谷氨酸棒狀桿菌合成5-氨基乙酰丙酸的途徑構建與發酵優化

饒德明張良程陳久洲孫德虎孫村民鄭小梅鄭平刁愛坡（. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 中國科學院系統微生物工程重點實驗室，天津 300308；3. 中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308）

谷氨酸棒狀桿菌合成5-氨基乙酰丙酸的途徑構建與發酵優化

饒德明1，3張良程1，3陳久洲2，3孫德虎1，3孫村民2，3鄭小梅2，3鄭平2，3刁愛坡1
（1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 中國科學院系統微生物工程重點實驗室，天津 300308；3. 中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308）

5-氨基乙酰丙酸（5-amino levulinic acid，ALA）是生物體內天然存在的一種非蛋白質氨基酸，在農業和醫藥等領域應用廣泛。為了在谷氨酸棒狀桿菌中建立ALA碳四合成途徑并優化其發酵體系，首先在谷氨酸棒狀桿菌中過表達沼澤紅假單胞菌來源的ALA合成酶（ALAS），建立高效的ALA碳四合成途徑，然后從不同發酵培養基的比較、誘導劑和底物甘氨酸的濃度以及初始接種量等不同方面對ALA搖瓶發酵工藝進行了優化。結果顯示，過表達HemA的13032/pZWA1菌株 ALA產量達到1.41 g/L，是對照菌株的67.14倍。ALA的最優搖瓶發酵條件為以酵母粉為氮源的M9培養基，采用5%的接種量0.1 mmol/L IPTG進行HemA的誘導表達，體系中甘氨酸的濃度要控制在4 g/L，搖瓶中ALA產量可達到3.28 g/L，比優化前提高了132.62%。采用發酵優化的條件，在5 L發酵罐的放大發酵中ALA產量可達10.08 g/L，這是現有報道中谷氨酸棒狀桿菌一步發酵合成ALA的最高產量。

5-氨基乙酰丙酸；谷氨酸棒狀桿菌；5-氨基乙酰丙酸合成酶；沼澤紅假單胞菌；發酵優化

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，簡稱ALA）廣泛存在于動物、植物和微生物等所有生物體內，是生物體內四吡咯類化合物（例如，亞鐵血紅素、卟啉、葉綠素和維生素B12）合成的共同前體［1］。ALA在農業［1-3］和醫藥［3-5］領域應用廣泛，以其為主要成分的植物生長促進劑和光敏劑在國內外已被廣泛使用。近些年，以ALA為主要成分的保健食品和化妝品也已上市銷售，此外，ALA還可作為飼料添加劑用于動物飼料領域［6-10］。ALA廣闊的應用前景引起了人們對ALA生產的濃厚興趣，目前國內外已經分別研究建立了采用化學合成法以及生物發酵法合成ALA的工藝路線，但是ALA產業化生產主要通過高成本、高污染［11］和得率低的化學法合成［12］，導致ALA價格昂貴，限制了ALA的市場開發和應用。由于具備清潔廉價的優勢，因此，近年來研究者的目光主要集中在利 用生物發酵法合成ALA的研究和應用中。

生物體內ALA的合成主要有兩條途徑，即由谷氨酸經過三步酶促反應生成ALA的碳五途徑和由ALA合成酶（ALAS）催化琥珀酰輔酶A與甘氨酸反應合成ALA的碳四途徑［1］。由于碳四途徑只涉及一步酶促反應，因此目前通過生物法合成ALA應用最廣泛的方法是利用引入外源ALA合成酶的工程菌，結合發酵工藝的優化實現ALA的大量合成［13］。目前，上述工程菌及代謝工程改造大部分是在遺傳操作系統成熟的大腸桿菌（Escherichia coli）中完成和實現［14，15］。然而，以E.coli為宿主合成氨基酸時會產生內毒素，導致下游提取困難，提高了工業上的成本，限制了其在醫藥食品等領域的應用，這是利用E.coli發酵合成ALA過程中不可避免的問題。

由 于 谷 氨 酸 棒 狀 桿 菌（Corynebacterium glutamicum）本身具有較強的氨基酸合成能力，并且不產生內毒素，因此在發酵工業中C. glutamicum被廣泛用于各種氨基酸和有機酸的生物合成，例如L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸和γ-氨基丁酸等［16］。近年來，利用C. glutamicum為宿主菌合成ALA也取得了一定的進展。Ramzia等［17］在C. glutamicum中共表達碳五途徑關鍵酶的谷氨酰tRNA還原酶（來源于Salmonella typhimurium）和谷氨酸-1-半醛基轉氨酶（來源于E.coli），ALA產量最高可以達到2.2 g/L。Feng等［18］在C. glutamicum中過表達來源于類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）的ALAS，建立了ALA合成的碳四途徑，結合其它多個位點的改造后，工程菌在5 L發酵罐中ALA產量達到7.53 g/L。Yang等［19］通過在C. glutamicum中表達不同來源的ALAS引入碳四途徑，發現不同來源ALAS酶活水平與ALA產量差異較大，琥珀酰輔酶A合成酶編碼基因（sucCD）缺失后，工程菌一步法發酵可使ALA產量達到7.6 g/L，換用菌體生長和產物合成過程分離的兩步法發酵后ALA產量達到14.7 g/L。綜上所述，C. glutamicum中通過碳四途徑的構建可有效提升ALA的積累，并且不同來源ALAS與不同發酵工藝和體系會顯著影響ALA的產量?，F有研究雖然取得了一定的進展，但菌株性能和工藝成熟度與大腸桿菌相比還有一定的差距。兩步法發酵雖然獲得了較高的ALA產量，但同時也增加了菌體收集和培養體系更換的程序，導致發酵工藝復雜，發酵周期延長，難以在實際生產中放大應用。而傳統的補料分批發酵工藝簡單，技術裝備成熟，在實際應用中更容易實現規模化放大，但現有研究缺乏關于利用C. glutamicum作為宿主菌株的合成ALA發酵過程中培養基和發酵工藝優化的報道，導致目前該工藝下ALA產量較低，限制了其進一步的應用。

前期研究中，我們發現沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris ATCC17001） 中 存 在兩種ALAS的同工酶HemA與HemO，兩者比酶活分別是3.6 U/mg和2.7 U/mg，HemA 活力相對較高［20］。本研究選擇將沼澤紅假單胞菌的HemA在C. glutamicum中過表達，構建具有ALA碳四合成途徑的工程菌株，并從發酵培養基的選擇、誘導劑的濃度、底物甘氨酸的濃度以及初始接種量等不同方面對ALA搖瓶發酵工藝進行了優化，并在此基礎上建立5 L ALA發酵放大工藝，旨在為C. glutamicum ALA高產菌株的工業應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DNA聚合酶、DNA marker購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶、DNA連接酶、T4 Polynucleotide Kinase購自Fermentas公司；E.coli質粒提取試劑盒及DNA膠回收試劑盒購自TIANGEN公司；C. glutamicum質粒提取試劑盒購自Solarbio公司；引物合成和基因測序由金唯智公司完成；酵母粉和胰蛋白胨購自英國Oxoid 公司；瓊脂粉、甘氨酸、IPTG和硫酸卡那霉素購自Solarbio公司；5-氨基乙酰丙酸和對二甲氨基苯甲醛等購自Sigma公司；葡萄糖購自濰坊盛泰藥業有限公司；高氯酸購自天津市東方化工廠；冰醋酸和乙酰丙酮購自天津市科密歐化學試劑有限公司。其他生化試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 培養基 LBG培養基：NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖5 g/L。

菌株活化培養基：葡萄糖 20 g/L、玉米漿3 g/L、NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L。

搖瓶發酵培養基：培養基1主要成分是葡萄糖50 g/L、（NH4）2SO410 g/L、MnSO41 g/L、K2HPO41.5 g/L、MgSO40.6 g/L、玉米漿1 g/L、甘氨酸4 g/L、MOPS 31.395 g/L、pH至7.0。培養基2主要成分是Na2HPO4·12H2O 17.1 g/L、KH2PO43 g/L、NH4Cl 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、酵母粉2 g/L、MgSO42 mmol/L、CaCl20.1 mmol/L、葡萄糖50 g/L、甘氨酸 4 g/L、根據需要添加卡那霉素 50 μg/mL。

5 L發酵罐發酵培養基：種子培養基主要成分是Na2HPO4·12H2O 3 g/L、KH2PO43 g/L、NaCl l0.5 g/L、NH4Cl 1 g/L、葡萄糖50 g/L、MgSO41 g/L、CaCl20.1 mmol/L、酵母粉5 g/L、尿素5 g/L、適量微量元素。5 L發酵罐培養基主要成分是酵母粉2 g/L、NH4Cl 5 g/L、KH2PO41.5 g/L、K2HPO4·3H2O 6 g/L、初始葡萄糖80 g/L、適量微量元素及金屬離子。根據需要添加終濃度為50 μg/mL的卡那霉素。

1.1.3 菌株、質粒和引物 本研究中所用的菌株、質粒與引物見表1。

表1 本研究所用的菌株、質粒與引物

1.2 方法

1.2.1 R. palustris ATCC17001 hemA基因表達載體的構建及其在C. glutamicum中表達 根據R. palustris ATCC17001 hemA基因的序列設計引物hemA-F和hemA-R，并分別添加EcoR I和Sma I酶切位點，具體引物序列見表1。以含有目的基因的載體pZZA1為模板，利用引物hemA-F和hemA-R，通過PCR擴增獲得目的片段，酶切后連接pEC-XK99E載體，并將正確重組載體命名為pZWA1。將上述重組載體pZWA1及pEC-XK99E分別轉化C. glutamicum ATCC13032菌株，獲得的工程菌株分別命名為13032/pZWA1和13032/pEC-XK99E。

1.2.2 搖瓶發酵驗證 取100 μL保藏在-80℃甘油管中的菌液接入裝有50 mL菌株活化培養基的500 mL三角瓶中，30℃、220 r/min培養12 h。將種子液按3%（V/V）的接種量，接入裝有50 mL培養基1的500 mL三角瓶中。在30℃、220 r/min 下培養3 h后加入終濃度為0.05 mmol/L的IPTG 誘導培養37 h。發酵過程中分別在12 h和24 h用25%的氨水將發酵液pH調至7.0。

1.2.3 搖瓶發酵優化 （1）培養基成分的優化：利用搖瓶發酵培養基2替代1.2.2中的搖瓶發酵培養基1，其它條件不變。（2）誘導劑濃度的優化：在搖瓶發酵培養基2的基礎上，分別使用終濃度為0.05、0.1、0.3和0.5 mmol/L的IPTG進行誘導，其它條件不變。（3）甘氨酸濃度的優化：在搖瓶發酵培養基2的基礎上，分別將其中的甘氨酸濃度變為0、2、6和8 g/L，利用終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導，其它條件不變。（4）初始接種量的優化：在搖瓶發酵培養基2的基礎上，分別將初始接種量變為3%、5%、7%、10%和15%（V/V），利用終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導，其它條件不變。

1.2.4 5 L發酵罐發酵 將活化后的菌株按1%（V/V）轉接到裝有200 mL種子培養基的2 L三角瓶中，在30℃、220 r/min 培養12-15 h；5 L發酵罐（上海國強生化工程裝備有限公司）裝液量為2 L，初始接種量為1%（V/V），發酵過程溫度控制在30℃，自動流加25%的氨水控制pH在6.5，溶氧維持在20%以上，18 h后pH調至6.0，溶氧調控制在5%以上。發酵初始葡萄糖80 g/L，發酵過程通過流加800 g/L的葡萄糖將葡萄糖濃度控制在5-15 g/L。11 h添加終濃度為0.1 mmol/L的IPTG進行誘導，同時添加4 g/L甘氨酸，此后，分別在23、28和34 h添加4、2和2 g/L甘氨酸。

1.2.5 ALA、甘氨酸與葡萄糖的檢測 ALA的檢測方法參考Mauzerall and Granick［21］。甘氨酸檢測方法：取20 μL離心后的發酵液上清，加入200 μL衍生劑（1% 2，4-二硝基氟苯乙腈溶液）和200 μL衍生緩沖液（50 mmol/L NaHCO3溶液），震蕩混勻后60℃衍生1 h，最后加780 μL的定溶緩沖液（50 mmol/L KH2PO4溶液），震蕩混勻后用孔徑為0.22 μm的無菌濾膜過濾，利用日本島津高效液相色譜儀（HPLC）檢測發酵液中甘氨酸的含量，色譜柱是Agilent HC-C18（2）（USA 4.6×250 mm），流動相A為50 mmol/L乙酸鈉溶液（pH6.4），流動相B為50%乙腈溶液（乙腈溶液∶去離子水=1∶1，V/V）。流速1 mL/min，紫外波長360 nm，柱溫36℃，進樣品20 μL，測樣停留時間為35 min。

葡萄糖分析方法：采用山東省科學院生產的SBA-40D 生物傳感分析儀進行檢測。

1.2.6 ALAS酶活檢測 為了檢測粗酶液中ALAS，將發酵液在4℃下離心收集菌體，加入1 mL buffer（50 mmol/L Tris-HCl 100 mmol/L NaCl pH7.4）洗滌3次，然后加入800 μL相同buffer重懸菌體，最后利用Fast Prep-24（MP Biomedicals，USA）機械震蕩破碎細胞，具體過程參考文獻報道［22］，震蕩破碎的細胞混合液在4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液檢測ALAS比活力。ALAS活性測定參考Burnham等［23］和Zhang等［20］報道的方法ALAS酶活單位U定義為：37℃時，每分鐘內產生1 nmoL ALA 所需的酶量。

2 結果

2.1 R. palustris ATCC17001 ALAS表達菌株的構建

及發酵驗證

本研究在C. glutamicum中過表達來自R. palustris ATCC17001的ALAS編碼基因hemA，構建ALA合成的碳四途徑。通過PCR擴增獲得R. palustris ATCC17001的hemA基因片段，PCR結果（圖1-A）顯示，hemA基因片段長度為1 212 bp，目的條帶大小與預期一致。PCR片段與載體pEC-XK99E連接，構建獲得帶有trc啟動子及相應終止子的目的基因表達盒，轉化子菌落PCR驗證結果（圖1-B）顯示，目的片段大小1 412 bp，1號和3號轉化子條帶大小與預期一致。將上述正確轉化子進行質粒提取和酶切驗證，驗證結果如圖1-C，雙酶切后目的片段大小分別為1 226 bp和7 018 bp，片段大小與預期一致；正確轉化子經過測序驗證后命名為pZWA1。

為了檢測R. palustris ATCC17001來源的ALAS在C. glutamicum中表達后ALA的產量，分別將構建正確的重組載體pZWA1及載體pEC-XK99E轉化C. glutamicum ATCC13032菌株，獲得ALA生產菌株13032/pZWA1和對照菌株13032/pEC-XK99E。首先對ALA生產菌株13032/pZWA1粗酶液中HemA的比活力進行測定，結果表明工程菌中HemA的比活力為37.86 U/mg。為了進一步檢測生產菌株ALA的合成能力，在以玉米漿為有機氮源的無機鹽培養基中對兩種菌株進行搖瓶發酵，發酵結果（圖2）顯示，13032/pZWA1菌株中ALA產量達到1.41 g/L，而對照菌中ALA產量只有0.021 g/L，過表達HemA后ALA產量是對照菌株的67.14倍。表明在C. glutamicum中過表達來自R. palustris ATCC17001的HemA，可使ALA的積累顯著提高。

圖1 重組載體pZWA1構建過程中電泳驗證結果

圖2 R. palustris ATCC17001 HemA表達對C. glutamicum ALA合成的影響

2.2 ALA C. glutamicum生產菌株13032/pZWA1的搖瓶發酵優化

2.2.1 不同發酵培養基的比較 為了獲得生產性能更穩定的發酵培養基，利用ALA生產菌株13032/pZWA1以酵母粉為有機氮源的M9培養基（培養基2）與以玉米漿為有機氮源的無機鹽培養基（培養基1）進行發酵比較，結果如圖3所示。培養基2中菌株OD600值29.8，同時培養基2中ALA產量達到2.13 g/L，比培養基1中ALA產量提高了42.95%。另外，在不同批次的發酵實驗發現培養基2的重復性比培養基1更好，說明培養基2更適合菌株生長和ALA合成。因此，后續采用以酵母粉為氮源的M9培養基發酵優化。

圖3 不同的培養基對 ALA及菌株生長的影響

2.2.2 誘導劑濃度的優化 由于hemA基因的表達使用的是誘導型啟動子trc啟動子，trc啟動子受IPTG誘導，誘導劑IPTG的濃度會影響ALAS的表達。因此設計了4個濃度梯度的IPTG進行ALA的搖瓶發酵，發酵結果（圖4-A）顯示，當IPTG濃度0.1 mmol/L時，ALA產量最優達到2.36 g/L，而當誘導IPTG 濃度是0.05 mmol/L和0.5 mmol/L時，ALA產量分別僅有2.16 g/L和2.15 g/L，說明誘導劑IPTG濃度過低或者過高都不利于ALA積累。 IPTG濃度在0.1-0.5 mmol/L范圍內時對菌株生長沒有明顯影響，因此，后續實驗誘導劑IPTG濃度均采用0.1 mmol/L。

2.2.3 底物甘氨酸濃度的優化 ALA生產菌株13032/pZWA1通過碳四途徑以甘氨酸為底物合成ALA，高濃度甘氨酸對菌株生長有抑制作用，發酵體系中需要控制甘氨酸濃度在一定范圍內。因此，為了測試不同濃度的甘氨酸對ALA產量的影響。發酵結果（圖4-B）顯示，在相對低濃度下，對菌株生長無明顯影響且甘氨酸的濃度與ALA的產量成正比，當甘氨酸濃度至4 g/L時，ALA產量達到最優2.41 g/L，甘氨酸濃度超過4 g/L時，對菌株生長有明顯的抑制，從而降低了ALA的產量，因此，后續發酵體系中甘氨酸的濃度要控制在4 g/L的范圍上。

2.2.4 初始接種量的優化 搖瓶初始接種量對菌體生長和產物積累均有一定的影響。本研究測試了不同的接種量對生產菌株13032/pZWA1的生長與ALA產量的影響，發酵結果如圖4-C所示。當接種量為3%-5%時，菌株的OD600值從25.47增加到31.47，且ALA產量與接種量成正比，但是接種量大于7%時，對菌株OD600值大小影響不明顯；而當接種量大于5%時，隨著接種量的增加ALA產量反而降低。因此，后續搖瓶發酵過程中選擇5%的接種量。

2.2.5 搖瓶發酵體系優化前后的比較 為測試搖瓶發酵體系的優化，本研究對ALA生產菌株13032/pZWA1采用優化前后的不同發酵體系進行了搖瓶發酵。采用優化后的體系（0.1 mmol/L IPTG，4 g/L甘氨酸，5%的接種量的酵母粉M9培養基），搖瓶發酵37 h后，ALA生產菌株13032/pZWA1 OD600值最大達到了29.03，比優化前提高了57.17%，ALA最大產量達到了3.28 g/L，比優化前提高了132.62%（圖4-D）。

圖4 13032/pZWA1的搖瓶發酵優化

2.3 ALA 5 L發酵罐的發酵放大

為了驗證本文優化建立的發酵體系的放大效果和菌株13032/pZWA1合成ALA的潛力，嘗試在可以精確調控pH和溶氧等參數的5 L發酵罐中進行ALA的發酵測試，實驗結果如圖5所示。ALAS在11 h開始誘導表達，同時添加終濃度4 g/L甘氨酸，此后，根據ALA合成及甘氨酸消耗速度分別在適合時間點添加甘氨酸，以維持發酵罐中甘氨酸濃度在一定范圍內。26 h菌株生長進入穩定期，最大OD600達到136。誘導后由于需要先合成ALAS，因此24 h之前ALA合成速度較慢，平均速率只有0.22 g/（L·h）。24 h后進入ALA快速合成期，合成速度明顯加快，ALA平均合成速率達0.52 g/（L·h）。至38 h達到發酵平臺期，最終在40 h時ALA產量達到最大值10.10 g/L。

圖5 5 L發酵罐中13032/pZWA1合成ALA發酵參數檢測

3 討論

本研究首先在C. glutamicum中利用穿梭載體pEC-XK99E過表達了來自R. palustris ATCC17001 HemA的編碼基因hemA，在C. glutamicum中建立了ALA的碳四合成途徑。載體拷貝數及啟動子強度均與之前文獻中ALAS的表達強度相當［18］，工程菌粗酶液中HemA比活力達到了37.86 U/mg，與Yang等［19］報道的來源于Rhodobacter capsulatus SB1003的ALAS比活力基本一致，遠高于文獻提到的其他來源的ALAS，對于充分發揮其催化合成ALA合成的功能具有較大優勢，也為后續構建利用碳四途徑合成ALA的C. glutamicum高產菌提供了有利條件。

玉米漿營養豐富，含有大量可溶性的糖、蛋白質、氨基酸以及多種促進微生物生長的微量元素［24］和生長因子，并且市場上玉米漿價格相對其他的有機氮源較便宜，故人們經常選擇以玉米漿為氮源發酵合成代謝產物。但是玉米漿成分復雜并且保存過程中會大量滋生細菌和霉菌，導致其酸敗和變質，此外玉米漿不均一、易沉淀，在生產上常常遇到滅菌不徹底的問題，所以在優化發酵培養基過程中盡量選擇成分穩定且易保存的氮源。酵母粉含有氨基酸、肽類、維生素、生長因子、微量元素和礦物質等含量豐富比例協調［25］并且易于保存成分穩定，為微生物提供相對較全面的營養物質，可以滿足菌株代謝需求，是微生物菌體培養基與產物發酵培養基中優質的有機氮源，用于各種微生物發酵領域。本研究通過對玉米漿發酵培養基與酵母粉發酵培養基的比較也發現酵母粉發酵培養基的批次重復性更好，并且更適于C. glutamicum ALA生產菌的發酵。

利用碳四途徑合成ALA的前體物之一是甘氨酸。目前，通過微生物發酵合成ALA，甘氨酸主要還是通過外源添加，由于甘氨酸的濃度影響菌株的生長［26］，所以需要合理的控制培養基中甘氨酸的量，既不能影響菌體自身的生長，同時又要供給足夠的甘氨酸以滿足菌株合成ALA的需求。本研究結合文獻報道數據設計了5個不同梯度的甘氨酸濃度進行了優化［26］，研究發現培養基中甘氨酸濃度超過4 g/L會抑制菌株生長，同時ALA產量也會下降，這與Feng等［18］的報道研究結果稍有不同，文獻中提到培養基中添加甘氨酸就會影響菌體生長，甘氨酸濃度越高對菌株生長的影響越大，并且當甘氨酸濃度超過7.5 g/L時，ALA產量會下降。結果差異較大可能與培養基成分和ALAS誘導表達時間以及菌株生長狀態不同有關。由于發酵過程中，甘氨酸是外源添加，增加了成本和工序的繁瑣，未來可以通過對甘氨酸合成途徑進行分析改造，實現甘氨酸體內自身供給。

接種量是影響微生物發酵產酸的重要因素之一，它會直接影響發酵周期。一般情況下接種量少發酵過程中延遲期長，導致發酵成本增加，但初始接種量過大會影響菌體生長狀態和胞內代謝，最終影響產物的產量［27］。本研究通過實驗發現接種量超過7%時，雖然菌株生長差異不顯著，但是ALA產量下降，這可能是由于初始接種量大，菌株在進入穩定期之前就大量消耗了培養基中的營養物質，同時伴隨著菌株次級代謝物積累，導致培養基環境惡劣，菌株的整體活性下降和代謝變弱，從而導致產酸能力下降，最終ALA產量降低。本研究不同初始接種量與ALA產量變化趨勢與文獻報道的［28］實驗結果相似。

綜上所述，本研究通過對搖瓶發酵過程中培養基的篩選以及誘導劑濃度、甘氨酸初始濃度和接種量的優化，最終使得ALA產量達到3.28 g/L，相比優化前提高了132.62%。在優化建立的搖瓶發酵體系的基礎上，利用合適的培養基和發酵工藝在5 L發酵罐中通過補料發酵測試了工程菌13032/pZWA1合成ALA的能力，最終ALA產量達到了10.08 g/L，這是一步法合成ALA文獻報道最高產量。相比較兩步法發酵，一步法發酵在一個反應體系中完成菌體的生長以及產物的合成，避免了兩步法發酵中菌體收集和更換培養體系等過程，周期短，工序簡單，有利于實現大規模工業化生產。同時，本研究建立的一步法發酵合成ALA的過程中底物甘氨酸的轉化率達到了71.08%，高于兩步法的報道，進一步說明菌株構建與發酵工藝優化結合更有利于實現目標產物的過量積累。本實驗發現工程菌在穩定期ALA合成速度是對數期的2.32倍，這可能與HemA的表達有關。對數時期主要是菌株生長，進入穩定期后菌體內HemA表達量增加，更有利于ALA合成。后續工作在工程菌株在代謝途徑優化改造、關建酶的理性設計和優化表達以及系統生物學解析和應用等方面還存在非常大的提升空間。隨著ALA生物合成技術不斷創新和發展，以C. glutamicum為宿主菌的ALA大規模工業化生產具有廣闊的應用價值，本研究為ALA的低成本大規模工業化生產奠定了基礎。

4 結論

本研究在谷氨酸棒狀桿菌中建立了高效的ALA碳四合成途徑，并通過培養基成分及發酵條件的優化建立了相應的搖瓶發酵體系，優化后搖瓶中ALA的產量達到了3.28 g/L，5 L發酵罐中通過補料分批發酵ALA產量達到了10.08 g/L。

致謝：衷心感謝蒲偉老師和吳新陽老師在實驗過程中提供的幫助，特別感謝鄭小梅老師對文章的修改提供寶貴意見。

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（責任編輯 李楠）

Construction of 5-aminolevulinic Acid Synthesis Pathway and Optimization of Fermentation by Corynebacterium glutamicum

RAO De-ming1，3ZHANG Liang-cheng1，3CHEN Jiu-zhou2，3SUN De-hu1，3SUN Cun-min2，3ZHENG Xiao-mei2，3ZHENG Ping2，3DIAO Ai-po1
（1. School of Biological Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308；3. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

5-aminolevulinic acid（ALA）is a natural non-protein amino acid and has been widely applied in agriculture and medicine. This study aimed to construct the systhesis pathway of C4 ALA in Corynebacterium glutamicum and optimize its fermentation process. First，efficient C4 ALA synthesis pathway was established in C. glutamicum by over-expressing the ALA synthase（ALAS）from Rhodopseudomonas palustris. Then，the ALA fermentation process with flask was optimized from four factors：fermentation medium，concentration of inducer，substrate concentration，and initial inoculum dosage. As results，the ALA yield of the strain 13032/pZWA1 over-expressing HemA was 1.41 g/L，up to 67.14 folds compared with the control strain. The optimal ALA fermentation condition was M9 media using yeast extract as nitrogen source with 5% inoculum size，0.1 mmol/L IPTG to induce the experession of HemA，and the concentration of glycine must be at 4 g/L. After optimization，ALA yield reached 3.28 g/L in a shaking flask and increased 132.62% than before. In conclusion，under the optimal fermentation condition，the ALA yield in a 5 L bioreactor fermentation was 10.08 g/L，which was the highest ALA yield by one-step fermentation of C. glutamicum reported so far.

5-aminolevulinic acid；Corynebacterium glutamicum；5-aminolevulinic acid synthetase；Rhodopseudomonas palustris ATCC17001；optimization of fermentation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.017

2016-08-31

天津市科技支撐計劃重點項目（13ZCZDSY04900）

饒德明，男，碩士研究生，研究方向：輕工技術與工程；E-mail：rdm1988@163.com

鄭平，女，博士，研究方向：細菌的代謝工程改造和系統生物學，E-mail：zheng_p@tib.cas.cn；刁愛坡，男，博士，研究方向：細胞生物學，E-mail：diaoaipo@tust.edu.cn