法中的諸多問題，但仍存在原料昂貴、工藝流程復雜、立體選擇性低、能耗高、污染大、總收率偏低等問題。相比之下，生物合成法不受原料的限制、生產過程綠色清潔、產物單一、產率提升空間大，具有很大的優勢。

表2 萜類生產方法的比較

生物合成法又分為兩種，一種是通過代謝工程手段直接在植物中促進萜類的合成；另一種是通過合成生物學在微生物等底盤細胞中合成目標產物。第一種方法是直接向植物中引入強啟動子驅動的萜類合酶，從而實現萜類的生產［41］。如通過過表達芳樟醇合酶可以大量生產單萜芳樟醇，構建的轉基因植株包括矮牽牛、番茄、康乃馨、馬鈴薯及擬南芥［42-45］。這種代謝工程操作不僅用于高效生產萜類化合物，還可以用于改變作物的一些性狀，如提高觀賞植物和水果等的香味和口感，改善植物的授粉效率，增強植物的抗病和抗蟲能力等。此外，還能幫助理解植物萜類化合物的合成途徑和調控方式，揭示已有途徑的旁支通路和反饋途徑等。但是，由于植物生長緩慢，且體內代謝過程錯綜復雜，這種萜類合成方法面臨著目標產物產量有限、后期分離困難、生產周期長等問題。為了實現萜類的高產，研究人員越來越多的開始嘗試合成生物學手段［46］。

1.3 萜類的合成生物學研究

1.3.1 萜類合成生物學的設計策略

1.3.1.1 底盤細胞的選擇及改造 選取不同的底盤細胞對于萜類的生物合成有關鍵性的影響。例如，大腸桿菌中萜類前體IPP和DMAPP主要用于tRNA的異戊烯化和FPP的合成，進而用于醌類和細胞壁的合成，因此該底盤細胞主要用于酮、醇、酸等化學品而非萜類的生物合成［47］。代謝工程和合成生物學領域的先驅人物，如加州大學洛杉磯分校的James Liao教授和伯克利分校的Jay Keasling教授，他們的實驗室也曾通過大腸桿菌進行萜類化合物的生物合成，但均需重構IPP和DMAPP的合成途徑。如Farmer等［48］在大腸桿菌中重構MEV途徑，提高了番茄紅素的生物合成產量：向培養基中外源添加丙酮酸，并在重構番茄紅素合成途徑的大腸桿菌中過表達磷酸烯醇式丙酮酸合酶（phosphoenolpyruvate synthase，PPS），使得丙酮酸轉化成磷酸烯醇式丙酮酸，促進碳代謝流由丙酮酸向G-3-P逆流，進而得到大量類異戊二烯的前體，最終每克細胞干重中得到了25 mg番茄紅素，比單純重構番茄紅素合成途徑的大腸桿菌的發酵產量提高了5倍。Kim等［49］在重構番茄紅素合成途徑的大腸桿菌中，使用CRISPRi技術重新平衡MEV途徑的代謝流，通過設計不同的sgRNA并比較其基因敲除效率，將MVA途徑中的基因表達平均降低了81.6%，最終使得番茄紅素的產量提高了9倍。Martin［25］則通過在大腸桿菌中建立酵母MEV途徑促進FPP的合成，同時過表達紫穗槐二烯合酶，并向培養基中外源添加甘油（0.8% V/V），最終使得青蒿素前體紫穗槐二烯的積累高達112.2 mg/L。

由于細菌缺少翻譯后修飾而難以表達細胞色素P450，且很多萜類化合物具有抗菌活性，因此多采用釀酒酵母等真核生物進行萜類的生物合成［50，51］。利用酵母細胞工廠的好處是酵母能夠直接合成較多的DMAPP和IPP，從而為萜類合成提供大量前體物。選用酵母作為底盤細胞還可以通過酵母基因組的必需基因分析，保留最小基因組，從而在萜類的生物合成過程中減少其內源消耗。所有基因工程操作都可以通過染色體融合完成，保證了酵母工程菌株的遺傳穩定性。通過酵母全基因組的篩選還能夠獲得一些高活性的內源啟動子與終止子，如清華大學戴俊彪課題組［52］通過篩選釀酒酵母全基因組，獲得了一些酵母來源的啟動子和終止子。此外，他們還在釀酒酵母中構建了生物合成的功能模塊，能夠快速實現多基因代謝通路中的蛋白的異源表達，并完成多個轉錄單元的一步組裝。選擇酵母細胞的另一個優勢是可以通過對酵母細胞進行耐高溫、耐酸、耐鹽等抗逆改造，如清華大學林章凜教授［53］主持的“973項目”研究了適合微生物的合成生物學抗逆元器件，獲得了具有重要產業價值的微生物抗酸器件和工業菌株，為實現萜類目的產物的高密度發酵和產業轉化奠定了研究基礎。

1.3.1.2 萜類合成途徑的挖掘 合成途徑的挖掘是合成生物學快速發展的保障。目前已經從擬南芥、水稻、苜蓿、百脈根等不同的植物中分離得到了幾十個編碼鯊烯環化酶的基因［54］。大量的基因組學數據表明，細胞色素P450家族在植物萜類化合物的合成過程中扮演著關鍵的角色［55］。隨著全基因組測序、第二代DNA測序技術以及宏基因組學技術的發展，越來越多的天然產物的代謝途徑被挖掘出來。研究發現，植物萜類化合物的合成往往伴隨著基因表達簇結構的發現。通過萜類化合物基因表達簇的鑒定，研究人員發現了不同萜類合成通路中的鯊烯環化酶、共表達的CYP450 以及輔酶CPR。如中國農業科學院蔬菜花卉研究所黃三文團隊［56］通過破解黃瓜的基因組數據，發現黃瓜苦味基因（Bitter，Bi）基因編碼的蛋白為鯊烯環化酶。為了破解黃瓜苦味合成、調控及馴化的分子機制，他們進一步挖掘黃瓜組學數據，并結合代謝組學、遺傳學以及分子生物學技術，最終鑒定出9個與黃瓜中葫蘆素C合成相關的基因（Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G698490、Csa3G903540、Csa3G903550、Csa1G044890、Csa6G088700）［19］。這一系列研究為三萜葫蘆素的生物合成奠定了重要的數據基礎。

萜類的生物合成是一個多因素調節的動態過程。通過異源基因的密碼子優化、啟動子終止子的選取和搭配組合、代謝途徑基因簇的共表達、合成途徑的標準化組裝、關鍵調控基因的精細調控、細胞合成工廠的創建、發酵條件摸索及發酵工藝優化等方面的深入研究，能夠顯著提高萜類合成關鍵酶的異源高效表達以及萜類的合成能力。

1.3.2 萜類化合物的合成生物學研究進展

1.3.2.1 單萜 釀酒酵母能夠利用體內的 MEV途徑合成IPP和DMAPP，進而縮合成GPP，為單萜的生物合成提供前體物質。因此，在釀酒酵母中外源表達單萜合酶有望實現單萜的合成。以芳樟醇為例，Herrero等［57］通過在釀酒酵母T73-4中表達來源于仙女扇的S-芳樟醇合酶（linalool synthases，LIS）的基因，從而引入了芳樟醇合成代謝通路，構建出了能夠有效分泌芳樟醇的重組菌株，最終達到18 μg/L的積累水平。類似地，Zhang等［58］在釀酒酵母中表達了來源于軟棗獼猴桃（Actinidiaarguta）的芳樟醇合酶的基因，實現了芳樟醇的產量為59.85 μg/L。Rico等［59］在表達芳樟醇合酶的基礎上進一步調節了該菌株中的類異戊二烯生物合成途徑，通過過表達羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoA還原酶）的催化結構域（truncated HMG-CoA reductase，tHMGR），解除了MEV途徑中羥甲戊酸合成的內源限速步驟，最終使得芳樟醇產量進一步提高到132.66 μg/L。考慮到異戊二烯二磷酸異構酶（IDI1）參與的異構化反應能夠實現IPP和DMAPP之間的可逆轉化，是實現GPP合成的重要步驟，江南大學陳堅課題組［60］在過表達HMG1的催化結構域的基礎上，同時過表達了IDI1，以期提高釀酒酵母中MEV合成途徑的代謝通量，強化GPP合成供給，結果發現芳樟醇產量仍然只有127.71 μg/L。為了提高單萜在釀酒酵母中的合成，陳堅課題組［61，62］進行了大量的深入研究，結果發現檸檬烯處理釀酒酵母細胞會誘發活性氧脅迫，引起菌體凋亡。Parveen等［63］則通過轉錄組學分析發現，單萜α單蒎烯（α-terpinene）脅迫會造成釀酒酵母的細胞膜功能損傷。因此，宿主對單萜的低耐受程度可能是限制單萜產量提高的瓶頸。對于釀酒酵母耐受單萜的機理研究將為構建高單萜耐受性的酵母菌株提供更多的理論依據。

1.3.2.2 倍半萜 青蒿素是具有內過氧橋結構的倍半萜內酯類化合物，是目前研究最多關注度最高的一種倍半萜。以有效劑量的青蒿素為基礎、輔以傳統抗瘧藥物的聯合療法（artemisinin-based combination therapy，ACT）被世界衛生組織批準為治療瘧疾的最有效的辦法。由于人工合成青蒿素的難度很大，且價格昂貴，青蒿素的生產曾主要依賴從中國傳統中草藥青蒿中提取，但這種方法產量極低，導致青蒿素類藥物緊缺，價格波動幅度大，ACT療法昂貴，因此亟需尋找更穩定的青蒿素生產方法。Keasling團隊［64］對于青蒿素生物合成的研究工作是合成生物學領域取得的一項突破性進展。截止目前，他們已經在釀酒酵母中實現了青蒿素前體青蒿酸的合成與產業化，為化學合成青蒿素以及活性抗瘧藥物青蒿琥酯（artesunate）提供了大量前體。在該項工作中，他們首先在酵母中過表達了來自青蒿的紫穗槐-4，11-二烯合酶，實現了FPP向青蒿素前體紫穗槐二烯的合成，但合成量很低，這是因為酵母細胞中的大部分IPP和DMAPP前體會進入麥角固醇合成通路。隨后，他們在該菌株中重構了MEV途徑，使得與FPP合成相關的基因發生上調，而FPP流向其他通路如固醇的基因表達則發生下調，從而提高了FPP的合成產量，并通過染色體重組將MEV途徑整合到酵母基因組上，保證了改造菌株的遺傳穩定性，再輔助以固醇轉錄因子UPC2的表達，最終使得紫穗槐二烯的合成產量提高到153 mg/L，比之前的報道高出了500倍。后續的發酵實驗甚至使得紫穗槐二烯的產量達到27 g/L。由于很多萜類代謝的中間產物如FPP對細胞均有毒性，研究者希望通過在大腸桿菌中構建壓力傳感器，調節細胞的代謝負荷，進而提高目的產物的表達。Keasling實驗室的成員通過全基因組的轉錄芯片測序，鑒定出了一些能夠響應有毒代謝產物的啟動子。采用響應FPP積累的啟動子驅動大腸桿菌中紫穗槐二烯合成途徑的基因表達，結果使得紫穗槐二烯的產量達到1.6 g/L。因此，根據目的產物的合成途徑，選取對某個中間產物敏感的啟動子驅動目的產物的基因表達，可以有效提高目的產物的產出。這一方法將是提高目的產物的一種重要的通用工具［65］。為了實現紫穗槐二烯向青蒿酸的轉變，他們從青蒿中分離得到了一種CYP450單加氧酶CYP71AV1，并協同表達CYP71AV1的輔酶CPR，實現了紫穗槐二烯的三步氧化，最終使得1 L發酵罐中青蒿酸產物的產量達到115 mg/L，生產效率比植物提取法提高了兩個數量級。為了進一步提高青蒿酸的合成，Keasling團隊在酵母中將MEV途徑中的所有的酶全部進行了過表達，青蒿酸的產量達到約1.6 g/L，而紫穗槐二烯的產量更是比青蒿酸高10倍以上。于是，他們進一步對紫穗槐二烯生產菌株的發酵條件進行了優化，最終使得紫穗槐二烯的產量高達＞40 g/L，為青蒿素的化學合成提供了大量前體［66］。在此基礎上，他們團隊在青蒿中鑒定出了兩個新的植物脫氫酶（artemisnic alcohol dehydrogenase，ADH1；artemisnic aldehyde dehydrogenase，ALDH1）和一個細胞色素氧化酶（cytochrome b5，CYB5），通過在酵母中進行表達，讓紫穗槐二烯到青蒿酸的合成過程變得更具體高效，最終使得青蒿酸的發酵產量達到了25 g/L［67］。這項技術的知識產權已經免費釋放。Keasling團隊的這一系列工作極大地推動了青蒿琥酯等高效抗瘧藥物成分的生產，有效地降低了ACT治療的價格，是合成生物學領域的經典案例，也對其他昂貴藥物的合成生物學研究具有寶貴的借鑒意義［68］。

1.3.2.3 二萜 很多萜類是傳統中藥的關鍵藥用成分，如丹參酮類化合物（tanshinones）屬于松香烷型去甲二萜化合物，是中藥丹參的主要脂溶性活性成分，通常由其前體次丹參酮二烯（Miltiradiene）和鐵銹醇合成得到。中國醫學科學院中藥研究所黃璐琦課題組［69，70］通過功能基因組學技術從丹參中鑒定了兩個次丹參酮二烯合酶：SmCPS（labdadienyl/ copalyl diphosphate synthase）和SmKSL（kaurene synthase-like）。天津工業生物技術研究所張學禮課題組［71］將SmCPS和SmKSL整合到酵母基因組上，然后一方面過表達tHMGR抑制酵母中FPP向麥角固醇的合成；另一方面則過表達ERG20-BTS1-SaGGPS和一個固醇調節因子UPC2.1，使得次丹參酮二烯的合成達到了61.8 mg/L，分批發酵的方式能將次丹參酮二烯的合成進一步提高到488 mg/L。中國科學院大連物理研究所趙宗保課題組［72］。在采用合成生物學生產次丹參酮二烯的過程中，提出了一種新的模塊途徑工程（modular pathway engineering，MOPE）策略，通過將次丹參酮二烯合成途徑的4個關鍵酶進行融合表達，包括催化FPP合成的ERG20（farnesyl diphosphate synthase）、將FPP轉化成GGPP的BTS1（GGPP synthase）以及兩個次丹參酮二烯合酶SmCPS和SmKSL的融合，使得次丹參酮二烯的合成代謝流更加高效，最終構建出了高產次丹參酮二烯的酵母工程菌株，產量高達365 mg/L。隨后，他們利用第二代DNA測序技術鑒定了6個與丹參酮積累相關的CYP450基因，并通過基因表達和體外酶活篩選發現，CYP76AH1負責催化次丹參酮二烯轉化生成鐵銹醇。通過從中藥丹參中克隆不同的CPR，進行CYP450和CPR等模塊元件間的適配性分析，鑒定出SmCPR1（Salvia miltiorrhizaCPR）為更合適的CYP76AH1輔酶，最終使得搖瓶培養條件下酵母細胞合成鐵銹醇的產量達到10.5 mg/L［73］。隨著深度測序、代謝組學以及轉錄組學技術對丹參的基因組、轉錄組和代謝組數據的挖掘，越來越多的與丹參酮合成通路相關的基因被鑒定出來，這些數據為丹參酮的合成生物學研究奠定了扎實的理論基礎［74-77］。丹參酮合成生物學的研究對于其他藥用、食用萜類的異源合成將具有重要的參考價值［78］。

1.3.2.4 三萜 三萜人參皂苷是人參中的主要有效成分，屬于糖苷類化合物，包括齊墩果烷型無環三萜類皂苷和達瑪烷型四環三萜類皂苷，后者又包含人參二醇型皂苷和人參三醇型皂苷。人參皂苷在人參和西洋參中的含量很低，大大限制了它的臨床應用。因此，通過合成生物學技術生產人參皂苷已經成為研究熱點。人參皂苷生物合成包含20余步酶促反應。目前，已經從人參屬植物中克隆出20多種與人參皂苷合成相關的基因，并進行了相應的功能驗證：鑒定出兩種鯊烯環化酶——達瑪烯二醇-II合酶（darmmarenediol，DS）和β-香樹素合酶（β-amyrin synthase，AS），它們分別參與了2，3-氧化鯊烯向達瑪烷型和齊墩果烷型人參皂苷的合成過程［79，80］；發現一種細胞色素酶CYP716A47參與了達瑪烯二醇-II向原人參二醇（protopanaxadiol）的轉變［81］。中國科學院上海生命科學院周志華課題組［21］首次鑒定了一個來源于人參的UDP-糖基轉移酶（UGTPg1），通過在酵母中與CYP716A47及其輔酶ATR2-1同時過表達，實現了人參二醇型皂苷CK的從頭合成。周志華課題組與趙宗保團隊的萜類生物合成研究均屬于以中國科學院上海生命科學院趙國屏為首席的“新功能人造生物器件的構建及集成”973項目，該項目在萜類的異源合成上已經取得了多項重要進展。此外，北京理工大學李春課題組在釀酒酵母中將來源于光果甘草的β-香樹素合酶，以及 IDI1、ERG20、ERG9、ERG1等促進2，3-氧化鯊烯合成的酶的基因同時進行過表達，并將表達質粒同源重組到染色體中提高基因表達的穩定性，實現了齊墩果烷型人參皂苷前體β-香樹素的合成。除此之外，該項研究還有兩點重要發現，在表達質粒的啟動子上構建固醇調控元件SRE（-TCGTATA-）是一種有效的上調固醇類蛋白表達的轉錄調控方式；在補料分批培養中，以乙醇作為補料與以葡萄糖作為補料相比，可以顯著提高β-香樹素的合成產量，最終達到138.8 mg/L［82］。

2 展望

萜類化合物的生物功能和藥物活性使其在食品、日化、醫療等領域具有廣泛的應用價值，因此，萜類化合物的高效合成具有廣闊的市場前景。通過對萜類的生物合成途徑的鑒定研究，設計開發出一套組合調控萜類合成途徑的功能模塊，并在底盤細胞中創建合成工廠，可以實現萜類的體外合成。因此，合成生物學的發展為實現微生物發酵生產食用、藥用萜類提供了有力的支撐。

為提高萜類化合物的生物合成效率，實際操作過程中應考慮以下幾個關鍵因素：萜類前體的含量、引入的萜類合酶的亞細胞定位、萜類合酶的活性、萜類合成通路的旁支通路，以及萜類化合物的生物毒性。此外，在“模塊途徑工程策略”快速組裝代謝途徑的基礎上，還可以通過優化前體供給、細胞色素還原酶匹配、宿主選擇、發酵優化等操作，構建高產酵母工程菌株，最終實現目標產物的高效生產。任何一項學科的迅猛發展都不是孤立封閉的，因此，為快速推進合成生物學技術的發展，未來應加強以下幾個學科和技術的應用：（1）結合轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等多種功能組學方法，對現有的生物系統和代謝網絡進行更加全面的了解；（2）通過結構生物學對合成途徑的關鍵元件進行結構解析，了解具體催化機制；（3）通過定向進化和理性設計等蛋白質工程對關鍵酶進行改造，包括提高關鍵酶的活性、增加酶的新功能等；（4）從生物反應動力學角度出發，對合成途徑的元件模塊進行復合體組裝以提高生物反應速率；（5）采用計算生物學技術輔助分析整個代謝系統，通過調整代謝流、抑制旁支通路、解除反饋抑制等手段提高目的產物的生產；（6）利用最新的先進技術如CRISPRi等對底盤細胞進行內源基因的有效敲除及最小基因組的快速構建；（7）借鑒發酵工程多尺度（基因、細胞、反應器）調控策略，在后期發酵過程考慮細胞生長與產物合成之間的平衡，從而實現反應過程的優化放大；（8）借助Amyris等大型合成生物學公司輔助搭建更為成熟、自動化的合成生物學平臺，加速該領域的工業化應用和產品的開發［83］。綜上所述，采用合成生物學策略合成萜類化合物，有望成為植物源萜類生產的有效技術手段。

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（責任編輯 馬鑫）

Research Progresses in the Synthetic Biology of Terpenoids

SUN Li-chao LI Shu-ying WANG Feng-zhong XIN Feng-jiao
（Institute of Food Science and Technology CAAS，Beijing 100193）

The terpenoids represent the largest class of natural products with biological activities of antitumor and anti-allergy，thus they have been widely applied in the area of food，cosmetics and medical health，presenting huge potential and broad market prospects. Recent years，researchers applied functional genomics and metabonomics approaches to deeply study the biosynthesis pathways of terpenoids，providing tons of data for their synthetic biology. The construction of engineered yeasts using synthetic biology enabled the efficient synthesis of multi-target terpenoids，and highly improved the overall production level. Thus，the synthetic biology approach is expected to be an efficient way of producing plant-derived terpenoids. First，we introduced the concept of synthetic biology，summarized the important functions and applications of plant-derived terpenoids，briefly reviewed the biosynthesis pathways，and concluded the alternative production ways. Then，we discussed the design strategies of synthetic biology for terpenoids thoroughly. Finally，we elaborated the advances on the biosynthetic biology of varied terpenes with common terpenes as the studied cases.

terpenoids；biosynthesis；terpene synthesis and design；progresses on synthetic biology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.007

2016-08-29

國家自然科學基金面上項目（31571963）

孫麗超，女，助理研究員，研究方向：生物酶研究與應用；E-mail：sun2004go@163.com

王鳳忠，男，研究員，研究方向：功能食品與生物活性物質；E-mail：wangfengzhong@sina.com辛鳳姣，女，研究員，研究方向：生物酶研究與應用；E-mail：xinfengjiao@caas.cn